造血器官からの間質細胞の単離

サマリー

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。

要約

シングルセルシーケンシングにより、造血器官の間質における不均一な細胞集団のマッピングが可能になりました。これらの方法論は、定常状態でのこれまで未解決の不均一性、および外因性ストレスまたは老化中に誘発される細胞タイプの表現の変化を研究するためのレンズを提供します。ここでは、マウスとヒトの胸腺、およびマウスの骨と骨髄から高品質の間質細胞集団を単離するための段階的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルで単離された細胞は、高品質のシングルセルマルチオミクスデータセットの生成に適しています。ここでは、サンプル消化、造血系数の枯渇、FACS解析/ソーティングの影響、およびこれらの要因がシングルセルシーケンシングとの適合性にどのように影響するかについて説明します。シーケンシング後の解析における解離の成功と非効率性、および下流の間質細胞収量を示すFACSプロファイルの例を用いて、ユーザーにとって認識可能なポインタを提供します。間質細胞の特定の要件を考慮することは、この分野の知識を進歩させる高品質で再現性のある結果を得るために重要です。

概要

健康な成人では、血液細胞のde novo産生は骨髄と胸腺で起こります。これらの部位にある間質細胞は造血の維持に必須であるが、間質^は組織の1,2,3,4の1%未満を構成する。したがって、間質を支える造血の純粋な分離株を得ることは、特に高品質のサンプルを得るために適切な処理を必要とするシングルセルマルチオミクスにとって、大きな課題となります。異なる消化カクテルの成分は、マルチオミクス解析の特定のステップを妨げる可能性があります^5,6。ここで紹介するプロトコルは、骨髄および胸腺組織からの多種多様な間質細胞の単離を詳述しています。

骨髄と胸腺の両方における間質成分の摂動は、血球の発達に深刻な混乱をもたらし、悪性腫瘍を引き起こす可能性があります^7,8,9。間質を支える造血は、細胞傷害性コンディショニングおよび骨髄移植後に損傷を受け、その結果、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC^{)を維持する}サイトカインおよび成長因子の分泌が減少します2,10,11。さらに、老化は骨髄と胸腺間質細胞に影響を及ぼし、老化した造血表現型に寄与する可能性があります。胸腺は、加齢に伴う広範な退縮を経験する最初の臓器です。脂肪と線維性組織は、思春期の発症という早い時期にT細胞支持間質に置き換わり始めます^12,13。骨髄では、脂肪細胞含有量は年齢とともに増加し、血管および骨内膜のニッチは大幅に再構築されます14,15,16。

複数のストレス状態にわたる造血支持間質の研究を可能にするため、またヒト組織とマウス組織の両方の胸腺の場合、以前に発表された消化プロトコル 1,2,8,17,18 を最適化しました。これらのプロトコルは、細胞の効率的で再現性のある単離を保証し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)やその他のタイプのマルチオミクスと互換性があります。

プロトコル

ヒト組織を用いたすべての研究は、マサチューセッツ総合病院内部審査委員会(IRB)の承認後に実施されました。すべての動物処置は、マサチューセッツ総合病院の動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施されました。本研究では、8-10週齢のC57Bl/6マウス、雄と雌の両方を使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. マウス胸腺組織の調製

1. 以下のバッファーと溶液を調製します。
   1. ミディアム199(M199)と2%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)( 材料の表を参照)。
   2. マウス解離カクテル:0.5 WU/mL Liberase TMおよび6.3 U/mL DNase I、M199 + 2% FBS中( 材料の表を参照)。
   3. M199 と 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)。
      注:FBSを含む培地は、RNAの品質を向上させるためにBSAに切り替えることができます。
2. マウス胸腺解剖を行う
   1. マウスを_CO2 窒息(施設で承認されたプロトコルに従って)で安楽死させ、背中に置きます。70%エタノールをスプレーして胸の毛皮を濡らし、胸腔を開くに進みます。
   2. 最初に胸郭のすぐ下に手術用ハサミで横切開を行い、胸腺を慎重に解剖します。マウスの両側のリブを鎖骨まで切ります。次に、胸壁を解放できるようにダイヤフラムをカットします。一対の鉗子で肋骨を持ち上げて、胸腔を露出させます。
      1. 胸腺は白い二葉性器官で、心臓のすぐ上の空洞の上部に座っています。鉗子で胸腺を保持し、胸腺を所定の位置に保持している結合組織をそっと切断します。解剖した胸腺組織を、M199 + 2% FBSを氷上に添加した6ウェルプレートのウェルに入れます。
         注:老化したマウスや放射線処理されたマウス、または胸腺欠損のある変異株を扱う場合、胸腺が非常に小さいため、臓器を確実に切除するために解剖顕微鏡が必要になることがあります。
   3. 解剖顕微鏡を使用して、鈍端鉗子とマイクロスプリングハサミを使用して胸腺外組織を取り除きます。
3. マウス胸腺組織の酵素解離を行う(10分刻みで30分)
   1. 洗浄した胸腺を15mLチューブのキャップに入れ、滅菌済みの手術用ハサミで組織を細かく刻みます。
      注:消化に使用するチューブのキャップで組織をミンチすると、ある容器から別の容器への移動による組織の損失が最小限に抑えられます。これは、老化したマウスや放射線処理されたマウス、または胸腺欠損のある変異株を扱う場合に非常に重要です。これらの設定では胸腺のサイズが小さいため、可能な限り材料の損失を減らす必要があります。
   2. 2 mLのマウス解離カクテルを15 mLチューブに加え、胸腺片を含むキャップを取り付け、5回反転して組織が解離カクテルに再懸濁するようにします。.
   3. 漏れを防ぐため、チューブのキャップをパラフィンフィルムで包んでください。次に、チューブを37°Cのウォーターバスに水平に置き、250rpmで振とうします。10分間インキュベートします。
      注:消化プロトコルの成功は、37°Cで攪拌しながら行われるインキュベーションに依存します。記載されたプロトコルは、振とう水浴を用いて最適化されています。それが利用できない場合は、加熱された環境での攪拌を可能にする他のアプローチが機能する可能性がありますが、最初にこれらの設定に対してプロトコルを最適化することをお勧めします。
   4. 15mLのチューブをラックに入れ、ティッシュペーパー片を落ち着かせます。上清を慎重に取り除き、70 μmのセルストレーナーにかけ、氷冷した50 mLのチューブに通します。
   5. 手順2〜4を2回繰り返し、合計3ラウンドの消化を行います。組織は、最後のインキュベーションの終わりまでに多かれ少なかれ完全に解離するはずです。
   6. 採取した細胞懸濁液に20mLのM199 + 2%FBSを加えます。500 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
   7. 上清を取り除き、適切な量のM199 + 2%FBSに再懸濁します。その後、細胞カウントに進みます。
      注:再懸濁するM199 + 2% FBSの量は、胸腺の状態によって異なります。6-10週齢のマウスの場合、組織を3-4mLのM199 + 2% FBSに再懸濁することをお勧めします。ただし、老化した組織や放射線処理された組織、または胸腺欠損のある変異株を使用する実験では、胸腺のサイズが小さいため、0.1〜1mLの範囲の低容量が必要になります。
   8. 細胞懸濁液を0.4%(w / v)トリパンブルー溶液で1:2に希釈して細胞をカウントします。細胞を血球計算盤にロードし、明視野顕微鏡でカウントします。未染色細胞をカウントして、ミリリットルあたりの生細胞数と青色染色細胞の数を決定し、サンプルの生存率を評価します。
4. マウス胸腺間質の蛍光活性化細胞選別を行う
   1. 細胞を500 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。 M199 + 2% FBSに25 U/mL Protector RNase阻害剤を添加したM199 + 2% FBSに5 x 10⁷ 細胞/mLの濃度で細胞を再懸濁します( 材料の表を参照)。
   2. マウスFcブロック( 材料表を参照)を2 μg/mLの濃度で添加し、4°Cで10分間インキュベートします。
   3. CD45-PE/Cy7(4 μg/mL)、Ter119-PE(4 μg/mL)、CD31-BUV737(2 μg/mL)、EpCam-BV711(2 μg/mL)( 材料表を参照)を4°Cで30分間、細胞を染色します。
   4. サンプルをM199 + 2% BSAで洗浄し、500 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
   5. 上清を除去し、DAPI(0.5 μg/mL)や7-AAD(1 μg/mL)などの生存率色素を含むM199 + 2% BSA中の細胞を再懸濁します( 材料の表を参照)。確立されたプロトコル¹⁹に従って、胸腺間質細胞のFACS分離に進みます。

2. ヒト胸腺組織の調製

1. 以下のバッファーと溶液を調製します。
   1. ミディアム 199 (M199) と 2% (v/v) FBS。
   2. M199 と 1.5% (w/v) BSA。
   3. ヒト解離カクテル:1 mg/mLコラゲナーゼIVおよび2 mg/mLディスパーゼおよび6.3 U/mL DNase I、M199 +1.5% BSA中( 資料表参照)。
      注:ヒト胸腺組織の調製における最後の消化ステップには、トリプシンが含まれます。したがって、FBSはトリプシン活性を阻害するため、その時点までのすべてのステップはBSA含有バッファーで実施することが不可欠です。
2. ヒト胸腺組織の単離を行う
   1. ヒト胸腺(以前に発表された方法¹⁹に従って採取)を適切な量のM199 + 1.5%BSAに入れ、処理が開始されるまで氷上に保存します。
   2. ヒト胸腺組織を取り扱う際は、組織培養フードで作業を行い、CDCガイドライン²⁰に準拠した標準的な予防措置を用いて、感染の可能性があるかのように取り扱ってください。
   3. ティッシュを10 cmのシャーレに入れ、10 mLの氷冷したM199 + 1.5%BSAを入れます。.滅菌鉗子とはさみを使用して、臓器が抽出されたときに損傷した胸腺外脂肪または組織を慎重に洗い流します。
   4. 手術用ハサミと鉗子を使用して、胸腺を1 cm³ の立方体に切り、10 mLシリンジのプランジャーを使用してピースを優しく押し下げます。これにより、発生中の胸腺細胞の一部が放出され、消化される組織の量が減少します。
      注:胸腺細胞の発達段階のその後の分析が必要な場合は、放出された造血画分を保存します。ただし、この画分を酵素消化中に生成された間質細胞画分と組み合わせないでください。2つの画分をプールすると、細胞懸濁液に詰まりが形成されるリスクが大幅に増加し、最終的に間質細胞の収量が減少することが観察されました。組織を穏やかに粉砕する際に失われる間質細胞はほとんどありません。
3. ヒト胸腺組織の酵素解離を行う(90分、30分刻み)
   1. 軽く砕いた胸腺組織片の約5 mgを50 mLの円錐形チューブのキャップに移します。.次に、滅菌手術用ハサミを使用して組織を細かく切断します。
   2. 8 mLのヒト解離カクテルを50 mLチューブにピペットで入れ、ミンチしたヒト胸腺組織を含むキャップを取り付け、チューブを5回静かに反転させて、すべての組織が酵素カクテルに混ざるようにします。
   3. 漏れを防ぐために、チューブのキャップをパラフィンフィルムで固定します。チューブを振とう(250 rpm)ウォーターバスで37°C、30分間水平にインキュベートします。
   4. 50 mLチューブをラックに入れ、ヒト胸腺組織片を沈殿させてから、上清を取り除き、70 μmのセルストレーナーを介して氷上に置いた新しい50 mLチューブに通します。
   5. 手順2.3.2-1.3.4を繰り返して、人間解離カクテルで合計2ラウンドの消化を行います。
   6. 2回目の消化が完了したら、残りの組織にさらに8 mLのヒト解離カクテルを追加します。.次に、0.25%トリプシン2mLを組織解離チューブにピペットで移します。250 rpmで振とうしながら、37°Cでさらに30分間インキュベートします。
      注:インキュベーション時間が短いと間質細胞の収量が大幅に減少するため、ヒト組織の消化時間が少なくとも90分であることが絶対に必要です。
   7. 最後のインキュベーションステップが完了したら、70 μmの細胞ストレーナーを通過して、前のステップで収集した上清で細胞懸濁液と残りの組織断片をプールします。3 mLのFBSをサンプルに加えて、トリプシン反応を切断し、氷上に置きます。
   8. ステップ1.3で説明したセルのカウントに進みます。
4. ヒト胸腺間質の蛍光活性化細胞選別を行う
   1. ヒト胸腺の細胞懸濁液をスピンダウンし、25 U/mL Protector RNase阻害剤を添加したM199 + 2% FBS中に5 x 10⁷ 細胞/mLの濃度で再懸濁します。
   2. ヒトFcブロック(5 μg/mL)( 材料表を参照)と4°Cで10分間インキュベートします。
   3. CD45-BV711(2.5 μg/mL)、CD235a-BV711(2.5 μg/mL)、Lineage-cocktail-FITC(3.76 μg/mL)、CD66b-FITC(20 μL/100 μL サンプル)、CD8-APC/Cy7(5 μL/100 μL サンプル)、CD4-BV605(5 μL/100 μL サンプル)、CD31-PE/Dazzle594(10 μg/mL)、および EpCam-BV421(2.5 μg/mL)( 材料表を参照)を使用して、サンプルを 4 °C で 30 分間染色します。
   4. サンプルをM199 + 1.5% BSAで洗浄し、500 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
   5. 上清を除去し、DAPI(0.5 μg/mL)や7-AAD(1 μg/mL)などの生存率色素を含むM199 + 1.5% BSA中の細胞を再懸濁します。確立されたプロトコル¹⁹に従って、胸腺間質細胞のFACS分離に進みます。

3. マウスの骨および骨髄組織の調製

注:骨および骨髄画分は、間質細胞の最大純度と組織の最適な解離を得るために、2つの別々の消化反応で調製されます。サンプルは、分解ステップの後にプールして、1つの間質コンパートメントとして選別することができます。

1. 以下のバッファーと溶液を調製します。
   1. M199、2%(v / v)FBS。
   2. マウスB&M(骨および骨髄)解離カクテル:Stemxyme 2 mg / mL、Dispase 1 mg / mLおよび10 U / mL DNase I( 材料の表を参照)M199 + 2%FBS中。
      注:B&M解離ミックスを新鮮に準備し、使用するまで氷上に置いておきます。
   3. M199 と 0.5% (w/v) BSA。
   4. 0.5%(w / v)BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)。
   5. M199 と 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) および 2 mM EDTA。
      注:FBSを含む培地は、RNAの品質を向上させるためにBSAに切り替えることができます。
2. マウスの骨髄分離を行う
   1. CO₂ 窒息によりマウスを安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。70%エタノールをスプレーして毛皮を濡らします。
   2. 大腿骨、脛骨、骨盤、上腕骨を両側から慎重に取り外し、氷上のM199 + 2%FBSを含むウェル^21,22に入れます。
   3. ティッシュワイプですべての筋肉、靭帯、軟骨組織を取り除き、骨への損傷を最小限に抑え、骨膜層を維持します。それらをM199 + 2%FBSの氷上の新しいウェルに入れます。
   4. メスを使用し、長骨の成長板を切り抜いて骨端を取り除き、氷の上にM199 + 2%FBSを入れた10cmの皿に入れます。
   5. 淡い白になるまで骨髄を骨から洗い流します。28 Gの針と10 mL M199 + 2% FBSを充填した10 mLシリンジを使用して、骨髄を氷上の15 mLチューブに洗い流します。洗い流した骨を骨端のある10cmの皿に入れます。
      注:組織を完全に分離するために骨髄を完全に洗い流すことで、より良いサンプル調製が可能になります。
3. マウス骨髄組織の酵素解離を行います(合計30分、10分刻み)
   1. 骨髄がチューブの底に沈むまで、15 mLのチューブを氷の上で直立させておきます。ピペッティングにより、10 mL M199 + 2% FBSをゆっくりと取り出します。
   2. 15 mLのチューブに4 mLのB&M dissociation cocktailを加え、37°Cのウォーターバス(振とうなし)に10分間入れます。
   3. 5分後、チューブを3回反転させ、ウォーターバスに戻します。
   4. 最初の10分後、ペレットが底にあることを確認し、70μmのセルストレーナーでろ過しながら上清を採取し、氷冷した50mLチューブに入れます。残りのBMペレットに2mLの新鮮なB&M解離カクテルを加え、水浴に戻します。
   5. 1mLピペットを使用して激しくピペッティングすることにより、残っている骨髄片を解離します。得られたすべての細胞懸濁液を、前のステップと同じチューブに回収します。回収した細胞懸濁液に20mLのM199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTAを加えます。
      注:ステップ3.3.5では、最終消化サンプルの後に加えられたバッファーには、さらなる酵素活性の阻害を助けるためのEDTAが含まれています。
4. マウス骨髄組織の造血細胞の枯渇を行います。
   1. 細胞を500 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 CD45、Ter119、CD11b、Gr1、B220、およびCD3を標的とするビオチン抗体(5 mg/mL)と共に、PBS + 0.5% BSAの500 μLに再懸濁します( 材料表を参照)。キャップ付きの丸底チューブに移します。
   2. オービタルシェーカーで室温の暗所で10分間インキュベートします。
   3. 磁気ビーズを完全にボルテックスし、チューブに25μLの磁気ビーズを追加します。
   4. オービタルシェーカーで、暗所の室温で5分間インキュベートします。
   5. チューブを対応する磁石に2〜3分間置き、上清を新しいチューブに集めます。
      注:このステップの後、骨髄はプールするか、骨分画から分離しておくことができます。系統の枯渇が成功した場合、結果として得られる細胞懸濁液には赤血球が存在しないはずです。
5. マウスの骨組織の酵素的解離を行います。
   1. 10 cmの皿で骨を細かく砕き、50 mLのチューブの平らなキャップエンドで骨を分割します。上清を70 μmのセルストレーナーでろ過し、フィルター内の骨片を分離します。
      注:あるいは、乳鉢と乳棒を使用して骨の断片化を行うこともできます。ただし、このオプションでは、骨が壊れるのではなく粉砕されると、より多くの破片が生成され、間質細胞の生存率が低下する傾向があります。間質細胞はまだ骨に付着しており、造血細胞を含む上清は廃棄されます。
   2. ハサミを使ってセルストレーナーの骨片を切断します。これにより、表面積が増加し、より効率的な酵素解離が可能になります。5mLのM199 + 2%FBSで骨を洗浄します。
   3. 骨画分を新しい50 mLチューブ内のマウスB&M解離( 材料表を参照)ミックスの5 mLに入れます。.
   4. 漏れを防ぐため、チューブのキャップをパラフィンフィルムで包んでください。次に、チューブを37°Cのウォーターバスに水平に置き、120rpmで30分間振とうします。
   5. 消化後、25 mLのM199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTAを加え、間質細胞を含む上清を70 μmの細胞ストレーナーで氷冷した50 mLチューブにろ過します。
      注:得られた骨片が消化によって目に見えて減少していることを確認してください。.ステップ3.5.5では、最終消化サンプルの後に加えたバッファーに、さらなる酵素活性の阻害を助けるEDTAが含まれています。
6. マウスの骨および骨髄間質の蛍光活性化細胞選別を行います。
   1. 細胞を500 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
   2. PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA中の10 μg/mLの濃度でマウスFcブロックに再懸濁し、4°Cで10分間インキュベートします。
   3. 以下の抗体で細胞(最大1,000万細胞/総染色量100 μL)を染色します:CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL)、Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL)、CD31-BV421 (0.66 μg/mL)、CD140a-APC (2 μg/mL)、Sca1-AF700 (0.66 μg/mL)、CD51-PE (2 μg/mL)、CD105-PE/dazzle (2 μg/mL)( 材料表を参照)。
   4. Calcein-AMを室温まで平衡化し、50 μLのDMSOに再懸濁します。すべての使用のために新鮮な準備を。再懸濁後は室温で保管してください。抗体染色カクテルに再懸濁したサンプル(20 μg/mL)に加える前に、カルセインをPBS(0.1 mg/mL)で事前に希釈し、暗所で4°Cで20〜30分間インキュベートします。
   5. サンプルをPBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTAで洗浄し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   6. 上清を除去し、細胞をPBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTAに再懸濁します。確立されたプロトコル¹⁹に従って、骨および骨髄間質細胞のFACS分離に進みます。

結果

これらのプロトコルは、フローサイトメトリー解析に適した胸腺および骨髄からの再現性のある間質細胞の変種、およびscRNAシーケンシングなどのシングルセルマルチオミクスをもたらします。マウスの胸腺組織は、骨髄移植に先行する細胞傷害性条件付けや自然な老化プロセスなどのストレッサーに応答して、大幅なリモデリングを受けます。その結果、胸腺細胞性はこれらの両方の環境で大幅に減少します(図1A)。8週齢の野生型マウスの胸腺には約1億個の細胞が含まれていますが、2歳マウスの細胞性はその半分であると予想でき、放射線照射と骨髄移植の4日後の胸腺は5,00,000個の細胞まで低くなる可能性があります(図1A)。

細胞傷害性コンディショニングは造血細胞を優先的に切除するため、間質コンパートメントは比例して濃縮されます(図1B)。しかし、全体的に細胞性が低いため、十分な数の胸腺間質細胞を単離することが困難になります。したがって、ダウンストリームのマルチオミクスアプリケーションに適合した細胞数を得るために動物をプールし、可能な限り材料の損失を最小限に抑える必要があるかもしれません。胸腺間質細胞でマルチオミクスを行うには、CD45-Ter119-細胞(図1C)の単一細胞(図1C)の蛍光活性化セルソーティング(FACS)により、ほとんどのストレス条件から十分な数の細胞をソーティングできます。

間質コンパートメントの不均一性を維持するために、通常、単一の陽性間質マーカーで選別するのではなく、造血細胞をゲートアウトします。ポジティブ間質細胞マーカーを含めることは、適切な組織解離が達成されたことを確認するための分析に引き続き推奨されます。しかし、FACS単離は不完全であり、scRNAseqによって決定されるように、選別された細胞の30%〜50%が造血起源のものとなる(図1D、E)。これは、FACSの前にCD45+細胞を磁気的に枯渇させることで改善できます。ただし、胸腺の細胞性が低下している条件(図1A)では、磁気の枯渇に伴う余分な処理に伴う材料の損失により、間質の収量が下流のアプリケーションに対して低すぎるため、これは推奨されません。

ヒト胸腺間質の単離にとって、最も重要なステップは酵素消化です。解離ステップを急ぐと、間質細胞の全体的な収量と間質細胞のサブタイプの表現が大幅に減少します(図2A)。また、造血マーカーを単にゲーティングネガティブにするだけでは実際の間質細胞の放出を測定するのに十分ではないため、組織の消化が最適であることを確認するために、胸腺内皮と上皮のマーカーを常に含めることをお勧めします。これは 図2Aに例示されており、造血マーカーが陰性の細胞の割合は、90分間インキュベートしたサンプルと比較して、30分間消化したサンプルの方が高くなっています。しかし、連続ゲートに見られるように、内皮細胞および上皮細胞の収量は、短い消化プロトコルでは非常に劣ります(図2A)。

マルチオミクスアプリケーションのためのヒト胸腺間質細胞のFACS単離では、汎造血マーカーCD45および赤血球マーカーCD235a(図2B)に加えて、造血系系抗体カクテル、ならびにCD4およびCD8抗体による染色が提案され、間質細胞の濃縮を改善することが提案されます。したがって、胸腺間質のヒトマルチオミクス解析では、生細胞、単一細胞、CD45-CD235a-系統-CD4-CD8-細胞をFACSで選別する必要があります(図2B)。マウスサンプルのscRNAseqで見られるように、これは依然として30%〜50%の造血細胞の汚染をもたらしますが、それでもヒト胸腺間質コンパートメントの許容可能な分解能が得られます(図2C、D)。

骨間質とBM間質については、胸腺組織と同じ戦略が使用されました。間質細胞は、造血マーカーが陰性の細胞にゲーティングすることにより単離され、さらに間質細胞マーカーが消化コントロールとして含まれます(図3)。骨のような石灰化した組織が解離すると、破片が大量に蓄積します。生存率色素としてカルセインを添加すると、この破片のほとんどを排除できるようになり、そうしないと、選別された数が誤って膨らみ、ゲートされた集団の頻度が減少します(図3)。これは、すべての細胞でのゲーティングとCalcein+でのゲーティングのみを比較したFACSプロットに例示されています(図3)。ヒト胸腺間質細胞に見られるように、造血マーカー陰性細胞の割合は、骨およびBM組織の解離効率の信頼できる測定値ではありません(図3)。CD45-Ter119-ゲートは、消化ステップが失敗したサンプルに大量の細胞を含むことができますが、典型的な骨およびBM間質細胞マーカーCD31、CD140a、およびCD51のさらなる分析では、間質の放出が不十分であることが明確に示されています(図3 および 図4)。

マウス骨およびBM間質細胞のFACS単離には、 図3のようにゲーティング戦略を使用することが提案されており、CD45-Ter119-Calcein+のみを選別しますが、選別された集団の前方および側方散乱特性および間質細胞マーカーの発現をモニターして、最適な消化を確保します(図3A)。FACSに先立つ骨髄の造血系系陽性磁気細胞の枯渇と、示されたゲートでのソーティングの組み合わせにより、間質が>90%の細胞のシングルセルシーケンシングが可能となります。このようなscRNA配列ランの例(図5A、B)は、分析された細胞のトランスクリプトームベースのアノテーション後のこの低い造血コンタミネーションを示しています(造血マーカー遺伝子の例図 5C)。これは、移植後の胸腺組織の出発物質が限られているために、選別ステップの前に磁気細胞の枯渇が行われなかった胸腺間質製剤とはまったく対照的です(図1F)。

図1:マウス胸腺間質のフローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシーケンシング解析 (A)8週齢マウス(対照)、4日前に致死放射線を照射して移植した8週齢マウス(移植)、および2歳マウス(老化)の胸腺細胞数の定量化。(B)致死的照射および移植の4日後における間質細胞サブタイプの濃縮を示す代表的なフローサイトメトリープロット。(C)シングルセルマルチオミクス解析のためのマウス胸腺間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(D)間質を示すマウス胸腺のUMAP(青)と造血細胞(赤)。(E)胸腺サンプル中のマウス造血マーカー遺伝子を示すUMAP。(F)胸腺scRNAseqサンプル中のマウス間質細胞および造血細胞の定量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ヒト胸腺間質のフローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシーケンシング解析。 (A)ヒト胸腺間質細胞集団の放出に対する異なる消化時間の影響の代表的な結果を示すFACSプロット。(B)シングルセルマルチオミクス解析のためのヒト胸腺間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(C)間質を示すヒト胸腺のUMAP(青)と造血細胞(赤)。(D)胸腺サンプル中のヒト造血マーカー遺伝子を示すUMAP。(E)胸腺scRNAseqサンプル中のヒト間質細胞および造血細胞の定量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マウス骨髄間質マーカーとカルセインは、解離効率を推定するのに役立ちます。(A)すべての細胞とカルセイン+細胞にゲートしたCD45-Ter119^-マウス骨髄間質細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。その後のCD31^-ゲーティングでは、Calcein+細胞を選択する際にCD140a+CD51+細胞の割合が高いことが示されています。(B)CD140a + CD51 +細胞が欠落している骨消化の失敗を代表するフローサイトメトリー分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:骨髄間質ゲーティング戦略 (A)シングルセルマルチオミクス用のマウス骨髄間質を選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(B)CD140a + CD51 +細胞が欠落している骨髄消化の失敗を代表するフローサイトメトリー分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:間質細胞および造血細胞組成による骨髄シングルセルRNAシーケンシング(A)間質を示すマウスの骨および骨髄のUMAP(青)および造血細胞(赤)。(B)マウスの骨および骨髄サンプルにおける間質細胞および造血細胞の定量化。(C)マウス骨髄サンプル中の造血マーカー遺伝子のUMAP。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

造血器官の間質細胞は正常な血液産生に不可欠であり、造血間質の摂動は造血の維持とストレスに対する応答に深刻な障害をもたらす可能性があります^9,23,24。造血間質細胞への洞察は、血液疾患^7,9,10,24を理解し、それらに対抗する治療法を開発する能力^25,26に不可欠です。しかし、造血間質を実質から再現性よく分離することは、特にシングルセルマルチオミクスの出現により、間質細胞の収量と多様性を最大化しながら高品質のサンプル調製を必要とする課題となっています。ここで説明するプロトコルは、ほとんどのダウンストリームマルチオミクスアプリケーションと互換性を持つように最適化されており、造血間質細胞^1,2,19の単離という課題に対応しています。

造血間質細胞の単離で考慮すべき最初の問題は、解離条件です。組織から間質細胞を放出して間質コンパートメント^1,2の完全な不均一性を反映するためには、最適な解離が重要です。適切な解離ミックスの選択は、実験範囲とダウンストリームプロトコルによって異なります。解離ミックスはできるだけ新鮮に調製し、使用するまで氷上に保管することをお勧めします。ディスパーゼなど、一部の成分は溶解しにくく、ピペット混合に時間がかかる場合があります。ボルテックスは、消化酵素の本来のコンフォメーションを乱し、最終的に消化酵素の不活性化につながる可能性があるため、推奨されません。重要なことに、EDTAは酵素活性を阻害するため、活発な消化ステップでは避けるべきですが、酵素を含むバッファーを迅速に除去できない場合は、反応を止めるために使用できます。酵素混合物自体に加えて、組織の効率的な解離には、(1)表面積を増やすための徹底的な粉砕と切断、および(2)消化酵素との十分なインキュベーション時間という2つのポイントが重要です。例えば、ヒトの胸腺組織はマウス組織よりも解離が著しく困難であり、したがって消化時間は長くなければなりません。ヒト組織に対して調整を行わないと、間質の収量と細胞の種類が減少します(図2A)。解離酵素は、必然的に遺伝子発現に影響を与える37°Cの最適温度を必要とする²⁷。細胞状態を保存するためには、低温または低温の解離が望ましいが、現在、骨と骨髄に適した市販の低温活性解離酵素の組み合わせはない。消化が必要な組織では、異なる細胞タイプから得られる不均一性と寄与の割合は、消化時間、酵素カクテルの組成、および処理によって常に変化します。これらの最初のステップの下流では、選別中のノズルサイズや困難な細胞タイプ(間質由来の脂肪細胞など)の捕捉、流体デバイスチャネルの直径などのろ過ステップにより、不均一性と表現がさらに制限されます。したがって、データセットを比較する際には、これらのプロトコルの違いが部分母集団の表現に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。論理的には、間質系の摂動の影響を測定する際には、処理ステップを等しく保つことに注意する必要があります。

シーケンシングのコストは減少していますが、シングルセルテクノロジーは、解析できる細胞の数によって制限されることがよくあります。各試薬キットの容量を最適化するために、可能な限り造血細胞の磁気破壊が採用されました。これにより、骨髄と胸腺のサンプル画分の両方で間質よりもはるかに多い多数の汚染物質細胞を回避できます。しかし、移植後の胸腺組織の場合のように、出発物質が限られている場合、磁気枯渇戦略が必ず引き起こす細胞の非特異的な損失の増加により、これは望ましくない可能性があります。さらに、組織の調製および消化中に、細胞外マトリックス成分の粉砕、切断、および酵素放出により、大量の破片が生成されます。このタイプの汚染物質は、分析のためにサンプルに残しておくと、下流の処理で目詰まりの問題を引き起こし、シングルセルインデックスのソーティングでウェルが陰性になり、分析で親ゲートの割合が大幅に膨らむ可能性があります。カルセイン染色は、細胞/生細胞に対して陽性をゲートするために使用されました。カルセインにはさまざまな色があり、染色マトリックスに非常に適応性があります。カルセインを取り扱うときは、染料を凍結融解サイクルにさらさないように注意してください(つまり、常に新鮮なものを準備し、溶解後は室温で保管してください)。

DNAオリゴ²⁸ でバーコード化された抗体に基づくサンプルをマルチプレックス化する機能により、10x Genomicsなどのプラットフォームでのシングルセルシーケンシング反応の有用性を高めることができます。サンプルマルチプレックス用に設計されたハッシュタグ付け抗体は、細胞表面分子または核膜およびマウスとヒトの両方で異なるターゲットを備えています。細胞ハッシュタグシステムは複数の組織で成功裏に使用されてきましたが、消化酵素ミックスとその後のハッシュタグの使用を組み合わせた実験では、回復率が大幅に低下する可能性があります。解離後に追加の洗浄ステップを含めることを試み、消化酵素の活性を阻害するためにEDTAを追加しました。ただし、これらの手順を実行しても、造血細胞よりもハッシュタグの同定が少なくなることが予想されます。酵素消化プロトコルでは、ハッシュタグの捕捉率は30%〜70%であることがわかりました。これは、同じ集団の間質細胞の>90%を標識した蛍光色素コンジュゲートを持つ同じ抗体クローンが存在するという事実にもかかわらず発生します。組織の酵素消化とハッシュタグ付けを組み合わせた実験デザインは、試験的に実施し、酵素阻害を確実にするために注意を払う必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200-072
7AAD (7-アミノアクチノマイシン D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A9647
C57Bl/6 マウス	ジャクソン	664	男性または女性、8-12生後数週間
のカルセイン	フィッシャーサイエンティフィック	65-0853-78
コラゲナーゼIV	ミリポアシグマ	C5138
コーニング滅菌細胞ストレーナー、白、メッシュサイズ:70&マイクロ;m	フィッシャーサイエンティフィック	08-771-2
ディスパーゼ II	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17105041
DNA I ソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	90083	2500 U/mL
Easysep マウス ストレプトアビジン RapidSpheres アイソレーション キット	StemCell Technologies	19860
胎児ウシ血清	Gibco	A31605-01	ワンショット
ヒト FC ブロック	BD バイオサイエンス	564220
リベラーゼ TM	ミリポアシグマ	5401127001	研究グレード
ミディアム 199	Gibco	12350
マウス抗ヒト CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
マウス抗ヒト CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
マウス抗ヒト CD45-BV77	Biolegend	304050
抗ヒト CD4-BV605	BDBiosciences	562658
マウス抗ヒト CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
マウス抗ヒト CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
マウス抗ヒト EpCam-BV421	Biolegend	324220
プロテクター RNase 阻害剤	ミリポアシグマ	3335402001
ラット抗マウス CD105-PE /dazzle594	バイオレジェンド	120424
ラット抗マウス CD11b-ビオチン	バイオレジェンド	101204
ラット抗マウス CD140a-APC	フィッシャーサイエンティフィック	17-1401-81
ラット抗マウス CD16/CD32 (マウスBD FC ブロック)	BD バイオサイエンス	553142
ラット抗マウス CD31-BUV737	BD バイオサイエンス	612802
ラット抗マウス CD31-BV421	バイオレジェンド	102424
ラット抗マウスCD3-ビオチン	バイオレジェンド	100244
ラット抗マウスCD45.2-ビオチン	バイオレジェンド	109804
ラット抗マウスCD45-PE/Cy7	レジェンド	103114
ラット抗マウスCD45-PE/Cy7	バイオレジェンド	103114
ラット抗マウスCD45R/B220-ビオチン	バイオレジェンド	103204
ラット抗マウスCD51-PE	バイオレジェン	ド104106
ラット抗マウス EpCam-BV711	BDバイオサイエンス563134
ラット抗マウス Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	バイオレジェン	108142
ラット抗マウス Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-ビオチン	バイオレジェンド	108404
ラット抗マウスTer119-ビオチン	バイオレジェンド	116204
ラット抗マウスTer119-PE	バイオレジェンド	116208
ラット抗マウスTer119-PE/Cy7	バイオレジェンド	116222
ステムキシム	ワージントン生化学	LS004107