Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

Summary

この論文では、生きた線虫の内因性標識カーゴの軸索輸送を単一ニューロン分解能で視覚化するための蛍光顕微鏡取得パラメータの最適化について説明しています。

Abstract

軸索輸送は、軸索タンパク質をニューロン細胞体内の合成部位から軸索の目的地に送達するための前提条件です。その結果、軸索輸送の喪失は、ニューロンの成長と機能を損ないます。したがって、軸索輸送を研究することで、神経細胞生物学の理解が深まります。CRISPR Cas9ゲノム編集の最近の改善により、軸索カーゴの内因性標識が利用可能になり、異所性発現に基づく輸送の可視化を超えることが可能になりました。しかし、内因性ラベリングは、シグナル強度が低いという代償を払うことが多く、堅牢なデータを取得するための最適化戦略が必要です。ここでは、アクソナルトランスポートの可視化を最適化するためのプロトコルについて、取得パラメータと、拡散性細胞質バックグラウンド上の内因性標識カーゴのシグナルを改善するための漂白アプローチについて説明します。私たちは、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きRAB-3で標識されたシナプス小胞前駆体(SVP)の可視化を最適化するために、当社のプロトコルを適用し、取得パラメータの微調整により 、線虫(C.エレガンス)の内因性標識軸索カーゴの分析をどのように改善できるかを強調しています。

Introduction

ニューロンは生涯を通じて、タンパク質、脂質、その他の分子を細胞体から軸索の最終目的地に送達するために、軸索輸送に依存しています。その結果、軸索輸送の障害は神経機能の喪失と関連しており、神経変性疾患の病理に関与することがよくあります^1,2。したがって、軸索輸送の根底にあるメカニズムを理解することは、非常に興味深いことです。

軸索輸送に関する数十年にわたる研究により、この輸送を媒介する分子機構、その組成、および調節メカニズムに関する多くの重要な洞察が明らかになりました。長距離の軸索輸送は、微小管細胞骨格上で起こり、これは部分的に重なり合った微小管ポリマーで構成されており、通常は軸索³にプラスエンドが配向しています。その結果、順行性輸送は、微小管のプラス端であるキネシンに移動するモータータンパク質によって媒介されますが、逆行性輸送はマイナス端指向性ダイニンモーターに依存します。輸送の多くの側面が明らかにされていますが、多くの軸索タンパク質については、それらがどのように輸送機構にロードされ、個々の輸送パッケージがどのように組織化され、この輸送がどのように制御されているかはまだ不明です³。

軸索輸送は、放射性標識アミノ酸を体細胞コンパートメントに注入し、そこで新生の内因性タンパク質に取り込まれ、オート^{ラジオグラフィー4}によって軸索コンパートメント内で経時的に追跡できる放射線標識実験で最初に研究されました。放射性標識実験により、 in vivoでの内因性タンパク質の軸索輸送の研究が可能になりましたが、個々の貨物の挙動を直接追跡してメカニズムの洞察を得ることはできません⁴。この制限は、蛍光顕微鏡の使用によって克服されました。しかし、軸索輸送は、内因性タンパク質では可視化されず、蛍光標識コピーの発現によって可視化されることが多い。特に低発現タンパク質の場合、過剰発現はより高いシグナル強度を提供し、できれば単一ニューロンの分解能での可視化を可能にします。さらに、蛍光タグ付きタンパク質の異所性発現は、ゲノム編集の必要性と課題を回避します。逆に、異所性に発現した貨物の挙動は、内因性貨物^の挙動とは異なる場合があると主張されてきた5。

近年のゲノム編集の改良により、内在性ラベリング戦略へのアクセスが容易になりました。したがって、シグナル強度が低いことは、内因性標識の代わりに異所性発現による貨物の軸索輸送を研究するための主要な制限となっています。内因性ラベリング戦略を慎重に検討し、取得条件を最適化することで、この課題を克服できます。

線虫は、その透明性と遺伝子操作の容易さにより、 in vivo での軸索輸送を研究するための優れた研究モデルを提供します。このプロトコルでは、生きている 線虫 の単一ニューロン分解能で内因性タンパク質の軸索輸送を視覚化する研究戦略について説明します。Jorgensen Lab⁶によって生成された株を使用して、シナプス小胞前駆体の軸索輸送を視覚化します。この株では、小胞に関連するRAB GTPaseであるRAB3が運動ニューロンDA9で内因的にGFPで標識されています。このプロトコルは、さまざまな取得パラメータと光退色における小さな適応が、個々の輸送イベントの視覚化をどのように改善できるかを問うことで、イメージング条件を最適化する方法についてのアイデアを提供します。

Protocol

生細胞イメージング用の線虫の維持および調製方法に関する詳細なプロトコルについては、S.Niwa ⁷の研究を参照してください。

1. ワーム株の生成

Caenorhabditis Genetics Center(CGC)⁸ では、線虫株の作製に加えて、ウェブページから直接入手できる蛍光タグ付きタンパク質を内因性に付与した線虫株のコレクションを増やしています。

1. 蛍光標識法の選択
   1. rab-3(ox699)対立遺伝子⁶を含む線虫株MTS1161を用いて、DA9運動ニューロン内のRAB-3と標識された内因性GFPを可視化します(株はCGCに沈着します)。他の軸索タンパク質を可視化するには、Mello Lab⁹のCRISPR Cas9編集プロトコルを使用して、内因性タグ付きタンパク質を持つ線虫株を作製します。
      注:MTS1161は、組換えアプローチを利用して、RAB-3をGFPタグ⁶で細胞特異的に標識します。一般的な代替アプローチは、分割蛍光タンパク質の再構成に基づいており、これは、複数の分割蛍光^コピー10を使用することにより内在性タンパク質当たりの蛍光コピー数を増強するため、特に低発現タンパク質に推奨される。コピー数は、CenGenのウェブページ(https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/)¹¹のトランスクリプトームデータセットに基づいて最初に推定できます。
2. 軸索輸送を視覚化するためのニューロンの選択
   1. ひずみMTS1161で、運動ニューロンDA9のRAB-3を視覚化します( 図1を参照)。他の軸索カーゴ、特に低発現タンパク質については、CenGenのウェブページを使用して、分析したタンパク質の発現レベルが最も高いニューロンを特定します。
      注:CenGenプロジェクト(cengen.org)は、線虫の神経系^12,13の302ニューロンすべてを網羅する大規模なトランスクリプトームデータセットに基づいて、線虫の多くのニューロンにおける関心のあるタンパク質の発現レベルを推定するための優れたオンラインリソースを提供する。

2. ワームの取り扱いとイメージングの準備

1. 線虫増殖培地プレートに播種した細菌(株:OP50)を20°Cで播種し、成体期まで1日齢まで成長させた昆虫(株:OP50)の芝生に線虫を飼育してイメージングします。
   注:輸送速度は、異なる軸索貨物、ニューロンクラス、および生物14,15,16,17,18-幼虫期L4または成人期の1日で一貫して老化とともに減少するため、定義された年齢段階での軸索輸送を測定することは重要ですほとんどの論文で使用され、したがって、比較のための最大のデータセットを提供しています。
2. 生細胞イメージング用の線虫の準備:実体顕微鏡で後続のすべてのステップを実行して、線虫を視覚化し、取り扱います。
   1. 白金線ピックを用いて線虫を0.5 mMレバミゾールの液滴に移し、液滴中で線虫を20分間インキュベートする。
   2. ヘアピックを使用して、レバミゾール液滴からの10〜20個の線虫を、スライドガラス上の10%アガロース(M9培地に溶解)パッチ上のM9培地の12μL液滴に慎重にマウントします。10%アガロースパッチの作り方の詳細な手順については、S.Niwa⁷のプロトコールを参照してください。
      注:動物が低酸素症に苦しみ始める前に、スライドごとに数匹の動物しか画像化されないため、線虫の数を少なくするだけで十分です。
   3. 液滴(22 mm x 22 mmまたは18 mm x 18 mm)の上にカバースリップを置きます。DA9軸索でのイメージング輸送のために、軸索をカバースリップの近くに配置します。これを行うには、寒天パッチの上に置いた後、カバースリップを45°回転させて、動物を背中に転がします。
   4. カバースリップとスライドガラスの間のスペースをワセリンのような粘性のあるゲルで密封します。これにより、アガロースパッチが乾燥するのを防ぎ、線虫がイメージングフィールドから漂流する可能性があります。
      注:動物をできるだけ優しく扱うことが重要です。高濃度のレバミゾールまたはワームへの物理的損傷は、軸索輸送を損なう可能性があります。イメージングセッション中の尻尾の軽度のけいれんは、動物が健康な状態を維持していることを示す良い兆候です。動物は健康を保ち、イメージングセッション後にアガロースパッチから回復することさえできます。

3. 生細胞顕微鏡

注:正確な取得パラメータ値は顕微鏡によって異なる場合があります。ただし、各取得パラメータの傾向は、使用する顕微鏡とは無関係である必要があります。このプロトコルでは、漂白用の別のレーザーラインを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用しました(顕微鏡の詳細については 、材料の表 を参照)。緑色蛍光を488 nmレーザーで励起し、ET525/36蛍光フィルターで蛍光をろ過しました。漂白は488nmのレーザーラインを用いて行った。

1. 部屋の温度、または温度制御されたステージが利用可能な場合は、一定の温度に設定されていることを確認します。線虫の場合は、温度を20°Cに設定します。
2. スライドを取り付け、倍率4〜20倍の対物レンズを使用して、スライド上の線虫を特定し、位置を記憶します。画像取得のために63倍倍レンズに切り替えます。
3. 1枚の画像を撮影して、初期取得パラメータを確認します。視野内の信号強度を、アクイジションソフトウェアの強度ヒストグラムで追跡します。強度値は、カメラが検出できる最大信号の下限 3 分の 1 をカバーする必要があります。ピクセルの飽和を避けます。信号強度が低すぎる場合は、励起レーザーの強度を上げます。
   注:タイムラプス中に蛍光タンパク質を漂白するため、励起レーザー強度が高すぎる場合は使用しないでください。
4. ここで取得パラメータと手順を変更して、蛍光シグナル検出を最適化します。
   1. 漂白ステップの実施:漂白ステップの488nmレーザー(出力:15mW)ラインを使用して、分析する軸索の領域を漂白します。漂白効率90%以上を目指してください。漂白ステップの前後の領域の信号強度を比較することにより、漂白効率を決定します。
      注:漂白は、静止した粒子に由来するシグナルと、バックグラウンドのタンパク質の細胞質画分に由来するシグナルを低下させることにより、移動する粒子のシグナルを強化します。シナプス小胞前駆体上のRAB-3などの膜性貨物は、細胞質分画が低いため、漂白ステップは細胞質バックグラウンド上の輸送パッケージのシグナルをわずかに改善するだけです(図2A、D)。ただし、漂白により、個々の輸送イベントの長距離追跡が向上し、一時停止時間を定量化できます(図2A)。
   2. ビニング: 2 x 2 ビニングを使用して、個々のトランスポートイベントの信号強度を強化します。ビニングは、ピクセル配列を 1 つの大きなピクセルに結合します。これにより、空間分解能は低下しますが、個々の輸送イベントの信号強度が向上し、特に薄暗い粒子に役立ちます(図2B、D)。
   3. 露光時間:露光時間を長くして、信号強度を高めます。露光時間を長くすると、サンプルの信号強度が向上し、輸送イベントの時間分解能が低くなります。ここでの実験では、連続する時点間(100〜500ミリ秒の露光時間)で300ミリ秒から700ミリ秒の時間分解能を使用して、RAB-3の個々の輸送イベントを追跡します。(図2C、D)
5. タイムラプス録画:タンパク質のシグナル強度と個々の輸送イベントの頻度に応じて、少なくとも1〜3分のタイムラプスを撮ります。タイムラプスが記録されたら、次の動物に移動します。スライド上の動物は、記録された動物が健康な状態にあることを確認するために、30分を超えて画像化しないでください。
   注:録音中の動物の尻尾の軽度のけいれんは、動物がまだ生きていることを示しています。

4. 軸索輸送データの解析

注:後続の画像分析手順には、ImageJ / Fiji¹⁹ を使用します。フィジーは、すべての一般的な顕微鏡ソフトウェアパッケージでデータを読み取ることができます。

1. キモグラフ生成
   1. データのインポート:タイムラプスデータファイルをフィジーにインポートします。データをフィジーにインポートできない場合は、ソフトウェアパッケージからタイムレコーディングをtiffファイルとしてエクスポートし、後でフィジーにロードします。
   2. ドリフト補正:画像取得中に動物/軸索セグメントが移動したか、わずかにドリフトしたかを確認します。プラグインStackReg²⁰を実行して、動物の動きや漂流を修正します。プラグインを実行するときは、 リジッドボディ 変換を選択します。
   3. キモグラフの手動生成: 図3に詳細なステップバイステップの手順を示します。ドリフト補正動画を利用してキモグラフを生成します。Segmented Line(セグメントライン)ツールを使用し、セグメント化されたラインアイコンをマウスの左ボタンでダブルクリックして、分析する軸索セグメントに沿って線を描画し、軸索の直径に合わせて線幅を調整します。ImageJ/FijiプラグインのKymoreslicewideを実行してキモグラフを生成し、パラメータ設定の線の幅方向の最大強度値を利用します。
      注:線画方向の一貫性を保つ(たとえば、常に近位から遠位軸索または逆方向)と、キモグラフでの後方移動方向をトレースすることが容易になります。
2. トランスポートパラメータの分析
   1. 後続の手順に従って、キモグラフから輸送パラメータ(イベント番号、速度、実行距離、一時停止時間)を計算します。
      1. キモグラフでの輸送イベントのトレース: [直線] ツールを使用して、キモグラフ上の個々の輸送イベントをトレースします。各行をROIマネージャーに保存し、キモグラフですべての輸送イベントをトレースします。ImageJ/Fijiで次の測定パラメータを選択します:面積、バウンディング長方形、平均グレー値、フェレットの直径。
      2. トランスポートパラメータの計算:結果テーブルをスプレッドシートに貼り付け、結果セクションの次の列を使用して計算します。
         ランレングス:幅(ピクセル単位)にカメラの解像度(例:x μm/pxl)を掛けて、ランレングス(μm)をμm単位で決定します。
         Velocity: 実行時間/実行時間。移動イベントの持続時間を秒単位で求めるには、高さ(ピクセル単位)に連続する時間(例:x s/pixel)間の取得時間を掛けます。
         一時停止時間: 速度が 0 の 2 つの連続した動きの間の実行時間。
         イベント番号:イベントの合計をキモグラフの全長に正規化して、分あたりのイベント数と軸索長セグメントを決定できます。イベントは、さらに順行性輸送イベントと逆行性輸送イベントに分類できます。各移動イベントの方向性を決定するには、フェレット角度ツールを使用します。最初に近位から遠位にセグメント化された線を引くことによって生成され、キモグラフの前向性輸送イベントが右から左を指しているキモグラフでは、フェレット角度<90°は順行性イベントを示し、>90°は逆行性イベントを示し、それ以外の場合は逆になります。

Results

モデルシステムと測定手順の概要
シナプス小胞前駆体の軸索輸送を可視化するために、RAB-3と標識されたGFPを内因的に追跡しました。ここでは、最近生成されたGFP::Flip-on::RAB-3株⁶を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)の下でのリコンビナーゼFlippaseの発現がDA9運動ニューロンの内因性RAB-3を標識します。DA9は双極性運動ニューロンであり、その細胞体は動物の腹側後部、肛門の近くに位置しています(図1A)。それは、腹側神経索に沿って前方に走る短い樹状突起と、後方に走る長い軸索を含み、交連を形成し、次に背側神経索に沿って前方に走り、そこで背筋とVDニューロン22,23,24を神経支配するアンパッサンシナプスを形成します。シナプス後領域における軸索輸送を視覚化します。ほとんどのトランスポートイベントは、1つの焦点面でキャプチャできます(図1A)。この領域では静止した小胞の背景を減らすために、最初の光退色ステップが実施されますが、この領域ではしばしば一時停止する傾向があります(図1B)。タイムラプスビデオは3分以上にわたって記録され、アシナプス領域に沿ったRAB-3信号はキモグラフにプロットされて、個々の輸送イベントが抽出されます(図1C)。

軸索輸送の可視化を最適化するための取得パラメータの調整
多くの内因性蛍光タグ付きタンパク質のシグナル強度の低さを克服するには、顕微鏡の取得パラメーターを最適化する必要があります。輸送イベントの確実な定量化のためには、個々の輸送イベントのシグナル強度を、細胞質の背景または一時停止中の静止貨物上で可能な限り明るくする必要があります。シナプス小胞前駆体は、しばしば異なる小胞プールのシナプス上領域で一時停止し、新しい入ってくる小胞の検出を妨げ、それらの輸送痕跡をたどることを困難にします⁷。

最初の蛍光漂白ステップを1回行うだけで、小胞プールから得られる蛍光シグナルを大幅に低減し、新規の入ってくる小胞の移動検出を強化することができます(図2A)。漂白ステップは、RAB-3の細胞質画分が非常に低いためと思われる、細胞質バックグラウンド強度上を移動するRAB-3小胞のシグナルをわずかに増強しただけでした(図2D)。

ビニングを使用すると、ピクセルの配列を 1 つのピクセルに結合することで、個々のトランスポート イベントの背景上の信号を改善するための追加のレイヤーが提供されます。2 x 2ビニングでは、空間分解能が半分になり(ここでは108.33 nm/ピクセルから216.7 nm/ピクセル)、これは個々のRAB-3輸送粒子を追跡するのに十分ですが(図2B)、個々の小胞の信号強度が大幅に向上します(図2D)。非常に高い空間分解能が必要でない限り、ビニングは他の多くの軸索カーゴを視覚化するためにも使用できます。

次に、露光時間の変化が単一の輸送イベントの信号強度をどのように改善できるかを尋ねました。特に、その後のイメージング時点間で700ミリ秒の500ミリ秒の露光時間で最大500ミリ秒の露光時間でも、シナプス小胞前駆体を追跡できる時間分解能が得られることを実証するために、分析に露光時間を含めました(図2C、D)。

フィジーによるキモグラフの生成と解析
キモグラフを生成し、個々の輸送イベントを解析するには、 図 3 の手順に従います。

図1:内因性蛍光RAB-3の軸索輸送を可視化するモデルシステムの概要。 (A)上部パネル:示された前後軸および腹側背軸を有する線虫の概要。運動ニューロンDA9は青色とラベル付けされています。中央パネル:DA9コンパートメントが示されている上部パネルに示されているボックス化された領域を拡大します。アンパッサンシナプスは緑色で示されており、*は肛門を示しています。軸索は、外陰部を通過するまで背側神経索に続いていることに注意してください。赤いボックスは、シナプス異常領域の領域を示しています。下段:近位軸索の単焦点面における内因性GFP標識RAB-3の共焦点顕微鏡画像。シナプス異常領域には、より長い休止状態のRAB-3の小胞シンクがありますが、ほとんどのRAB-3シグナルはシナプス領域にクラスター化していることに注意してください。無シナプス領域は赤で囲まれています。スケール:20 μm. (B) 軸索輸送を視覚化するためのタイムラプス記録の代表的な画像。静止粒子上の個々の輸送粒子のトレーサビリティを強化するために、シナプス異常領域は最初に光退色されます。紫色のボックスで囲まれた領域の下部パネルは、順行性 (オレンジ色の矢印) と逆行性 (青色の矢印) 移動イベントの例を示しています。パネルは上から下に連続した時点を表します。(C)(B)のタイムラプス記録は、キモグラフ(位置上の時間を表す2D表現)としてプロットしました。対角線は、傾きが速度を示す移動イベントを表します。縦線は静止イベントを示します。紫色のボックスは、(B)にも示されている輸送イベントを強調するためのキモグラフの拡大表示で、順行性(オレンジ色)と逆行性(青)の輸送イベントが追跡されます。縦の破線は、一時停止しているイベントを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:取得ステップとパラメータを最適化して、内因性軸索貨物の視覚化を改善します。内因性GFP::RAB-3は、DA9軸索の非シナプスゾーンで視覚化され、共焦点回転ディスク顕微鏡で単一焦点面の画像を撮影しました。キモグラフは、順行性(右から左)および逆行性(左から右)方向(A-C)の個々の輸送イベントを視覚化するために取得されました。(A)キモグラフは、漂白ステップがない場合(左キモグラフ)または統合された漂白ステップがある場合のRAB3輸送イベントを示しています。漂白ステップにより、連続するトランスポート イベント (オレンジ色の矢印) 間の一時停止イベント (黄色の矢印で示される) の視覚化が向上することに注意してください。(B)2 x 2ビニングを実装すると、かすかなRAB3トランスポートイベントの信号強度を向上させるのに役立ちます。画像は300 msの露光時間で取得され、(C)露光時間を段階的に増加させる(左端の100 msから右端の500 msへ)ことで、個々の輸送イベントの信号強度が向上します。画像は、2 x 2ビニングで、最初の光退色ステップを使用して取得しました。すべてのキモグラフは合計 3 分間の持続時間を表示し、同じスケールで描画されるため、連続するイメージング ポイント間の時間経過が長いために取得タイム ポイントが少ないキモグラフは、キモグラフの全長が短くなります。(D)(A-C)のキモグラフからのバックグラウンド蛍光を差し引いた後の輸送イベントあたりの信号強度の定量化。ビニングとフォトブリーチステップは、300 msの露光時間で取得されたことに注意してください。100ミリ秒(n匹の_動物= 2でn_{個のイベント}= 27)、200ミリ秒(n匹の_動物= 2でn_{個のイベント}= 30)、300ミリ秒_(n匹の_動物で88匹= 6)、500ミリ秒(n匹の_動物でn_{個のイベント}= 12個= 1)、ビニングなしの300ミリ秒(n匹の_動物= 3でn_{個のイベント}= 31)、(w)ビニングで300ミリ秒(n匹の_動物= 6でn_{個のイベント}= 88)、および300ミリ秒のn個のイベントを使用した統計的比較、 漂白あり(n_匹の動物= 6のn_イベント= 88)および漂白なしの2 x 2ビニング。各データポイントは、ランダムに選択されたトレースに沿った単一の時点におけるバックグラウンド(軸索の細胞質)減算後の個々のRAB-3輸送イベントの信号強度を表します。露光時間は、Kruskal-Wallis検定を使用して比較し、続いてDunnの多重比較を行い、ビニングと写真の漂白をペアワイズMann-Whitney検定を使用して比較しました。エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:キモグラフを生成し、個々の輸送イベントを測定するための段階的な手順(A)ビデオ録画をフィジーにロードした後、セグメント化されたラインツールを使用して、分析される軸索セグメントの長さに沿ってラインをトレースします。(B)キモグラフ(右パネル)は、左パネルに示されているパラメータを使用してKymoreslicewideプラグインを使用して生成されます。(C)個々の輸送イベントは、リニアラインツールでトレースされ、ROIマネージャーに保存されます。右側のパネルには、結果テーブルの生成に使用される測定設定が表示されます。(D)テーブルの結果は、トランスポートパラメータの計算に使用されます。ボックスは、プロトコルのメソッド セクションで説明されている重要なパラメーターを示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

方法と代替方法の制限
このプロトコルでは、シナプス小胞前駆体に関連する内因的にタグ付けされたRAB-3の軸索輸送を視覚化するために、取得パラメータを最適化しました。RAB-3を可視化するために、最近発表されたFLIP-on::GFP::RAB-3株⁶を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)²⁵の下で組換えFlippaseを発現させた。この戦略により、RAB-3を単一のGFP蛍光色素で標識することができます。RAB-3は、シナプス小胞前駆体に高度に発現し、強く濃縮されているため、個々の輸送イベントは、細胞質の背景に由来する低いシグナルに対して明るいシグナル強度を持つため、比較的簡単に視覚化できます。他の軸索タンパク質では、輸送イベントの可視化を可能にするために、顕微鏡設定以外で追加の最適化戦略が必要になる場合があります。特に低発現タンパク質の場合、split-GFPシステムは優れた代替手段を提供します。このシステムでは、GFP₁₁が目的のタンパク質の内因性遺伝子座に挿入され、GFP_1-10が細胞特異的なプロモーターから発現されます。このシステムの大きな利点は、ゲノム的に挿入する必要があるDNA修復テンプレート(約70ヌクレオチド)のサイズが小さいことであり、これにより、蛍光タグ全体のORFを挿入する場合と比較して、相同組換えがより効率的になる^26,27。その小さいサイズのために、複数の_GFP11フラグメントを内因性タンパク質に挿入することができ、これにより、タンパク質当たりの再構成されたGFPフルオロフォアの数が増幅され、したがって、内因性タンパク質の、ひいては輸送パッケージ²⁸の蛍光シグナルが増強される。

スプリットGFPまたはGFPアプローチによるタンパク質の標識に加えて、それらの光化学的特性に関して独自の利点および欠点を有する他の遺伝的にコードされた蛍光色素を利用することができ、これらは最近比較されている²⁹。さらに、より光安定性の高い特性を有する化学蛍光色素は、目的のタンパク質をHALOまたはSNAPタグ³⁰で内因的に標識することにより使用することができる。

特に、軸索全体に豊富に存在する細胞質タンパク質の場合、条件付き標識アプローチが必要になるかもしれません。私たちは最近、このようなカーゴである内在性スペクトルを、時間的に制御された標識を用いた蛍光顕微鏡法により可視化し、新規に合成されたスペクトルタンパク質のみを可視化しました。単一ニューロン分解能による条件付き標識のために、我々は、リコンビナーゼの熱ショック駆動発現とスプリットGFPシステムを組み合わせた³¹。

研究目標がオルガネラの輸送を理解することを目的としている場合、オルガネラと会合するタンパク質ドメインの発現は、完全長タンパク質を異所的に発現する代替手段を提供できます。

プロトコルの重要なステップ
予想される発現レベルに基づいてタンパク質の可視化を最適化し、最適な標識戦略を選択するための慎重な調製は、内因性標識タンパク質の可視化を成功させるために特に重要です。多くのニューロンにおけるほとんどのタンパク質の発現レベルは、Cengen¹³のトランスクリプトームデータセットに基づいて推定できます。低発現タンパク質または細胞質タンパク質の輸送イベントの予想される低シグナル強度は、蛍光色素の複数のコピーを結合することで改善できます。ただし、標識実験では、タグ付きタンパク質の機能を損なわないように注意する必要があることに注意してください。対応する変異体に既知の表現型がある場合、標識によってこの表現型が生成されないことを確認することが重要です。表現型が知られていない場合は、ケースバイケースで異なる代替アプローチが必要です。

軸索輸送イベントのイメージングにおける重要なステップは、動物の健康状態です。動物は、画像調製時およびイメージング中にできるだけ穏やかに扱う必要があります(たとえば、麻痺した動物を移すために金属線の代わりにヘアピックを使用し、麻痺剤でのインキュベーション時間を最小限に抑え、光毒性を避けるためにイメージング時間を最小限に抑えます)。

変更とトラブルシューティング
私たちは、内因性タンパク質の軸索輸送の可視化を最適化することを意図していますが、取得パラメータの最適化戦略は異所性発現タンパク質にも適用できます。特に、内在性発現レベルが低すぎて輸送イベントを視覚化できない場合は、タンパク質の異所性発現が代替手段を提供できます。

内因性標識タンパク質のシグナル強度が強いにもかかわらず、輸送イベントが記録されない場合、動物は不健康な状態にある可能性があります。これは、より穏やかな調製手順(例えば、麻痺剤でのインキュベーション時間を短縮するなど)で動物を顕微鏡用に調製することで解決できます。または、トランスポート イベントがまれであり、3 分間のビデオ録画ではイベントをキャプチャするのに十分でない場合があります。稀な輸送イベントの撮影は、ビデオ録画の期間を延長するか、画像化された動物の数を増やすか、または輸送イベントがより頻繁に発生する可能性のある異なる発達段階の動物を画像化することで最適化できます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アガロース	Sigma-Aldrich	A9539
カバースリップ(22 mm x 22 mm、No1)。ゴールドシールカバーガラス	トーマスサイエンティフィック	6672A14
レバミゾール	ChemCruz	sc-205730
顕微鏡:ニコンTi2倒立顕微鏡、横河CSU-W1ソラスキャンヘッド、ハマツオルカフュージョンBT sCMOSカメラ、ニコンCFIプランアポラムダ60x 1.4 NA油浸対物レンズ、ET525/36発光フィルター付き488nmのニコン光刺激スキャナー	ニコン		ニングディスク共焦点顕微鏡
NIS-elements AR	Nikon		Ti2用ソフトウェア
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	CGC(https://cgc.umn.edu/)にて預託いたします