方法論記事

マウス左肺ヒラークランプモデル 肺虚血再灌流損傷

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DOI:

10.3791/66232

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2024年4月12日

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

この記事について

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サマリー

このプロトコルは、マウスモデルにおける肺虚血再灌流障害の研究に使用できる、実現可能で信頼性が高く、再現性のある左肺門結灌法の概要を示しています。

要約

肺移植中の虚血再灌流障害(IRI)は、移植後合併症の主要な危険因子です。これには、原発性移植片の機能障害、急性および慢性の拒絶反応、および死亡率が含まれます。IRIの基盤を研究する努力は、左肺肺門クランプの信頼性と再現性のあるマウスモデルの開発につながりました。このモデルには、麻酔をかけられ挿管されたマウスで行われる外科的処置が含まれます。左開胸術が行われ、続いて慎重な肺動員と左肺肺門の解剖が行われます。肺門クランプは、スリップノットによる肺門の可逆的な縫合結紮を含み、動脈の流入、静脈の流出、および左主幹気管支を通る空気の流れを止めます。再灌流は、縫合糸を慎重に除去することによって開始されます。当研究室では、現在の研究において、実験モデルに30分間の虚血と1時間の再灌流を用いています。ただし、これらの期間は、特定の実験問題に応じて変更できます。犠牲の直前に、右肺門クランプの4分間後に左心室から動脈血ガスを採取して、得られたPaO2 値が負傷した左肺のみに起因することを確認できます。また、フローサイトメトリーを使用して細胞外漏出を測定する方法についても説明します。これには、犠牲になる前に研究対象の細胞に特異的な蛍光色素標識抗体の静脈内注射が含まれます。その後、左肺を採取して、フローサイトメトリー、凍結または固定、パラフィン包埋免疫組織化学、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うことができます。この肺門クランプ技術により、IRIの根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な研究が可能になります。代表的な結果は、肺門クランプ後の左肺の酸素化の減少と肺損傷の組織学的証拠を明らかにしています。この技術は、顕微手術の経験の有無にかかわらず、担当者が容易に習得および再現できるため、信頼性が高く一貫した結果が得られ、肺 IRI の研究に広く採用されているモデルとして機能します。

概要

臓器移植中のIRIは、原発性移植片機能障害およびその後の移植片拒絶反応のエピソードの主要な危険因子である1,2。移植中、温虚血時間は、ドナーの大動脈クロスクランプから冷灌流の開始までの期間、および氷からの臓器摘出から臓器移植までの期間として定義されます。冷蔵保存時間は、冷灌流の開始から臓器の氷からの除去までの期間として定義されます3。温性虚血は、冷性虚血4,5,6よりも後の臓器機能にとってより有害であり、その根底にあるメカニズムは、前臨床モデルでのさらなる研究を必要とします。さらに、心臓死後の臓器提供(DCD)による臓器移植は、従来の脳死後(DBD)の提供よりも温存性虚血期間が長くなります7。DCDドナーの使用はドナープールを拡大し、肺の利用を増やすことができますが、移植後の肺機能に対する温虚血の影響を評価するためのさらなる前臨床研究が必要です。以下では、左肺門クランプを介したマウスの温性IRIのモデルについて説明します。

肺肺門クランプのいくつかの動物モデルが過去数年間に開発され、適応されており、非外傷性微小血管クランプ8,9,10,11,12,13、ルメル止血帯14,15、または縫合結紮16の使用を含むことができるヒラークランプとして。肺門クランプの核心は、再灌流を達成するためには、可逆的であり、肺門構造への損傷が最小限またはまったくない必要があるということです。ここでは、スリップノットで左肺門を可逆的に縫合するマウスの門クランプ技術について説明します。この方法は、肺動脈の流入、静脈の流出、および主幹気管支に出入りする気流を閉塞します。血管クランプ、クリップ、または止血帯にスリップノットを使用する主な利点は、長期間の虚血中に胸を閉じることができるため、マウスの感覚不良な体液と熱損失を最小限に抑えることができることです。信頼性の高い動脈血ガス(ABG)測定値を取得し、肺門クランプ後の細胞外漏出を測定するためのプロトコルを提供します。

この肺門クランプ技術は、肺移植の広範な研究において重要な位置を占めています。同所性肺移植の小動物モデルと比較して、肺門クランプ技術は、外科的吻合部外傷または同種誘発性17を追加せずにIRIの影響を分離することができる。さらに、肺門クランプ技術は、マウスの肺移植よりも簡単かつ迅速に習得できます。実際、肺門クランプ技術を使用して、過去 10 年間で、TLR4、NADPH オキシダーゼ、アデノシン A2A 受容体 14,18,19,20 など、IRI の病因におけるいくつかの重要なメカニズムが特定されています。次のプロトコルでは、肺 IRI を研究するためのツールとして、信頼性が高く、教えやすく、再現性のある肺門クランプの方法を紹介します。

プロトコル

すべての研究は、ワシントン大学医学部の動物管理・使用委員会によって承認された。動物は、全米科学アカデミーが作成し、国立衛生研究所が発行した「実験動物の世話と使用に関するガイド」第8版 第21 号、および全米医学研究会が策定した「実験動物ケアの原則」に従って人道的なケアを受けました。

1.麻酔と挿管

  1. 重量が25g以上のマウスを選択します。これにより、声帯間の開口部が大きいため、挿管が容易になります。
  2. ケタミン(用量100 mg / kg体重)とキシラジン(用量10 mg / kg体重)の混合物をマウス腹腔内注射します。.この混合物は、1/2インチの29G針で1/2ccシリンジにロードする必要があります。ケタミンが効くまで約5分待ちます - マウスは自発的な動きを示さず、つま先のつま先をつまむことに反応しないため、適切な麻酔が確認されます。
  3. 追加の痛み管理のために、手術前にブプレノルフィン(用量0.05 mg / kg体重)を皮下に注射します。.
  4. 手術中の角膜の乾燥を避けるために、非薬用眼科用軟膏を両目に塗布します。.
  5. 左胸と背中にクリッパーでマウスを剃り( 図1Aを参照)、開腹術が計画されている場合は腹部まで伸ばします(手順5.3を参照)。
  6. マウスに麻酔をかけたら、お好みの挿管セットアップを使用して挿管を行い、残りの手順を~37°Cの温めたマットの顕微鏡下で行います(マウスの常温を維持するため)。
  7. 声帯の適切な視界を達成した後、端にカーブがある自家製のイントロデューサー( 補足図1を参照)を、気管内チューブ(ETT)として使用される1インチの20G血管カテーテルに挿入します。イントロデューサーの先端をガイドし、次にETTを声帯の間と声帯を通り過ぎます。
    注:食道への誤った挿管を避けるために、ETTが声帯を通過することを視覚化することが重要です。挿管中に声帯が損傷しないように注意する必要があります(つまり、挿管の試行回数は5回に制限し、抵抗が満たされた場合はETTを進めないでください)。.
  8. ETTを挿入したら、イントロデューサーを取り外し、ETTを小動物の人工呼吸器に接続します。対称的な胸部の上昇を観察して、正しい気管内挿管を確認します。人工呼吸器の設定は、毎分100〜105回の呼吸と吸気酸素の割合100%である必要があります。一回換気量は0.35mLで、呼気終末陽圧は1cmH2Oです。
    注:偶発的な食道挿管は、すぐに修正しないと死に至るため、腹部ではなく胸部が上昇していることを確認してください。
  9. 所定の位置にあることを確認したら、マウスの鼻の周りに5 cmの1インチのシルクテープでETTを固定し、ETTが口から滑り落ちないようにETTと鼻に十分に接触するようにします( 図1B-Cを参照)。
  10. 手術中も適切な麻酔を維持するために、酸素の流れに合わせて1%〜1.5%のイソフルランを投与します。

2.開胸術

  1. マウスを右横褥瘡の位置に配置し、両方の前足を左上隅にテープで固定し、右後足を左下隅にテープで固定し、左後足を右下隅にテープで固定します(テーピングについては 図2G を参照)。
  2. ポビドンヨードを少なくとも3回交互に繰り返し、その後70%のアルコールを塗布して、左胸の上の皮膚で消毒します。.
  3. ハサミを使用して、前腋窩線から後腋窩線までの4番目の 肋間腔を切開し、ハサミを使用して上にある皮膚を開きます( 図2Aを参照)。第4肋間腔 は、腋窩中部の腋窩から約1cm下に位置する。
  4. 失血を最小限に抑えるには、ハンドヘルド焼灼ペンを使用して、皮下層と筋肉層内の目に見える血管を凝固させます。
  5. 広背筋と前鋸筋を、皮膚切開の長さに沿ってハサミを使用して鋭く分割します( 図2Bを参照)。
  6. 細かい湾曲した鉗子を使用して、4番目の肋骨を慎重に持ち上げ(下にある肺を傷つけないように注意してください)、5番目の肋骨のすぐ上に細いハサミでピンポイントの切り込みを入れて、4番目の肋間腔に入ります(図2Cを参照)。開胸術は、肋間神経血管束の損傷を避けるために、4番目の肋骨の下ではなく5番目の肋骨の上で行ってください。
  7. 陰性胸膜腔圧が失われ、肺が胸壁から離れたら、開胸術を5番目の肋骨のすぐ上の4番目の肋間腔で前方および後方に延長します(図2D-Eを参照)。切開部の全長は、肺全体が露出するのに十分な長さ (通常は ~ 1 cm) である必要があります。
    注:開胸術が前方に伸びすぎると、内乳動脈の出血が発生する可能性があります-遭遇した場合は、過度の失血を避けるためにこれを焼灼する必要があります。
  8. 2つのリブリトラクターを適用してリブスペースを広げ、適切な視覚化のために少なくとも1cm2の作業ウィンドウを確保します(図2F-Gを参照)。

3. hilarクランプの適用

  1. 先端が 2 つに尖った綿のアプリケーターを使用して、左肺を頭側に持ち上げ、半透明の下肺靭帯を鈍く分割して左肺を動かします (図 3A-B を参照)。
    注:肺を引き裂かずにこれを行うのが難しい場合は、下肺靭帯を細いハサミを使用して鋭く分割することもできます。
  2. 肺を前方に反射させて、左肺門後部を視覚化できるようにします。6-0 シルク タイを ~10 cm にカットし、このネクタイの中点を門の後に配置します ( 図 3C を参照)。
  3. 次に、左肺を後方にひっくり返してネクタイの上に置き、ネクタイの両端を前方に引っ張ります( 図3Dを参照)。
  4. ネクタイの2つの自由端(AとB)を使用して、鉗子と湾曲した蚊クランプを備えたリバーシブルスリップノットを計器結びにします。詳細な説明については、ステップ 3.4.1 と 3.4.2 を参照してください。暖かい虚血性時間は、スリップノットを結ぶことから始まります。結び目が結ばれると、人工呼吸器が息をするたびに左肺が膨らむことはなくなります。淡い白になり、灌流が停止することを意味します。
    注:結び目が門の中央にあることを確認し、誤って左心房の中央と肺実質を横方向に引っ掛けないように注意する必要があります( 図3Fを参照)。
    1. clでamp 利き手にあり、鉗子を非利き手にあり、Aの端を鉗子で保持し、閉じたclamp ( 図3Eを参照)にAの中点を1回ループします。
    2. Bの中点をクランプでつかみ、両手で引っ張ってスリップノットを締めます。Bの端が結び目を引っ張ると、結び目が元に戻せなくなるので、注意してください。結び目を結んだ後、Bは結び目から発せられるループを持ち、Aはまっすぐである必要があります( 図3Fを参照)。Bの端を引っ張ることで結び目を外すことができます。
  5. ETTから人工呼吸器への流出チューブを手動で閉塞することにより、気管支の適切な閉塞を確認します。これにより、左肺が膨張しないはずです( 図3Gを参照)。血管閉塞は、軟骨性気管支と比較して肺動脈と静脈の崩壊性が高いことを考えると、気管支閉塞で想定されます。
  6. 肺門クランプを適用した後、6-0ナイロン縫合糸を使用して1つの簡単な中断ステッチで皮膚切開部を閉じ、温かい虚血の期間中の感覚的な体液損失を最小限に抑えます。

4.ヒラクランプのリリース

  1. 温かい虚血の望ましい期間の後、シルクネクタイの短い自由端を静かに引っ張ってスリップノットを解放します( 図3F のBとステップ3.4)。スリップノットの解除時に再灌流時間を開始します。
    注:ネクタイの解除後、肺の換気は、ETTの流出を再び手動で閉塞することで確認でき、これにより左肺が拡張するはずです。繰り返しになりますが、灌流は肺の膨張を伴いますが、肺がピンキングアップすることでも確認できます( 図4Aを参照)。
  2. 再灌流期間中は、胸部を3層に閉じて、無感覚な損失を最小限に抑えます。まず、6-0ナイロン縫合糸で4本目の肋骨のスペースを1針縫い、4本目の肋骨のすぐ上に1本、6本目の肋骨のすぐ上に1本咬合します(図4B-Cを参照)。これを最大肺膨張で結び付けて、医原性気胸のリスクを最小限に抑えます(図4D-Eを参照)。
  3. 次に、6-0ナイロン縫合糸による簡単なランニングステッチを使用して筋肉層を閉じます。
  4. 最後に、6-0ナイロン縫合糸による単純な中断ステッチで皮膚切開を閉じます( 図4Fを参照)。目を覚ましている動物が切開部をつまみ、完全な創傷裂開につながるリスクがあるため、皮膚に縫い目を走らせることは避けてください。
  5. この時点から、所望の再灌流時間の終了時に肺を直接採取することができる。ABG評価が必要な場合は、ステップ5を参照してください。犠牲の前に追加の静脈内注射が必要な場合は、ステップ6を参照してください。.これは末期手術です。
  6. 再灌流時間が数時間を超えることを意図している場合は、イソフルランをオフにして、マウスが麻酔から目覚めて抜管できるようにします。抜管の基準には、足をつまむことによるけいれんや、自発的な呼吸と動きが含まれます。マウスをケタミンとイソフルラン麻酔から目覚めさせるには、通常30〜45分かかります。これはサバイバル手術です。
    1. サバイバル手術では、手術による体液の損失を考慮して、1 mLの温かい生理食塩水を皮下に注入します。痛みをコントロールするために、手術前にブプレノルフィン(用量0.05〜0.1 mg / kg体重)を皮下に注射します。.手術後少なくとも3日間は、4〜6時間ごとに麻酔を繰り返します。追加の痛みのコントロールのために、切開部に沿ってブピバカインブロックを検討してください。

5. ABG評価

注:ABG測定が必要な場合、これは左心室からの動脈血吸引によって最もよく得られます。ABGが左肺機能のみを反映していることを確認するためには、この動脈血は、右肺がクランプされてから約4分後に採取されるべきであり、22,23、その間、左肺のみが酸素化と換気を行っている。

  1. マウスが肺門クランプ後に麻酔から目覚めた場合は、ステップ1に従ってマウスを再麻酔して挿管します。.
  2. 所望の再灌流時間が終了する約15〜20分前に、マウス仰臥位を位置決めし、4つの肢すべてをテープで固定します。
    注:再 ?? 流が終了する前に、次の手順を実行するために十分な時間を割り当てる必要があります。.腹部と胸部を開く具体的なタイミングは、外科医とその経験によって異なります。
  3. 恥骨から剣状骨まで正中線開腹術を行い、ハサミで皮膚を切開し、続いて白筋に沿って腹壁を切開します(図5A-Bを参照)。
  4. 剣状突起では、開腹術を左右に伸ばし、最も下肋骨の曲線に沿って前腋窩線まで伸ばします( 図5Cを参照)。
  5. 腹部から、心臓を傷つけないように深く入りすぎないように注意しながら、正中線の前横隔膜を切開して胸部に入ります(図5D-Eを参照)。次に、前横隔膜切開部を左右に伸ばし、最も下の肋骨に沿って前腋窩線まで伸ばします(図5Dの白い点線を参照)。
  6. 両側の肋骨を前腋窩線に沿って分割し、腋窩に向かって上向きに伸ばし、クラムシェル開胸術を作成します。次に、胸部前壁(胸骨と両側の前肋骨)を反射し、心臓と両側の肺を完全に露出させることができます( 図5Fの白い点線を参照)。
  7. 胸部前壁にクランプを取り付け、セファラッドを反転させて収縮を容易にします。正中線で湾曲した蚊クランプを使用して横隔膜を下方向に引っ込めて、胸部の視覚化を改善します( 図5Fを参照)。
  8. 右肺(4つの葉がある)を完全に動かすには、左胸部の正中線を超えて伸びている副葉を右胸に戻します(図5G-Hを参照)。この葉を左胸部に取り付けている細い靭帯があります-これを綿の先端のアプリケーターで鈍く分割するか、はさみで鋭く分割します。
    注:このアクセサリーローブは、下大静脈(IVC)の後方の正中線を横切るため、この操作中にIVCを傷つけないように注意する必要があります。
  9. すべての葉が右胸に戻ったら、右肺全体を前方に反射させ、別の6-0シルクタイ(~10cmにカット)を右膝の後方に置きます。次に、右肺をネクタイの上で胸に戻します。
  10. ステップ3.4で説明したのと同じ手法を使用して、右肺の4つの葉すべてを囲むように注意しながら、右肺の周りに別のスリップノットを結びます。この右肺門クランプステップは、再灌流が終了する約4分前にタイミングを合わせる必要があります。
  11. 1 ccのツベルクリンシリンジに1/2インチの31G針を約200 μLのヘパリン1000 unit/mLでコーティングします。これを行うには、ヘパリンの量を引き上げ、プランジャーを前後に3〜4回繰り返し引いて、ヘパリンがシリンジの内側全体をコーティングできるようにします。これは、手術ステーションからABGマシンへの輸送中に吸引血液が凝固するリスクを最小限に抑えるために行われます。
  12. 右肺門クランプの4分後、左心室から動脈血をヘパリンコーティング注射器に吸引します(図5Iを参照)。心室中隔に穴を開けたり、誤って静脈右心室血を吸引したりしないように注意してください。暗い右心室と明るい左心室の間には明確な色の違いがあります(図5I挿入図を参照)。針を左首に向けて角度をつけます。ABG (~150 μL) を実行するのに十分な血液を得るためには、複数回の穿刺が必要になる場合があります。
    注:右肺門クランプの4分間の間に、マウスは苦痛な呼吸を示し始め、それが差し迫った死を告げることがあります。これが発生した場合、心停止の前に動脈血を迅速に吸引する必要があります。.鼓動していない心臓から血液を吸引することはできません。
  13. ABGマシンで動脈血を流して、酸素飽和度、酸素の分圧、二酸化炭素の分圧などの測定値を取得します。ABG採取および/または抗体治療後にマウスを安楽死させます(ステップ6を参照)。

6. 細胞外漏出測定のための抗体静脈注射

注:この技術は、以前に発表された18のように、犠牲に先立ってIVCに蛍光色素標識抗体を静脈内注射し、その後フローサイトメトリー分析を行うことにより、細胞の血管外漏出を決定するために使用することができます。簡単に言えば、血管内好中球は、好中球特異的抗Ly6G抗体を使用して間質性好中球と区別できます。フルオレセインイソチオシアネート標識(FITC標識)抗Ly6G(クローン1A8)は、犠牲の5分前に静脈内注射され、循環血管内好中球を標識します。使用したFITC-Ly6G抗体の濃度は、200 μLのリン酸緩衝生理食塩水で100 ngに希釈したものです。次に、フローサイトメトリーのために左肺からの単一細胞懸濁液を調製した後、すべての好中球をアロフィコシアニン標識(APC標識)抗Ly6G(クローン1A8)で標識します。したがって、APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ 好中球は血管内であり、APC-Ly6G+FITC-Ly6G- は血管外または間質性です。この技術は、例えば、抗Ly6C抗体を有する単球、抗CD19抗体を有するB細胞などに適用することができます。

  1. 目的の抗体を5/16インチ31G針付きの3/10ccシリンジにロードし、シリンジ内の気泡を最小限に抑えるように注意してください。ステップ6.5でIVCへの静脈内注射に使用します。.
  2. 手順5.3〜5.4に従って開腹術を行います。
  3. 開腹術後、2つの先のとがった綿の先端のアプリケーターを使用して、右内側内臓の回転を鈍く行います。マウスでは、これは腹部の左側にあるすべての腸を内臓を抜くことによって行われ、IVCがはっきりと見えるようになります( 図6Aを参照)。
  4. IVCの上にある脂肪を綿の先端のアプリケーターで鈍く取り除きます。
  5. 静脈穿刺を介して抗体溶液をIVCに注入します( 図6Bを参照)。針を抜いたら、すぐに綿棒で静脈穿刺部位に穏やかな圧力をかけます(通常約2〜3分)。
  6. 内臓を抜いた腸を綿棒で腹部に戻し、IVCに圧力をかけ続けます( 図6Cを参照)。
  7. ステップ5.5-5.7に従ってクラムシェル開胸術を行い、左肺を採取します。抗体が全身循環するのに少なくとも5分間置いてから、犠牲にして採取します。ABG収集および/または抗体治療後にマウスを安楽死させます。

7. 組織学(H&E)染色

  1. ホルマリン固定と左肺のパラフィン包埋、および厚さ5μmへの切片化に続いて、スライドをキシレンで脱パラフィンします(10分間の洗浄を2回)。
  2. シーケンシャルエタノール洗浄での脱水:100%で2分洗浄を2回、95%で2分洗浄を1回、70%エタノールで2分洗浄を1回行えます。その後、脱イオン水ですすいでください。
  3. スライドをヘマトキシリンで2〜4分間染色し、その後、脱イオン水で5分間、または透明になるまで洗浄します。ヘマトキシリン染色の正確な持続時間は、組織と望ましい核染色強度に合わせて最適化する必要があります。
  4. 染色物を区別するために定義溶液で30秒間洗浄した後、水で2分間洗浄します。青色の形成液で30秒間洗浄した後、水で2分間洗浄します。
  5. 95%エタノール15xに浸してさらに脱水します。エオシンで1分間染色します。
  6. 2分間のエタノール洗浄(2x)で脱水し、続いて2分間のキシレン洗浄(2x)で脱水します。封入剤を塗布し、カバースリップを貼る。

結果

左肺門クランプ後、左肺に起因する動脈血中の酸素化の分圧 (PaO2) は ~100 mmHg であり、偽開胸術後の ~500 mmHg と比較して大幅に低くなっています (図 7A、n=6-7)。注目すべきは、B6マウスで偽開胸術が行われ、右肺門クランプの4分後にABG測定が行われ、左肺のみに起因する値を表していることです。肺門クランプ左肺のH&E染色では、赤血球による気道と血管の充血を満たす炎症細胞の浸潤が示されましたが、これらの所見はナイーブな左肺には見られません(図7B、n = 2)。これらの結果は、虚血と再灌流の期間に続く即時の組織損傷と細胞浸潤を示しています。

ステップ6で述べたように、犠牲の5分前にFITC標識抗Ly6G抗体を静脈内注射することで血管内好中球と間質性好中球を区別し、続いてすべての好中球をAPC-Ly6G抗体で標識することで鑑別できる18,24。代表的なプロットは、左肺の肺門クランプ後(図7C、n = 4)、好中球の~75%が血管内(APC-Ly6G + FITC-Ly6G +)であり、~25%が間質性(APC-Ly6G + FITC-Ly6G-)であることを示しています。これらの結果は、好中球の血管外漏出を評価する信頼性の高い方法を示しており、使用する抗体(単球には抗Ly6C、B細胞には抗CD19)に応じて他の細胞タイプにも適応できます。この手法は、IRI後の細胞動態の研究に役立ちます。

figure-results-1
図1:マウスの挿管。 (A)左胸部と腹部を剃ったマウス。(B)人工呼吸器チューブに接続された気管内チューブ。(C)挿管が確認されたら、チューブをマウスの鼻に周囲にテープで固定します。(D)小動物用人工呼吸器との間の流入および流出チューブを備えた挿管されたマウス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:左開胸術 (A)第4肋 間腔(ICS)上の皮膚切開。(B)4番目の 肋間腔に分割された筋肉層。(C)5番目の 肋骨のすぐ上に小さな切開を行います。(D) 4番目の ICS で切開を前方および後方に延長する。(E) 4番目の ICS で視覚化された肺。(F-G)リブリトラクターが配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:左肺門クランプ (A)綿棒で動員された左肺。(B) 下肺靭帯 (IPL) の視覚化。(C)左肺を前方に反転させた状態で、シルクタイをヒルムの後方に配置します。(D)シルクタイの上で左を後方に反転させると、前門が視覚化されます。(E)左のヒルムにスリップノットを合わせた楽器のタイ。(F)ヒルムのスリップノット。(G)流出を手動で閉塞すると、左肺は膨らまず、肺門クランプが成功したことを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:左肺門クランプの解除と左胸部閉鎖 (A) スリップノットを離すと、左肺が再び膨らみます。(B)4番目の 肋骨のすぐ上に1つの咬傷、および(C)6番目の 肋骨のすぐ上に1つの咬傷を伴う肋骨の閉鎖。(D-E)胸はエンドインスピレーションで結ばれた1針で閉じられています。(F)断続縫合による皮膚閉鎖(ランニングステッチによる筋肉層閉鎖後)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:開腹術、両側クラムシェル開胸術、および動脈採血。 (A)仰臥位に調整されたマウス。(B)腹部の正中線上に行われた皮膚切開。(C)剣状突起から恥骨まで伸びる開腹術で、最も劣った肋骨に沿って左右に延長されます。(D-E)胸腔に入るための横隔膜の開口部で、最も下肋骨(点線)に沿って左右に横隔膜切開が延長されます。(F)胸部の頂点に向かって前腋窩線(点線)を切開する両側クラムシェル開胸術。(G)下大静脈の後方の左胸部に伸びる右肺の副葉。(H)副小葉が動員され、右胸に戻った。(I)左心室からの動脈血の吸引(挿入図:右心室と左心室の色差)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:下大静脈への静脈内注射(A)右内側内臓回転により、下大静脈(IVC)を露出させます。(B)IVCへの溶液の注入。(C)止血を達成するためにIVCに圧力をかける。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 7: 左肺門クランプ後の肺酸素化、組織型、および好中球血管外漏出の代表的な結果 (A) 偽開胸術を受けた C57BL/6 マウスの動脈血中の酸素分圧と肺門クランプの比較。結果はSEM±平均、n = 6-7として表示されます。Mann-Whitney U検定によって計算されたp値。**P <0.01。(B)偽開胸術と肺門クランプを受けたC57BL/6マウスのホルマリン固定パラフィン包埋肺切片のH&E染色。スケールバーは250μmを表し、(C)肺門クランプ後のC57BL/6マウスにおける血管内(APC-Ly6G+FITC-Ly6G+)対血管外(APC-Ly6G+FITC-Ly6G-)Ly6G+好中球の分布の代表的な図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1: 気管内チューブのイントロデューサー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

肺動脈と静脈、気管支を閉塞して温かい虚血を誘発し、その後再灌流する左の肺門にスリップノットを適用する肺門クランプ技術について説明します。肺門クランプ後、左肺を採取して、組織学、フローサイトメトリー、バルクまたはシングルセルシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応などのさまざまな実験技術を行うことができます。さらに、血液と脾臓は全身の影響を研究するために使用され、非虚血性の右肺は内部制御として機能する可能性があります。このプロトコルでは、ABG測定値を取得したり、細胞外漏出を決定したりするための詳細な方法についても説明します。

マウスの肺門クランプ技術は、肺IRIの研究および肺移植のより広い分野にとって重要です。例えば、この肺門クランプモデルを用いて、私たちのグループは、脾臓由来のCCR2+古典的単球がIRI18後の肺への好中球の血管外漏出を媒介することを発見しました。別のグループは、II型肺胞上皮細胞が、肺門クランプモデル19を使用してNADPHオキシダーゼ-IL-17-TNFα依存的にCXCL1(好中球化学誘引剤)を産生することを示しました。TLR4は、肺門クランプ20のマウスモデルで浮腫の発症に関与していることがわかりました。

同所性マウス肺移植は臨床的に適用しやすく、温虚血と冷虚血の両方をシミュレートできますが、血管および気管支の吻合による外科的外傷や、ドナーとレシピエントの不一致による同種刺激も導入します。したがって、肺門クランプ技術の主な利点は、肺 IRI の影響をこれらの他の要因から分離する能力です。さらに、経験の浅いマウス顕微外科医にとって、肺門クランプ手術は技術的にそれほど要求が厳しくなく、肺移植と比較してより迅速に習得できます。肺門クランプモデルの 1 つの制限は、低温虚血を達成するのが難しいことです。in situ冷虚血は、左肺動脈25を介した順行性フラッシュ灌流を伴うブタで行われてきましたが、これはマウスではサイズが小さく、手術中に常温症を維持する必要があるため、はるかに困難です。それにもかかわらず、孤立した温性虚血の研究は、一般的に冷性虚血4,5,6よりも臓器機能に有害であるため、重要です。さらに、移植センターはDCD肺移植をますます採用しており、従来のDBD肺移植よりもはるかに長い温存虚血時間を伴います7。したがって、温性虚血とその後の再灌流期間中のイベントの詳細な研究は非常に重要であり、この肺門クランプモデルで達成できます。

肺門クランプ技術の多くのバリエーションは、過去数十年にわたって作成されてきました。これらには、非外傷性微小血管クランプ8,9,10,11,12,13、ルメル止血帯14,15、および門16の周りのスリップノット付きタイの使用が含まれる。マウスにおけるスリップノット技術の適応について説明します。この技術が他の肺門クランプ技術に比べて持っている主な利点は、虚血の期間中の胸部の閉鎖を可能にすることであり、特に虚血の期間が長いプロトコルでは、特に鈍感な体液損失を最小限に抑えます。これは、クランプまたは止血帯がヒルムに配置されている場合には達成できません。

動物の選択に関しては、ラットやブタなどの大型動物モデルではなく、マウスでこのモデルを開発することを選択しました。その理由は2つあり、私たちの研究室は、同所性マウス肺移植によるマウスマイクロサージャリーに豊富な経験を持っています17。第二に、マウスはラットよりも小さく、技術的に操作が困難ですが、現在、ラット系統よりも市販のトランスジェニックマウス系統の方が多くなっています26,27。また、マウスはより早く繁殖するため、新しい系統の迅速な開発が可能になり、IRIの免疫メカニズムを調べる際に特に役立ちます。これらの理由から、私たちはこの技術をマウスで開発することを選択しました。

私たちの知る限り、これはスリップノットを持つマウスの左肺肺門クランプの技術を使用した最初のビデオベースの記事です。Saitoらは、微小血管クランプ22を用いたラットの肺門クランプを実証するビデオベースの論文を公開しました。マウスでは、Liaoらは、スリップノットで肺動脈(PA)をクランプする肺IRIモデルを発表しましたが、気管支がクランプから除外されているため、このモデルでは肺は換気されたままです28。PAクランプ技術は、肺塞栓症29、肺高血圧症および/または右心室不全30,31を研究するためのモデルとして使用されています。研究分野は移植における肺 IRI であるため、虚血性損傷に加えて圧外傷を最小限に抑えるために、気管支を含む門全体をクランプすることを選択しました。

注目すべきは、IRI後の非常に初期の肺浸潤細胞の動態に興味があるため、30分間の温虚血と1時間の再灌流が選択されました。例えば、ヘムオキシゲナーゼ1などの細胞保護遺伝子のアップレギュレーションは、虚血のわずか30分後とそれに続く2時間の再灌流13の後に報告されています。好中球は、IRI32以降に肺に浸潤する中枢細胞型であると考えられていましたが、単球が好中球に先行して肺に到達することを示しました18,24。最近では、B細胞が単球にさえ先行し、再灌流から1時間以内に肺に入ることがわかりました(未発表のデータ)。この手法を適応させると、温虚血と再灌流の持続時間は、研究の質問と仮説に従って調整できます。この期間中は胸部を閉じることができるため、過度の水分や熱損失を心配することなく、より長い期間の温かい虚血が可能です。

いくつかの合併症が周術期に発生する可能性があり、最終的な共通の結果は周術期の死亡です。手術中の動物の死亡事故は、外科医がこの技術を繰り返すことで減少することが観察されています。私たちは、外科医がスキルのプラトーに達するには、少なくとも2か月の練習および/または少なくとも20の症例が必要であると推定しています。この時点で、術中死亡率は約 50 例に 1 例発生すると推定されています。麻酔をかけたマウスの死は、横隔膜と胸壁の筋肉組織の力強い収縮を伴う苦痛な呼吸によって予告されることがよくあります。これらの苦しい呼吸が始まると、介入を取らなければ3〜5分で死に至ります。術中の死亡を引き起こす可能性のある原因はいくつかあり、その多くは認識可能で予防可能です。この手術の重要なステップと、成功した結果を達成するためのトラブルシューティング技術を以下で強調します。

挿管
最初の重要なステップは、注意深い挿管と気道の固定であり、不注意による抜管を防ぐことです。サバイバル手術では、抜管後にマウスが呼吸できなくなるため、最初の挿管中に声帯が損傷しないようにすることが特に重要です。ETTのコードを超えた進行は、顕微鏡による直接視覚化の下で行う必要があります。挿管中に抵抗が満たされた場合、ETTを盲目的に進めないでください。.蚊クランプで中咽頭を開いたままにしながら、血液が気道の視界を遮るので、口腔粘膜を突き刺さないように注意する必要があります。挿管の試行回数は5回未満に制限する必要があります。.

偶発的な抜管
処置中のどの時点でも、肺が適切に膨らんでいるように見えない場合は、ETTが外れている可能性があります。長期間気づかれない偶発的な抜管の別の症状は、マウスが突然苦しい呼吸を発達させることです。最初の挿管後は、ETTをシルクテープで鼻の周囲にしっかりと固定し、マウスの首と胴体の調整を制限するように注意する必要があります。左肺も右肺も膨らんでいない場合は、ETTが気管から出てきた可能性があります。ETTを押し戻す試みを試みることができますが、動物の早期死亡を避けるために、マウスを迅速に再挿管する必要がある場合があります。両方の肺が膨らむと予想されるときに片方の肺だけが膨らんでいる場合は、ETTが深すぎる可能性があるため、慎重に引き戻して再度固定する必要があります。

肺の動員
左肺の動員は、圧迫損傷が肺胞を損傷し、肺のコンプライアンスを低下させる可能性があるため、肺実質に穏やかな圧力をかけた綿の先端のアプリケーターを使用して行う必要があります。肺は鉗子やクランプでつかむと、肺実質が損傷するので避けてください。

ヒラクランプの応用
左肺門クランプは、結び目を中央に置きすぎないように(左心房に引っかからないように)、または末梢に置きすぎないように注意して、直接視覚化して配置する必要があります(肺実質を引っ掛けないように)。肺門クランプで左心房を捉えると、心房細動を引き起こし、その後の死を引き起こす可能性があります。門の視覚化は、視野を拡大するために適切な肋骨の収縮を確保することで改善できます。スリップノットを結んだ後、リクルート操作を行うことにより、クランプが完全に閉塞していることを確認すると便利です-ETTを人工呼吸器に接続する流出チューブを手動で閉塞し、左肺が陽圧で拡張しないようにします。血管閉塞は、軟骨性気管支と比較して肺動脈と静脈の崩壊性が高いことを考えると、気管支閉塞の確認とともに推定されます。さらに、肺門クランプは、左主幹気管支の軟骨部分を押しつぶし、肺門クランプの解放後の左肺の拡張を防ぐため、過度の力で結ぶべきではありません。肺門クランプが解放されたら、別のリクルート操作を実行して、肺がまだ換気できることを確認することが重要です。

チェストクロージャー
胸を閉じるときは、肺が最大限に吸気されたときに、4番目 と5番目の 肋骨を一緒にする必要があります。これにより、胸膜腔に残る空気の量が最小限に抑えられ、肋骨が閉じられると気胸が発生します。筋肉層と皮膚は、緊張性気胸の発生を避けるために、気密性の高い方法で閉じる必要があります。.

ABG の取得
最後に、ABGを取得するときは、ABG測定値が左肺機能22,23のみを反映するように、最初に右肺門をクランプすることが重要です。右肺門クランプがないと、正常に換気されている右肺は、損傷した虚血性左肺を補う以上のものになり、ABG測定値は正常に見えます。

要約すると、上記で説明した肺門クランプ技術は、肺移植の研究にとって貴重なツールであり、重要なことに、同種異性、外科的吻合関連の外傷、または低温虚血性貯蔵を導入することなく、温冷IRIの研究を分離することができます。特に、この説明されている肺門クランプの手法は、簡単に教えられ、広く採用でき、信頼性と再現性のある結果につながる可能性があります。

開示事項

著者らは、関連する開示を報告していない。

謝辞

この研究は、公共、商業、または非営利セクターの資金提供機関から特定の助成金を受けていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Medications
10%ポビドンヨード溶液AplicareNDC 52380-0126-2消毒剤ブ
プレノルフィン用 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30疼痛管理用
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18疼痛管理用
ヘパリン1000単位/mLSagentNDC 25021-404-01動脈血を得るため
イソフルラン 1%-1.5%シグマ アルドリッチ26675-46-7麻酔用
ケタミン塩酸塩 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06麻酔用
Puralube 獣医眼軟膏Medi-Vet.com11897眼の乾燥を防ぐために
キシラジン 20 mg/mLアコーンNDC59399-110-20疼痛管理
用Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231血管を凝固させるには
湾曲した蚊クランプFine Science Tools13009-12外科手術用
Fine Curved 鉗子Fine Science Tools11274-20外科用手技
ファインハサミファインサイエンスツール15040-11外科手術用
挿管クランプのセットアップファインサイエンスツール18374-44, 18144-30挿管時にマウスを舌で垂直に保持するため。補足図1Aを参照してください。 
磁気リブリトラクターファインサイエンスツール18200-01, 18200-10開胸術の引き込み用。磁気固定具とリトラクターは、以下のマイクロラテックスチューブで接続する必要があります。
光学グレードプラスチック光ファイバージャケットなし、500μmEdmund Optics02-532気管内チューブのイントロデューサーを作るため。この光ファイバーの1.5インチの長さには、一端に固定されたシルクテープが必要です。その後、気管内チューブのイントロデューサーとして使用できます。イントロデューサーの端はわずかに湾曲している必要があります。
パワプロウルトラクリッパーオスター078400-020-001髪をクリップするには
さみファインサイエンスツール14370-22外科手術用
小動物加熱パッドK&H ペット製品サーモピープ加熱パッド正常体温を維持するため
小動物用人工呼吸器ハーバード装置55-0000換気用(TV 0.35 cc、PEEP 1 cm H2O、RR 100-105/min、FiO2 100%)
Spearit マイクロラテックスゴムチューブ(外径1/8、内径1/16)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1の引き込み用開胸術
Stat Profile Prime Critical Care 血液ガス分析装置Nova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB  		開胸術の引き込み用
ストレートクランプファインサイエンスツール13008-12外科手術用
ストレート鉗子ファインサイエンスツール91113-10外科手術用
顕微鏡ワイルド・ヘールブルッグは生産されなくなりました挿管および外科手術用; ライカ手術用顕微鏡
Supplies交換をお勧めします>
½ ccシリンジ ½ インチ 29G ニードルマッケソン942665ケタミン/キシラジン腹腔内注射用
½ インチ 31G ニードル 1 cc ツベルクリン注射器マッケソン16-SNT1C2705左心室からの動脈血の吸引用
1インチ 20G IV カテーテルテルモSROX2025CA気管内チューブ (ETT)
1インチ シルクテープデュラポア3M ID 7100057168ETTを鼻にテープで固定し、手足を固定するために
3/10 cc シリンジ 5/16 インチ 31G 針マッケソン102-SN310C31516P下大静脈への抗体注入用
6-0 モノフィラメント縫合糸 P-10 針マッケソンS697GX開胸術、筋肉層、皮膚の閉鎖用
6-0 シルクネクタイ外科専門SP102肺門クランプ用のスリップノットを作るには
先のとがった綿の先端のアプリケーターソロン56225肺を操作し、鈍い解剖のために

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

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肺門クランプマウス肺傷害好中球の血管外遊出B細胞の動員フローサイトメトリー開胸術の手順動脈血ガス分析肺移植モデル
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