バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

Summary

このプロトコルは、遺伝的多様性を確保し、サンゴ礁の回復努力を支援することを目的として、絶滅の危機に瀕しているサンゴ種からの精子の処理と凍結保存の効率と能力を改善するための半自動化された経路を説明しています。

Abstract

サンゴ礁は、海洋の温暖化によって引き起こされる白化現象の頻度が増加し、世界中のサンゴ礁のサンゴが死滅するなど、危機に直面しています。その後の遺伝的多様性と生物多様性の喪失は、サンゴが変化する気候に適応する能力を低下させる可能性があるため、現在および将来のサンゴ礁の回復に利用できる資源を最大化するためには、既存の多様性を維持する努力が不可欠です。遺伝学を長期的に確保するための最も効果的なアプローチは、凍結保存とバイオバンキングであり、これにより、生きたサンプルを液体窒素中の極低温で無期限に凍結保存することができます。サンゴの精子の凍結保存は2012年から可能になりましたが、サンゴの繁殖の季節的な性質により、バイオバンク活動は産卵が発生する年に数回に制限されています。したがって、サンゴの精子処理と凍結保存ワークフローの効率を向上させることは、これらの限られたバイオバンキングの機会を最大化するために不可欠です。この目的のために、既存の技術に基づいて、サンゴの精子の評価、取り扱い、および凍結保存を合理化するための半自動アプローチを作成することにより、サンゴの精子の凍結保存処理経路を最適化することに着手しました。このプロセスは、コンピューター支援の精子分析、バーコード付きのクライオバイアル、および複数のユーザーが同時に編集できる一連のリンクされた自動データシートを組み合わせたもので、現場でのサンプル処理とメタデータ管理の両方の効率を向上させます。オーストラリアのサンゴ礁修復および適応プログラムなどの分野横断的な研究プログラムとの統合を通じて、凍結保存は、水産養殖個体群の遺伝的管理を促進し、耐熱性を高める研究を支援し、サンゴ種の絶滅を防ぐことにより、大規模なサンゴ礁修復プログラムで重要な役割を果たすことができます。記載されている手順は、世界中のサンゴ礁のサンゴ礁の凍結保存およびバイオバンキングの実践者に利用され、研究所から大規模なアプリケーションへの凍結保存技術の移行のモデルを提供します。

Introduction

世界中のサンゴ礁は、気候変動による海洋温暖化と酸性化により、サンゴの種、個体数、遺伝的多様性が失われており、これらの重要な生息地の生存能力が低下し、それらを支える種に影響を与えています^1,2。遺伝学を長期的に確保するための最も効果的なアプローチは、凍結保存とバイオバンキングであり、これにより、生きたサンプルを液体窒素の極低温で無期限に凍結保存することができます³。2012年に開発されたサンゴ精子⁴の凍結保存法により、これらの種からの遺伝学のバイオバンクが初めて可能になり、2012年にはサンゴ遺伝学のための最初のバイオレポジトリの開発につながり^{ました5。}それ以来、この凍結保存プロトコルは^{さらに洗練}され6、世界中の50種以上のサンゴの遺伝学を保護するために使用され、そのうち30種はオーストラリアのグレートバリアリーフから来ています⁷。凍結保存されたサンゴの精子は、正常に発達する健康なサンゴを生成することができ、オーストラリア⁸とカリブ海⁹で補助遺伝子流動実験を促進するために使用されてきました。幼虫¹⁰や成体のサンゴ組織^11,12などの複雑な組織タイプの凍結保存を可能にする技術が現在開発中ですが、サンゴの精子の凍結保存は現在、サンゴ遺伝学の日常的なバイオバンキングに利用できる最も確立されたツールです。

サンゴの個体数への影響が増大するにつれて、いくつかの国は、サンゴ礁の回復と適応を支援するための大規模なプログラムを開始しました(例:オーストラリアのサンゴ礁修復および適応プログラム[RRAP]¹³)、または残りの絶滅の危機に瀕しているサンゴの個体群を確保するため(例:米国のフロリダコーラルレス^キュー14)。これらのプログラムの文脈では、凍結保存は、既存の遺伝的多様性を確保し、絶滅を防ぐだけでなく、研究と大規模なサンゴの生産を支援する技術と考えることができます。精子の凍結保存は、物理的または時間的に分離された集団間の繁殖をより細かく制御することを可能にし、親魚の遺伝的管理を可能にして、耐熱性や耐^{病性などの}望ましい形質を選択できるようにすることができる8。今日まで、サンゴの精子バイオバンクは、^{生物多様性管理を支援するために}比較的小規模に行われてきた7ため、そのようなバイオバンキングがこれらの大規模なサンゴ礁修復プログラム内でその可能性を発揮するためには、ある程度のアップスケーリングが必要になります。サンゴの繁殖に基づくすべてのサンゴ礁の回復努力と同様に、バイオバンキングの努力を増やすための主な障害は、ほとんどのサンゴ礁構築種での産卵が春の終わりと初夏の満月と一致するため、サンゴ配偶子が利用可能になる期間が限られていることです¹⁵、つまり、配偶子は毎年数夜に凍結保存とバイオバンキングにしか利用できません。さらに、大量産卵が発生する地域、例えばグレートバリアリーフでは、通常、複数の種が同時に産卵するか、同じ夜に互いに数時間以内に産卵します¹⁵。したがって、精子凍結保存経路の強化は、サンプルと関連するメタデータの完全性を確保しながら、これらの短い年間産卵期間中にバイオバンキング能力を最大化するために、処理の規模と効率を向上させる必要があります。

サンゴの精子の凍結保存とバイオバンクには、産卵中の配偶子の収集から、サンプルのバイオリポジトリとデータベースへの登録まで、いくつかの重要なステップが含まれます(図1)。このプロセスは、卵子からの精子の分離(雌雄同体種)または水柱からの精子の収集(淋病種)から始まり、続いて精子の運動性と濃度の評価が続きます。次に、精子をろ過海水(FSW)で凍結保護剤(10%v / v最終濃度、ジメチルスルホキシド、DMSO)と混合し、カスタム設計の冷却装置⁴で-20°C / minで冷却します。このプロセスの初期の反復は、位相差顕微鏡法および血球計算盤のカウント による 精子の運動性と濃度の視覚的評価、凍結保存のためにサンプルが処理される際のチューブの印刷およびラベリング、精子サンプルのクライオバイアルへの手動ピペット、および特別に設計されたフローティングラック¹⁶での冷却に依存していました。コンピュータ支援精子分析(CASA)¹⁷ の適用と3Dプリントされた冷却装置⁶ の開発により、サンゴの精子凍結保存の効率と信頼性が向上しましたが、精子サンプルの処理経路は、その開始以来ほとんど同じままです。このアプローチは、産卵の夜に中程度の数のコロニーや種からのサンプルを処理するのに適していますが、大量かつ多数のコロニー(例えば、一度に>0コロニーの個々のサンプル)の場合、凍結保存経路にボトルネックがあり、サンプルの受精能を低下させることなく、サンプルの適時(すなわち、精子放出から2時間以内)でのサンプルの処理を妨げます。クライオバイアル用の大規模な流体処理システム(Thomas et ^al.18など)が利用可能ですが、通常は大規模なバッチ処理(つまり、複数のラックのクライオバイアル)用に設計されており、現場での輸送や使用には適していないため、このアプリケーションには費用対効果が高くありません。そこで本研究では、産卵期に効果的に凍結保存できるサンプル数を最大化するために、処理経路の主要なステップにポータブルで安価な自動化装置と方法を導入することにより、サンゴの精子凍結保存の効率を向上させることを目指しました。

Protocol

本明細書に記載の方法は、雌雄同体および雌雄同体のサンゴ種の両方からの精子を処理し、凍結保存するために用いることができる。サンゴの産卵と、両方の生殖モードの精子凍結保存のための配偶子コレクションに関する一般的な紹介と入門書は、スミソニアン国立動物園保全生物学研究所のサンゴ凍結保存トレーニングコース¹⁹で見つけることができます。記載されている方法は、主に、ウォッパブラシーカントリーのケッペル島グループとオーストラリアのグレートバリアリーフのビンダルシーカントリーのデイビスリーフから収集された アクロポラミレポラ コロニーからの配偶子を使用して開発されました。サンゴと配偶子のすべての収集と使用は、関連する海の国の伝統的な管理者の自由な事前のインフォームドコンセントに基づいて行われました。この研究に使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 産卵前 - 精子活性化液と凍結希釈液のシステムチェックと調製

1. バーコードスキャナーが充電され、アクティブで、スプレッドシートデータを水平セルエントリとして入力するように設定されていることを確認します。この設定をカスタマイズするには、バーコードリーダーのユーザーマニュアルを参照してください。
2. CASA用のサンゴ精子活性化濃縮ストック溶液を準備します。
   注:使い捨て手袋は、活性化溶液の調製のために化学物質を取り扱うときに着用する必要があります。
   1. 37°Cに設定されたチューブウォーマーを使用して、1.5 gのBSAを4 mLの滅菌精製組織培養水に溶解することにより、30%ウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液(5 mL)を調製するか、チューブをカップ状の手で保持し、定期的に穏やかに渦巻かせます(バイアルを振らないでください)。
   2. 溶液中に入れたら、組織培養水を使用して最終容量(5 mL)まで調製し、チューブに日付をラベル付けし、「30% BSA in H₂O」とマークします。
   3. 冷蔵庫(4°C)で最大2週間保管してください。
   4. 0.2913 gのカフェインを24 mLのろ過海水(FSW)に溶解して、60 mMのカフェインストック溶液(25 mL)を調製します。
   5. 溶液中に入れたら、FSWを使用して最終容量(25 mL)まで調製し、チューブに日付をラベル付けして「FSW中の60 mMカフェイン」とマークします。
   6. 冷蔵庫で最大1か月間保管してください。
      注:FSW中のカフェインの最大溶解度は約71 mMです。
3. 精子サンプル用の精子活性化ワーキング溶液を ~10⁹ sperm/mL (FSW で 0.9% BSA + 12 mM カフェイン) で調製します。
   1. 10 mLのワーキング溶液には、2.0 mLの60 mMカフェインストック溶液 + 0.3 mLの30% BSAストック溶液 + 7.7 mLのFSWを組み合わせます。
   2. チューブに日付と「精子活性化作業溶液 - 0.9% BSA + 12 mM カフェイン」のラベルを付けます。
   3. 使用日ごとに調製し、室温(19〜30°C)で保存し、未使用の溶液は一日の終わりに廃棄してください。
4. 凍結保護液(クライオ希釈剤)を調製します。凍結保護剤DMSOを取り扱うときは、使い捨て手袋を着用してください。
   注:FSWは、サンプル内の初期精子濃度と凍結保存されたアリコートの所望の最終精子濃度に応じて、さまざまな凍結保護剤濃度で調製されます。クライオ希釈液を調製する際は、DMSOを添加する前にFSWが50 mLチューブに分注されていることを確認してください。
   1. 産卵前にサンゴが保持されているタンクシステムから原水を収集します(~35 pptの塩分濃度)。
   2. 0.2μmの非発熱性メンブレンフィルターを取り付けた真空ポンプに取り付けられたボトルトップろ過システムを使用して原水をろ過します。
   3. 精子濃度≥2×10⁹ 精子/mLの場合、50mLチューブに10mLのDMSO+40mLのFSWを組み合わせて、FSW中に20%DMSOを調製します。
   4. 精子濃度<2×10⁹ 精子/mLの場合、50mLチューブに15mLのDMSO+35mLのFSWを組み合わせて、FSW中に30%DMSOを調製します。
   5. チューブに日付とDMSO濃度(30%DMSOまたは20%DMSO)をラベル付けします。
   6. 使用日ごとに調製し、室温(19〜30°C)で保存し、未使用の溶液は毎日の終わりに廃棄してください。
      注:DMSOとFSWを混合すると発熱反応が生じるため、クライオ希釈剤は使用前に十分に調製して室温まで冷却する必要があります。FSWは、この発熱を相殺するためのクライオ希釈剤の調製のために4°Cで保存できます。
5. 熱電対データロガーを準備します。
   1. 各凍結保存ランのおおよその冷却速度を測定するには、FSWに10% DMSOを含むクライオバイアルを置き、熱電対プローブを蓋を通して挿入し、精子サンプルと並んで凍結保存ラックのサンプルスロットに入れます。
   2. 熱電対バイアルを作成するには、バーコード付きのクライオバイアルのキャップに小さな穴を開けるか溶かし、その開口部からK型またはT型の熱電対を挿入します。熱電対プローブの先端を、バイアルが充填されたときにサンプルの中央に収まるレベルまで押し下げ、プローブの先端をバイアルの中央に保ち、バイアルの内側の壁との接触を防ぎます。キャップを密封し、熱電対プローブをホットグルーで所定の位置に保持します。
   3. 使い捨て手袋を着用して、バーコード付きのクライオバイアルに、凍結保存する精子サンプルの量に等しいFSW中の10%DMSOの量を満たします。
   4. FSWで新鮮な10%DMSOを調製し、熱電対バイアルを毎日補充します。

2. 精子の準備と評価

1. 雌雄同体種(例: .、アクロポラ 種)の場合、3 mLのトランスファーピペットを使用して水面から配偶子束を採取し、5 mLの海水(総容量10 mL)に対して5 mLの配偶子束の比率で標識された50 mLチューブに入れます。
2. 淋病種の場合は、3 mLのトランスファーピペットを使用してポリープの口の近くから精子を採取し、サンプルを標識された50 mLチューブに入れてから、ステップ2.8に直接進みます。
   注:使い捨て手袋は、配偶子サンプルの収集と取り扱いには必要ありませんが、必要に応じて着用できます。手は真水でよく洗うか、交差汚染を避けるために各配偶子サンプル間で手袋を交換する必要があります。
3. 雌雄同体種の場合は、束がバラバラになるまでサンプルを手で優しく渦巻かせて、精子-卵子束を攪拌します。
   注: 一部のモンティポラ 種は卵に毒素が含まれているため、精子の損傷を避けるために、最小限の攪拌でゆっくりとバラバラにする必要があります。
4. サンプルをチューブラックに2分間置いて、卵子が表面に浮かび、精子が沈殿するのを待ちます(卵子は表面にピンク/茶色の層を形成し、個々の卵子が見えます; 図1iを参照)。
5. 精子を分離し、汚染された卵子を除去するには、清潔な3mLトランスファーピペットを使用してチューブの底から精子を穏やかに吸引します。
6. 精子サンプルを、新しい滅菌済み50 mL遠心分離チューブの上に座っている100 μmセルストレーナーに移します。サンプルはフィルター内を簡単に流れる必要があります。フィルターを軽くたたいてサンプルの流れを促進し、必要に応じて、きれいなトランスファーピペットを使用してフィルターの下側から残留サンプルを収集できます。フィルターを取り外してから、チューブを緩くキャップして空気交換を可能にします。
7. ろ過された精子サンプルにコロニーIDをラベル付けし、サンプルを精子評価ワークステーションに移動します。
8. coral biobanking auto-datasheetファイル(補足ファイル1)を開きます。[精子評価] タブで、サンゴのコロニーのメタデータ (列 A から H) を入力します。
9. CASA評価のために精子を準備します。
   1. 精子サンプルをよく混合し、10 μLのアリコートを空の1.8 mLマイクロ遠心チューブに移します。
   2. すぐに0.390 mLの精子活性化作業溶液を10〜20秒かけて滴下し、精子を溶液に穏やかに混合します。これにより、希釈比は 1:39 (精子: 溶液, v/v) (または希釈係数 40) となり、生精子の濃度が ~2 ×× 10⁹ sperm/mL の場合、CASA 評価に適した濃度 (~50 10⁶/mL) が得られます。チューブを5回反転させ、開く前にチューブの蓋をはじいて、溶液をチューブの底に沈めます。
      注:CASAの精子濃度は、正確な精子追跡を可能にするために、8〜50×10⁶ / mLの範囲にある必要があります¹⁷。必要に応じて、生精子アリコートに追加の精子活性化作業溶液を追加して、濃度を下げることができます。希釈率を再計算し、この値をスプレッドシートに入力します。多くのサンプルを同時に処理しなければならない場合は、1.8 mLの微量遠心チューブに0.390 mLの精子活性化ワーキング溶液をあらかじめロードし、10 μLの精子サンプルを直接加えた後、チューブを10×反転させ、チューブの蓋をはじいてから開封してよく混合することができます。
10. Zuchowicz et ^al.17に記載されているように、コンピューター支援精子分析(CASA)を使用して、4 μLの活性化精子懸濁液をMakler計数^{チャンバー20}に置くか、Hagedorn et al.4に記載されているように、位相差顕微鏡下での視覚的評価と血球計算盤の計数により、精子の運動性と活性化サンプルの濃度を評価します。
    注:Maklerチャンバーとカバースリップは、70%エタノールでよく洗浄し、次に蒸留水で洗浄し、サンプル間で糸くずの出ないティッシュワイプで拭く必要があります。
11. CASA評価に用いた精子希釈係数を入力し、精子濃度(百万/mL)、総運動性(%)、進行性運動性(%)のCASA出力をオートデータシートに入力してください。
    注:平均経路速度(VAP)、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)などの追加のCASAメトリックは、オプションで自動データシートに含めることも、保存したCASAファイルから後で取得することもできます。
12. ろ過した精子サンプルチューブに精子濃度を書き込み、バンドルの分割と処理と同じ順序でサンプルを凍結保存ワークステーションに移します。

3. 精子の希釈と凍結保護剤の平衡化

1. 凍結保存ワークステーションで、精子評価ワークステーションが使用しているのと同じサンゴバイオバンキング自動データシートファイルを開き、[ 凍結保存 ]タブを選択します。精子サンプルチューブのラベルを確認し、 コロニーID(列C)を確認して対応するエントリを特定します。ワークステーション間で同じ自動データシートファイルに同時にアクセスできない場合は、自動データシートの コロニーID(C列) と 精子濃度(F列) に手動でデータを入力します。
2. 血清ピペットを使用して、サンプルをピペットに引き込み、同じチューブに排出することにより、精子サンプルの量を測定します。 列 E に値を入力します。
3. 必要な凍結保護剤の濃度については自動計算された カラムI を、添加する凍結希釈剤の量については カラムH を確認してください(表1)。
4. タイマーを10分間開始し、血清ピペットを使用して、すぐにクライオ希釈剤の添加を開始し、サンプルを常に穏やかに混合しながら、DMSOの取り扱いに使い捨て手袋を着用します。
5. クライオ希釈液の添加時間を カラムPに記録します。

精子濃度	凍結希釈剤	希釈倍率(精子:凍結希釈液)	精子サンプル中の最終DMSO濃度(%)
< 2 × 109 / mL	FSWで30%DMSO	2:1	10%
≥ 2 × 109/mL	FSWで20%DMSO	1:1	10%

表1:凍結保存するサンプル中の総精子濃度の評価に基づく、サンゴの精子の凍結保存のための凍結希釈剤の濃度と希釈比。

4. 精子の凍結保存

1. カラム K を読み取り、充填するクライオバイアルの数を決定します。これは、精子の総量とバイアルあたりの所望の量(ほとんどの場合1mL)から自動計算されます。10分間のインキュベーション期間中に、ステップ4.2から4.6に進みます。
2. 滅菌バーコード付きクライオバイアルのキャップを外し、清潔で滅菌済みの表面にキャップをセットします。
3. オプション:油性マーカーを使用して、各クライオバイアルにrun#を書き込みます。これにより、バイオバンクへの登録のための迅速なサンプル同定が可能になります。
4. 血清学的ピペットと分注ピペットを希望のサンプル量(1 mL)にセットして、キャップなしのバーコード付きクライオバイアルとリキャップバイアルにサンプルを分注します。
5. 1つの熱電対バイアルとすべてのフルサンプルバイアルを空のクライオラックに室温で置きます。バーコード付きの表面がすべてのバイアルで外側を向いていることを確認してください。
6. 必要に応じて、FSWに10% DMSOを含むダミーのクライオバイアルを追加でクライオラックの空きスペースに配置し、すべてのスペースが占有されるようにします。
7. 自動データシート(列U)に実行番号を入力し、クライオラックのシリアル番号(QRコード)を列Vにスキャンします。
8. カーソルをカラムZの正しいセルに置き、熱電バイアルをスキャンし、続いてラックにロードされているすべてのクライオバイアルチューブ(カラムAA以降)をスキャンします。サンプルがバイアルの糸に入らないように、ラックを横に傾けないでください。
9. スキャン中に、データが正しいセルに入力されていること、およびすべてのクライオバイアルが一度スキャンされていることをクロスチェックします。
10. 凍結保護剤の平衡化期間の残りの間、ロードしてスキャンしたラックを脇に置き、冷却容器を凍結保存のために準備します。
11. クライオラック冷却容器を、約-20°C/minでの冷却に必要な適切な所定のレベルまで液体窒素で満たします。
    注:窒素は窒息の危険性があるため、換気の良い場所でのみ使用してください。液体窒素を取り扱うときは、つま先が閉じた靴、安全眼鏡/フェイスシールド、およびクライオ手袋を着用する必要があります。液体窒素の取り扱いと使用に関する具体的な情報については、機関のガイドラインを参照してください。
12. 10分間の凍結保護剤平衡化期間の終了時に、熱電対プローブをデータロガーに接続して記録を開始し、フルクライオラックを冷却容器にそっと置き、蓋をします。
13. Q列に開始時刻を記録します。
14. 熱電対バイアルがデータロガーで-80°C以下を示したら、クライオラックインサートをポリスチレンボックスなどの別の容器内の液体窒素浴に移して、サンプルを液体窒素で急冷します。
15. クライオバイアルをラックから取り出し、ドライシッパーに移してバイオレポジトリに輸送します。

Results

このプロトコルで概説されている手順は、Hagedornら⁴ によって記述されたサンゴ精子凍結保存の元の方法と、その後のZuchowiczら⁶による改良に基づいており、凍結保存とバイオバンキングのための精子処理の効率を高めるための主要な改善を提供します。バーコード付きのクライオバイアルと分注オートピペッターを使用すると、クライオバイアルの印刷や手作業によるラベル付けが不要になり、精子の包装手順が簡素化され、大量のサンプルをハンドピペッティングする負担が軽減されます。重要なことに、これらの改善により、凍結保存のためのサンプル調製に必要な時間も約8〜10分から5分未満に短縮されます。CASAの使用と合わせて、これらの改善により、サンゴの精子の効率的なバイオバンクに必要な人員の数が、元の方法では4人から6人になり、現在のプロトコルでは2人にまで減少します。さらに、バーコード付きのクライオバイアルを使用すると、各チューブが一意の識別子を持つため、バッチ印刷されたラベルを使用して以前の方法よりも高い解像度でデータベース内で各チューブを追跡できます。

2022年にオーストラリアで開催されたグレートバリアリーフの産卵期に行われた2つの産卵イベントにわたるプロトコルのフィールドテストにより、2人のオペレーター(CASAに1人、凍結保存に1人)が5種、57のコロニーから389のサンプルを凍結保存とバイオバンク化し、必要に応じてさらに1人が束の分解と精子の分離を支援することができました。2022年11月にオーストラリアのクイーンズランド州コノミー(ノースケッペル島)で行われた産卵イベントでは、24のコロニーから採取した アクロポラ・ミレポラ の150サンプルを2人のオペレーターが2時間かけて凍結保存しました。このような多数のサンゴコロニーから採取されたこの量のサンプルを効率的に処理し、凍結保存できたのは、主にサンプル調製時間の効率化とワークステーション間でのメタデータの転送の簡素化によるものです。

2023年12月の産卵時のワークフローをさらにテストしたところ、サンゴの精子については、CASAシステムで一般的に使用される市販の固定カバースリップシングルユースチャンバースライドと比較して、Makler計数チャンバーがより正確な運動性と濃度のデータを提供することがわかりました。Makler計数チャンバーは、市販のラテックスマイクロビーズを使用して、既知の濃度で4μLのサンプル容量とサンゴの精子に使用された標準のCASA設定¹⁷ を使用してCASAについて検証されました。これらの分析では、メーカーが提供した予想濃度範囲(46.0 ±± 700万mL)内に収まる、ばらつきの少ない(44.5 700万/mL)一貫したカウントが示されました(図 2)。Makler 計数チャンバーと固定カバースリップチャンバースライドを使用して収集された Acropora millepora の CASA データの比較では、2 つのチャンバータイプ間で精子濃度カウントに有意差があることがわかりました (P = 0.002; 図2)、固定カバースリップチャンバースライドは、Makler計数チャンバーを使用して決定された濃度の半分未満を記録します。この傾向は、他の2つのサンゴ種の精子サンプルでも観察されました(データは示されていません)。また、2023年12月の試験では、1:1希釈で20%DMSOまたは1:2希釈(精子:クライオ希釈液)で30%DMSOを使用して凍結保存されたサンプルでは、融解後の総精子、運動性精子、または進行性精子の融解後濃度に有意差は見られませんでした(図3)。

図1:凍結保存のためのサンゴ精子の半自動処理に使用されたワークフローと、野外で使用された移動機器の例(A)サンゴ配偶子束は、FSWの5mLに対して5mLの束の割合で収集され、卵子と精子を分離するために分割されます(i)。コロニーのメタデータは自動データシートに入力され(ii)、分離された精子サンプルはコンピューター支援精子分析(CASA)(iii)を使用して評価されます。精子の品質パラメータを自動データシートに追加して、FSWに20%または30%のDMSOを添加するかを計算し(iv)、希釈したサンプルをバーコード付きのクライオバイアル(v)に分注します。クライオバイアルはクライオラックにロードされ、自動データシート(vi)にスキャンされ、-20°C/分から-80°C(vii)の速度で冷却されます。その後、サンプルは液体窒素で急冷され、乾燥荷送人に移送されてTaronga CryoDiversity Bank(viii)に輸送されます。(B)近江環境教育センターの教室内の遠隔地に設置されたCASA(左)と凍結保存ステーション(右)の例。(C)オーストラリア海洋科学研究所の国立海シミュレータで複数のクライオラックを実行するために設置された実験室ベースの大容量凍結保存ステーションの例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:サンゴの精子濃度を測定するための2つの異なるチャンバースライドオプションの比較 (A)Maklerカウンティングチャンバーと市販の固定カバースリップチャンバースライドを使用した Acropora millepora (n = 3個体)の総精子濃度測定値の比較。列は平均±SEMを示しています。アスタリスクは有意差を示します(P = 0.002)。(B)既知の濃度で市販のラテックスマイクロビーズを使用したMakler計数チャンバーと、サンゴ精子の標準CASA設定の検証。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:凍結保存されたサンプル中の総精子、運動性精子、または進行性運動精子の融解後の濃度。 FSWで20%または30%のDMSOを使用して、凍結保存のための最終的な10%のDMSO濃度を達成するための、総、運動性、および進行的に運動する精子の濃度の融解後の比較。n = 3個体からのサンプルをそれぞれ2つのアリコートに分割し、1つのアリコートを20%DMSOを1:1添加して凍結保存し、2番目のアリコートを<2×10⁹/mLに希釈してFSWを使用して凍結保存し、30%DMSOを1:2添加(精子:凍結希釈液)しました。列は平均±SEMを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:コーラルバイオバンキング自動データシートファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルに記載されている半自動処理経路により、サンゴの精子の効率的な処理と凍結保存が可能になり、絶滅危惧種からの遺伝学を確保し、サンゴ礁の回復と適応の取り組みを支援します。このプロトコルの開発の動機は、精子凍結保存のためのハイスループット処理システムが典型的には0.25mLまたは0.5mLのフレンチスト^ロー21,22のサンプル包装に基づいているため、サンゴ精子凍結保存および凍結バイアルの使用のスループット要件に適した既存のシステムの欠如であった.これに対し、クライオバイアルは一般に、ロースループット処理(例えば、研究のための実験室サンプルの凍結保存^23,24)のために小規模で使用されるか、または高価で携帯不可能な機器を使用するバルクサンプルのハイスループット処理システム(例えば、産業向けの細胞培養処理^18,25)で使用されるかのどちらかです).また、クライオビアルキャップの取り外しと交換を効率化するために、オートデキャッピングシステムを使用する可能性も調査しましたが、システムは個々のクライオバイアルまたはクライオバイアルラック全体に対してのみ利用可能であったため、費用対効果の高いソリューションを提供していませんでした。現在、Hagedornら⁴によって考案された凍結保存プロトコルを使用してサンゴの遺伝的多様性を確保しているグループが世界中にいくつかあり、この作業が世界中のより多くのサンゴ礁に拡大し続けることが重要です。したがって、現在のプロトコルの開発における主要な考慮事項は、これらの他のグループが容易に実装でき、サンゴの精子凍結保存を開始したい新しいグループにとって法外な費用がかからない、費用対効果が高くアクセス可能な技術を利用する必要性でした。

説明されているプロトコルの主要なコンポーネントは、Microsoft Excelのリンクされたスプレッドシート を介した サンプルメタデータの処理の改善です。データ入力は一般的に簡単ですが、データを編集するクイック機能(Ctrl + C、Ctrl + Vなど)は、他のユーザーの同時入力に影響を与える可能性があり、スプレッドシート間のデータリンクに問題を引き起こす可能性があるため、自動データシートの情報の編集は情報を削除して再入力することによってのみ行う必要があることに注意する必要があります。重要なメタデータコンポーネントは、ドナーコロニーにリンクされ、処理経路のすべての段階でサンプルに添付される一意の識別子(すなわち、コロニーID)です。サンプルチューブには、バンドル収集時にコロニーIDを明記し、調製中(卵子と精子を分離するためのろ過中、またはクライオ希釈剤の添加など)にサンプルが移入する新しいチューブにこの情報を正確に転写することが不可欠です。このプロトコルにより、CASAオペレーターから凍結保存ワークステーションにサンプル品質情報を自動的に転送できますが、インターネットやWi-Fiのカバレッジが不十分な場合は問題が発生する可能性があります。データ転送の遅延が発生した場合は、2 つのワークステーションをオフラインで作業し、後で調整できる個別の自動データシートを保持することをお勧めします。凍結保存オペレーターが必要とする重要な情報はコロニーIDとサンプル濃度であるため、CASAオペレーターは、コンピューター間でのメタデータのアップロードまたはダウンロードに遅延がある場合に、この情報が凍結保存準備のために手元にあることを確認するために、バックアップとしてサンプルチューブにサンプル濃度を書き込むことをお勧めします。

このプロトコールに使用されるバーコードスキャナーとバーコード付きクライオバイアルの選択肢は、予算や製品の入手可能性に合わせて変えることができます。ただし、選択する際に考慮すべき重要な要素がいくつかあります。バーコードスキャナーには、カスタマイズされた設定、特にデータ入力仕様とデータ入力の方向を変更する機能が必要です。このプロトコルに使用される自動データシートは水平入力を使用しますが、場合によっては(バイオバンクへの加入や他の実験室での使用など)、垂直入力が必要になる場合があるため、この機能をカスタマイズ可能であることが重要です。このプロトコールは1Dバーコードと2Dバーコードの両方で使用できますが、凍結保存中にサンプルエントリのクロスチェックを可能にするために、選択したクライオバイアルには人間が読めるコンポーネント(たとえば、1Dバーコードには通常一意の番号が含まれています)を含めることをお勧めします。サンプル入力に加えて、バーコードスキャナーを使用して、産卵前にサンプル間で繰り返される情報(種名、日付、サンゴ礁の位置など)のQRコードを作成して印刷することにより、一部のメタデータフィールドの入力を自動化できます。この情報は、バーコードスキャナーでスキャンすることにより、自動データシートにすばやく簡単に入力できます。さらに、各クライオラックと熱電対プローブにシリアル番号のバーコードを貼り付けることで、各凍結保存ランをデータベース内の特定の機器セットにリンクすることも可能であり、品質管理や修理や交換が必要なコンポーネントの特定に役立ちます。

処理の制限要因は、多くの場合、束が分裂するのを待つのに費やす時間と、CASAと凍結保存の前に卵子から精子をろ過して分離するのに必要な時間です。可能であれば、バンドルが分割される順序でサンプルを処理することをお勧めします。しかし、サンプル処理の注文を戦略的に管理することで、さらなる効率化を図ることができます。例えば、サンプル量が少ない(すなわち、1コロニー当たりの精子が3mL未満)か、クライオ希釈剤による2:1の希釈を必要とする精子濃度が低い(すなわち、2×10⁹ / mL未満)ために、コロニーあたり5個以下のクライオバイアルがある場合、2つのコロニーサンプルに同時にクライオ希釈液を添加して、同じクライオラックで一緒に実行できるようにする(利用可能なスロットの合計#スロット= 11)、 空いたスペースをダミーで埋めて別々に実行するのではなく。さらに、10分間のクライオ希釈液平衡化時間内にすべてのプロセスを完了できるように注意を払えば、複数のクライオラックを同時に実行することができます(サンプル>6 mL容量の場合)ため、サンプルスループットをさらに向上させることができます。ただし、複数のクライオラックを実行する場合、または単一のクライオラックで複数のコロニーを組み合わせる場合、特にサンプルがCASA評価とは異なる順序で凍結保存される場合は、凍結保存メタデータが自動データシートの正しいサンプルに割り当てられていることを確認するように注意する必要があります。

半自動ワークフローの開発に加えて、本プロトコルの説明では、精子分析と凍結保存結果の改善を目的とした精子濃度に関連する 2 つの方法論的比較も提供します。一般に、5mLの海水(総量10mL)に対して5mLの配偶子束を採取すると、精子濃度は2×10⁹ 細胞/mL以上になりますが、種違いや採取中に束がバラバラになったりして、精子濃度が低くなることがあります。高濃度のDMSOクライオ希釈液(30%v/v)を使用すると、精子が希釈される量が減り、クライオバイアル内の精子濃度のバッチ間の変動が最小限に抑えられます。重要なことは、 図3の代表的なデータに示されているように、最終的なDMSO濃度を達成するために30%DMSOを使用しても、融解後の濃度や運動性パラメータに影響を与えないことです。2 番目の方法論の比較は、CASA に通常使用されるシングルユースの固定カバースリップ チャンバー スライドに代わるものを提供します。サンゴの精子の分析に市販のスライドを使用する際の主な課題は、スライドコーティングに精子が付着するため、運動性評価の精度に影響を与える可能性があることです。活性化ソリューションを使用すると、すべてのサンプルではありませんが、多くのサンプルでこの問題が克服されるため、信頼性と一貫性を確保するために、プレーンスライドを使用して運動性について別のCASA分析を実行することをお勧めします。Maklerカウンティングチャンバーを使用すると、濃度と運動性を別々に分析する必要がなくなり、濃度測定の精度が向上する可能性があるため(図2)、現在のプロトコルでの使用をお勧めします。この濃度測定の不一致を考えると、以前に報告された²⁰の所見では、スライドの詳細を精子の品質データとともにデータベースに常に記録し、可能な限り、バッチ間の変動を最小限に抑え、精子の信頼性の高い計算を保証するために使用されるチャンバースライドのタイプ、つまり受精のための卵子比を一貫して行うことが重要です。

本明細書に記載の半自動プロセスは、サンプルのバイオセキュリティと品質を維持しながら、絶滅危惧種のサンゴからの精子の凍結保存とバイオバンクのための標準化された効率的な経路を提供します。記載されているプロトコルは、絶滅を防ぎ、現在および将来のサンゴ礁の回復努力に利用可能なリソースを最大化するために不可欠となる凍結保存を使用して既存のサンゴの多様性を確保するために取り組んでいる世界中のプログラムで実装するのが簡単で比較的安価です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovation ALI-Q 2 VS ピペットコントローラー - 分注ピペット	Vistalab	2100-1005	流体の取り扱い – 精子量の測定、凍結保護液の添加、クライオバイアルへのサンプルの分注
5 mL 血清ピペット (バルク)	Thermo Scientific	Nunc 170355	流体処理 – 精子量の測定、凍結保護液の添加、凍結バイアルへのサンプルの分注
10 mL 血清ピペット (バルク)	Thermo Scientific	Nunc  170356	流体処理 – 精子量の測定、凍結保護液の添加、クライオバイアルへのサンプルの分注
P2 0.2–2 &マイクロ;Lピペッター	ギルソンF144054M		集中力と運動評価のための精子活性化溶液と精子サンプルの取り扱い
P10 1–10 µLピペッター	ギルソン	F144055M	精子活性化溶液の調製と集中力と運動評価のための精子サンプルの取り扱い
P20 2–20 µLピペッター	ギルソン	F144056M	集中力と運動評価のための精子活性化溶液と精子サンプルの取り扱い
P200 20–200 µLピペッター	ギルソン	F144058M	精子活性化溶液の調製と集中力と運動評価のための精子サンプルの取り扱い
P1000 100–1000 &マイクロ;Lピペッター	ギルソン	F144059M	精子活性化溶液の調製と、濃度および運動評価のための精子サンプルの取り扱い
真空ポンプ	ミリポア	WP6122050	溶液調製のためのろ過海水の調製
再利用可能なボトルトップろ過システム	Thermo Scientific	DS0320-5045	溶液調製
のためのろ過海水の調製0.22-&マイクロ;mフィルターディスク、混合セルロースエステル	メルクミリポア	GSWP04700	溶液調製のためのろ過された海水の調製
ろ過された海水	N/A	–	精子活性化および凍結保護溶液のベース培地
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	精子凍結保存のためにろ過された海水中の最終濃度10% v/vで使用される凍結保護剤
カフェイン	Sigma-Aldrich	C0750	精子の運動性を活性化するために使用されます
BSA熱ショック画分	Sigma-Aldrich	A9647	CASAウェルスライド15mLチューブへの精子の付着を最小限に抑えるために使用されます
	科学的	339651	精子活性化溶液の調製
50mLチューブラック	Thermo Scientific	339653	配偶子束およびろ過された精子サンプルの収集用
トランスファーピペット	Thermo Scientific	Samco 202PK	水面からの配偶子束の収集を支援するため
100-µm フィルターバスケット	フィッシャーサイエンティフィック	22363549	精子サンプルの分離中に卵子を除外するには
エッペンドルフラック	インターパス	511029	濃縮と運動評価のための精子の希釈と活性化
エッペンドルフ 1.5mLチューブ	エッペンドルフ	30120086	濃縮と運動評価のための精子の希釈と活性化
ガラスカバースリップ 18x18 mm	ブランド	4700 45	位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価
プレーンガラススライド、洗浄済み、75x25 mm	コーニング	2947	位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価
血球計算盤	Hausser Scientific	1492	位相顕微鏡を用いた精子の濃度と運動性の評価
CASAスライド (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B)	IMV Technologies	025107	Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA)	IVFStore	SM-373	Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads	Hamilton-Thorne	710111	Computer Assisted Sperm Analysis(CASA)を使用した精子の濃度と運動性の評価CASA
システム+ラップトップ	Hamilton Thorne	Ceros II	、Computer Assisted Sperm Analysis(CASA)を使用した精子の濃度と運動性の評価です。
			DMSOおよび液体窒素を取り扱うときに使用するための個人用保護具
白衣 長	袖、全長	–	DMSOおよび液体窒素を取り扱う際に使用する個人用保護具
クライオグローブ(ペア)	Tempshield	Mid-Arm	DMSOおよび液体窒素を取り扱う際に使用する個人用保護具
中型鉗子	汎用	–	凍結保存されたサンプルをクライオラックから取り出し、液体窒素中のサンプルを操作するため
バーコードスキャナー(2D対応)	Zebra	DS2278	サンプル管理用のクライオバイアル上の1Dおよび2Dバーコードの読み取り用
2.0 mL CryoStorage Vial、外部スレッド、キャップ済み、2D SafeCode(DataMatrix/ECC200)、線形および人間が読める	Eppendorf	30079434	精子サンプルの凍結保存のためのバーコード付きクライオバイアル
	Simport	T315	凍結バイアルを保持するラック、ロックベース付き、片手でデキャッピング
キャッピング 冷凍ラック	カスタム	–	サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid	Custom	–	サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container	Isosteel	VA-9683	サンゴの精子用にカスタム設計された凍結保存システムで、3Dプリントされたすぐに入手できるコンポーネントを利用しています。部品リストと組み立て説明書は、Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers	Generic	–	凍結保存前の凍結保護剤の平衡化のタイミングに
窒素浴 9L	BelArt	M16807-9104	凍結保存中にサンプルを急冷し、選別および取り扱い中にサンプルを保持するため
熱電対データロガー-マルチチャンネル	オメガ	HH520	凍結速度とエンドポイントを決定するための凍結保存中の温度監視
熱電対プローブ –タイプK	オメガ	5SC-TT-K-30-36	凍結速度と終点を決定するための凍結保存中の温度監視
クライオペン/カラーパーマネントペン	ステッドラー ルモ	カラー318	サンプル管理を支援するためにクライオバイアルの蓋をマーキングするためのオプション
ドライシッパー-充電された	テイラーウォートン	CXR100、またはCX500	凍結保存されたサンプルをフィールド/収集サイトからバイオレポジトリに移すため貯蔵