方法論記事

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

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10.3791/66237

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2024年8月30日

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1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine

この記事について

サマリー

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

要約

網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。

概要

ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜1内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る1。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している2。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します3。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は、失われた光受容体およびニューロンを複製または再生する神経前駆細胞または幹細胞に分化することがある2,3,4。ミュラー細胞は、自己複製や分化のためのさまざまなレベルの可能性など、網膜幹細胞の特性を保持しています5,6。ミュラーグリア細胞は、神経栄養因子を産生し、神経伝達物質を取り込み、リサイクルし、イオンを空間的に緩衝し、網膜を恒常性に保つために血液網膜関門を維持する重要な網膜系統を有する7,8,9。このことは、網膜変性症に関連する疾患を治療するための細胞ベースの治療における有望なツールとしてのミュラー細胞の可能性を浮き彫りにしています。ミュラー細胞は、網膜全体に分布する主要なグリアであり、ニューロンと血管の両方につながっています。それらは重要な保護的役割を果たし、網膜細胞の生存率と安定性を維持するために不可欠な構造的および代謝的サポートを提供します。残念ながら、網膜からの初代ミュラー細胞単離に関する文献には、非常に少ないプロトコルが見つかっています10,11。

私たちは、マウス初代ミュラー細胞を確実に単離し、培養するための強化されたアプローチを紹介します。このプロトコルは、野生型C57BL/6マウスおよびトランスジェニックマウス12,13からMüller細胞を単離するために、我々のグループで使用された。このプロトコルには、性別の好みがない5〜11日齢のマウスが使用されます。細胞は最大4回継代されています。しかし、P4ではフラスコに付着しなくなり、健康な培養物を育てることが難しくなります。培養物は網膜色素上皮(RPE)細胞で汚染されていることが多いため、細胞株で追加の実験を行う前に、少なくとも1回は細胞を継代する必要があります。継代により、汚染物質からのさらなる分離が可能になります。したがって、提示されたプロトコルは、マウスMüller細胞を単離するための迅速かつ効果的な方法を提供し、その後、治療標的を研究し、網膜疾患の潜在的な治療法を評価するための信頼性の高いプラットフォームとして使用することができます14。

プロトコル

動物を用いたすべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠し、Institute for Animal Care and Use Committee(IACUC)およびオークランド大学のポリシー(プロトコル番号2022-1160)によって承認された動物プロトコルに従って行われました。

1. 培地と溶液の調製

  1. Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM、材料表の詳細)にペニシリン/ストレプトマイシンを1:1000の希釈で添加することにより、Müller細胞眼液を調製します。例えば、10 mLのDMEMには、10 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。
    注:これは調製されたシンプルな無血清培地です。また、細胞培養作業に使用する前に、培地全体を37°Cのウォーターバスで温めてください。
  2. DMEMに10%ウシ胎児血清(FBS、熱不活化)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、完全な初代ミュラー細胞増殖培地を調製します。たとえば、(500 mLのDMEM培地+ 50 mLのFBS+ 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン)。.
  3. 0.05% トリプシン-EDTA溶液をコラゲナーゼIVと200 U/mLの濃度で調製します(トリプシン-EDTAを使用して、計算された量のコラゲナーゼIV粉末を溶解し、必要な濃度に到達します)。

2. エヌクリーション

  1. IACUCガイドラインに従ってCO2 吸入を使用してマウスを倫理的に安楽死させます。
    1. 簡単に言えば、動物をCO2チャンバーに入れて、チャンバーvol / minの30〜70%の充填率で100%のCO2を導入し、マウスへの苦痛を最小限に抑えて2〜3分以内に意識を急速に失うという目標を達成する。
    2. マウスは若い年齢(~10日)であるため、適切な安楽死を確保するための二次的な方法として子宮頸部脱臼を行います。
  2. 作業領域を70%エタノールで滅菌した後、マウスを滅菌アンダーパッドに置きます。
  3. ピンセットの腕を目の後ろに置き、眼窩領域からそっと引っ張って眼窩領域から引き抜き、眼窩領域に5/45スタイルのピンセットで圧力を加えて眼球を摘出して眼球を伸ばします。
    注:解剖前に、解剖ツールを70%エタノールで滅菌し、続いてリン酸緩衝生理食塩水で滅菌します。
  4. 視神経がまだ目に接続されていることを確認し、眼球をゆっくりと摘出します。視神経(白いコードとして視覚的に識別される)を目の後ろに引っ張るようにしてください。
    注:この手順は顕微鏡下で実行する必要はなく、滅菌されたベンチで実行できます。

3.除核眼の治療

  1. 15 mLの遠心分離チューブをアルミホイルで覆い、チューブに10 mLのミュラー細胞眼液を入れます。
  2. 解剖した眼球をミュラー細胞眼液が入った15mLチューブに入れ、室温で一晩または約18時間放置します。
  3. 18時間後、眼液をデカンタし、2〜3 mLの温めた(37°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で眼を短時間すすいでください。
  4. PBSをデカントし、10mLのトリプシン溶液が入った100mmのシャーレに目を移します。(ステップ1.3で準備)。
    注:トリプシンは除核眼全体に使用され、解剖中の網膜層からの細胞分離を促進する解離剤として機能します。解剖された網膜には、RPE細胞を含む多くの細胞があり、これらは粘着性があり、ミュラー細胞培養を汚染する可能性が最も高い14。顕微鏡検査では、5日間の単離後(最初の培地交換中)に、RPE細胞がプレートから剥離して13個死んだことが明確に示されました。RPE単離に使用される培地はDMEM/F-12で、DMEM(ミュラー細胞単離に使用)とは異なる組成で、ピルビン酸ナトリウムと低グルコースが含まれています。
  5. ディッシュをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2で1.5〜2時間インキュベートします。
  6. インキュベート後、約5 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地が入った60 mmのシャーレに眼球を移します。

4. 解剖

注:この手順は、培養フードの無菌環境内で実行する必要があります。したがって、フードの表面を70%アルコールで徹底的に滅菌し、すべてのツールと解剖顕微鏡を滅菌することが不可欠です。ビデオは、視認性を高め、デモンストレーションの目的でボンネットの外で録画されたことは注目に値します。

  1. 滅菌したラボグレードの組織の小片を皿に入れて、解剖中の目を安定させます。解剖顕微鏡の下に目を置き、解剖を開始します。
    注:ラボグレードの組織を使用すると、液体で満たされた皿(完全なメディア)での目の操作が容易になり、正確な解剖が保証されます。
  2. バンナスのハサミとM5Sスタイルのピンセットを使用して、結合組織、外眼筋、視神経を切除します。
    1. M5Sスタイルのピンセットで目をつかみ、バンナスのハサミまたは注射器の針でオラセラータセクションを切開します。
      注:眼の前部と後部の間には、ora serrataと呼ばれる水色の円形の線があり、解剖中の正確な方向の目印として使用できます。
    2. M5Sスタイルのピンセットで切開部をつかみ、目の後部から角膜を引っ張るか引き裂きます。網膜の完全性が損なわれないように、少しずつ引っ張ります。
      注:これらの手順は、アイカップの後部(神経および色素性網膜)から目の前部(角膜、虹彩、およびレンズ)を取り除くためのものです。
    3. 網膜層の完全性を維持するために、神経網膜から網膜色素上皮をそっと引っ張って取り除きます。RPE層は通常粘着性があり、ニューロン網膜に付着しているため、神経網膜には、分離の純度を可能な限り確保するために、黒い斑点がないようにする必要があります。
    4. 解剖した神経網膜をプレートに集める前に細かく切ってから、プレート上の細胞が均一に広がるようにします。
  3. 4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地を含むT25フラスコに神経網膜を播種します。
  4. 最後に、フラスコをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。

5. ミュラー初代グリア細胞の培養

  1. 細胞の成長を促進するために、フラスコを3〜5日間動かさないでください。
  2. 5日目以降は培地を交換し、その後は細胞が90%コンフルエントになるまで1日おきに交換します。

6. ミュラー初代グリア細胞の継代

  1. Müller細胞培養培地を吸引し、続いてPBSで2 mLの洗浄を行い、PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTA(1x)を2 mL、またはプレートを覆うのに十分な量を加えます。
  2. 室温で5〜10分間インキュベートします。
  3. 顕微鏡下で細胞がプレートから剥離していることを確認します。次に、細胞懸濁液を回収し、予熱した4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地(ステップ1.2で調製)を回収チューブに加えます。
  4. 300 x gで7分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを10 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地に再懸濁します。細胞数は解剖した眼の数によって異なる可能性があるため、播種やインキュベーションの前に細胞を数えることをお勧めします。推奨される播種密度は、T75フラスコ中の3.0 x 106 セルです。
    注:細胞は最大4〜5回継代できます。ただし、最も一貫性のある実験結果は、1〜2回の継代後に見つかります。

7. 免疫蛍光

注:免疫蛍光プロトコールを使用して、ミュラー細胞の特異性を染色および検証します。ここでは、免疫蛍光プロトコルの簡単な概要を示します。このステップは、第1のパッセージ12の後に行われる。

  1. 細胞を細胞培養チャンバースライド(8ウェルチャンバースライドでウェルあたり30,000細胞)に播種します。
  2. 単離した細胞を、37°Cおよび5%CO2の完全ミュラー細胞培養培地(ステップ1.2で調製)で24〜48時間培養します。
  3. 培地を吸引し、細胞が80〜90%コンフルエントになったら、各ウェルに250〜300μLの1x PBSでチャンバースライドを洗浄します。
  4. スライドを各ウェル上の4%パラホルムアルデヒドの250-300μLで10〜15分間固定し、続いてPBS/TX-100で洗浄します(各5分/3x)。
  5. ブロッキングバッファーを37°Cで1時間加えます( 材料表を参照)。
  6. ブロッキング溶液を吸引し、次にMüller細胞に特異的な一次抗体を添加して、グルタミンシンテターゼとビメンチン5,12を使用して単離された細胞の純度を確認します。37°Cで3時間インキュベートします(150-200 μL/スライドの容量のブロッキングバッファー中の抗体濃度1:100-1:200を使用)。スライドをPBS / TX-100洗浄(各5分および10分)で洗浄します。
    注:これらの抗体は、ミュラー細胞を同定し、ミュラー細胞培養の成功と純度を確保するための特徴であるため、選択されました。
  7. 二次抗体(抗体濃度が1:1000の範囲のブロッキングバッファー、150-200 μL/スライド)を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。 その後、PBS/Triton X-100で3回(各5〜10分)洗浄します。
  8. DAPI封入剤を一滴塗布して核を標識し、スライドをカバースリップで覆います。カバースリップを置くときは気泡を避けてください。
  9. 蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、画像を撮影します( 資料の表を参照)。
    注:セルは、細胞を見つけるために10倍の倍率でex / em 359/461のDAPIで配置されます。倍率が高いほど細胞を捕捉できます。他の波長は、選択した色によって異なります。緑色(GFP)-ex/em 488/510。赤色(Cy3) - ex/em 555/569。

結果

単離されたMüller細胞の特異性、純度、およびバリア機能の検証
単離されたミュラー細胞の生存率、形態、および独特の性質を確認するために、細胞を光学顕微鏡で調べました。P0およびP1の画像が記録されました(図1A)。単離されたミュラー細胞のRPE細胞によるコンタミネーションをチェックし、その純度を確認するために、RPE細胞マーカーであるRPE65に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色(IF)を行いました。ヒト網膜色素細胞(ARPE-19)をポジティブコントロールとして使用した。RPE65で染色したRPE細胞(核染色は赤と青)を 図1B (下段)に示します。RPE65特異的抗体は、単離されたミュラー細胞を染色しませんでした(図1B、上パネル)。RPE65がARPE-19細胞(赤)を染色し、単離された細胞を染色しなかったという事実は、単離された細胞がRPE細胞ではないことを示しています。培地中のピルビン酸および低グルコースの存在は、RPE細胞の増殖に好ましくない条件を確立する。その結果、RPE細胞が汚染された場合でも、最終的にはフラスコから分離します。

さらに、単離された細胞の同一性を確認するために、Müller細胞特異的マーカーのMüller細胞免疫蛍光染色を使用して、Müller細胞の単離が成功したことを確認しました。ビメンチンと呼ばれる細胞骨格中間フィラメントタンパク質が使用されました12,13。さらに、網膜グリアミュラー細胞の重要な機能として、グルタミン酸とアンモニアの縮合反応を触媒してグルタミンを形成するグルタミンシンテターゼ(GS)も使用されました5。

まとめると、単離された細胞はRPE65に対して陰性(赤、図1B)、ビメンチン(緑、図1C)およびGS(緑、図1D)に対して陽性でした。IF染色により、単離されたMüller細胞の単離(純度と特異性)が成功したことが確認されます。図1Eは、ビメンチン(上段)およびGS(下段)のネガティブコントロールであり、抗体の特異性を確認している。

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図1:ミュラー細胞単離(純度と特異性)の検証 (A)継代の光学顕微鏡画像:継代ゼロ(P0)および(P1)形態。(B)RPE65免疫染色とDAPI核染色の併用。(C)高倍率でのDAPI核染色によるビメンチン免疫染色。(D)同高倍率でのGS免疫染色。(E)ビメンチンおよびGS抗体染色の特異性を確認するためのネガティブコントロール。スケールバー = それぞれ300 μm、300 μm、50 μm、20 μm、20 μm、50 μm、50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、最近の出版物1 2,13で使用した修正されたプロトコルに基づいています。手順は簡単ですが、ミュラー細胞の単離を成功させるには、特定の制限と基本的な要件を順守する必要があります。このプロトコルを最適化するための試行錯誤の回数が経った結果、その成功に影響を与える複数の要因が特定されました。

私たちの実験で観察されたように、理想的なマウスの年齢は、単離された細胞を最大4継代まで成長させるために5〜11日であることがわかりました。また、その文化は、どれだけ多くの目が孤立して培養されているかにも影響されます。単一の単離では、増殖および増殖するのに十分な数の細胞を得るためには、少なくとも2つの眼が必要です。もう一つの重要な側面は、除核とめっきの間の持続時間です。したがって、この手順は比較的迅速に実行する必要があります。眼組織の長時間の操作は、細胞がフラスコに付着して増殖する能力に有害な影響を与えることが観察されました。単離された細胞の近接性が増殖を促進するのに十分近くにあることを確認するために、T25フラスコの使用をお勧めします。最初の継代が行われたら、細胞をT75に播種することができます。また、単離および播種後、インキュベーターから組織培養フラスコを取り外すか、少なくとも5日間培地を切り替えることにより、細胞を乱さないでください。最後に、細胞は接着が止まるまでに約4回しか通過できません。この手順は簡単で簡単に実行できますが、マウスの年齢、細胞継代の数の制限など、いくつかの制限があります。

Müller細胞単離のプロトコルは多くありませんが、このプロトコルと利用可能なプロトコルにはいくつかの顕著な違いがあります5,14。まず、除核と隔離の間の時間は大きく異なります。他のプロトコルでは、核摘出後すぐに、通常は10分以内に解剖することが推奨されています。一方、現在のプロトコルでは、このプロトコルでの分離に最良の結果を提供したため、少なくとも 18 時間の休息期間が示唆されています。このプロトコルと他のプロトコルとのもう一つの大きな違いは、目が酵素で治療される点です。このプロトコルでは、結合組織や外眼筋の除去前であっても、解剖が行われる前に眼が治療されます。他のプロトコルは、酵素治療の前に網膜を目から分離します。さらに、酵素のレシピも異なります。このプロトコルでは、酵素溶液はトリプシンとコラゲナーゼIV型で構成されています。同様のプロトコルでは、パパインとDNaseが組織消化に使用されます。さらに、培養容器は異なり、このプロトコルは、最初の通過後にT25で培養し、次にT75で培養することを提案しています。他のプロトコルでは、ペトリ皿またはマルチウェルプレートを使用します。最後に、このプロトコルは、細胞増殖を促進するためにフラスコを(5〜7日間)乱してはならないことを示唆しています。一方、他のプロトコルでは、メディア交換は 1 日後に行われます。

開示事項

著者は、この記事の内容に関連することを宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立眼病研究所(NEI)、国立眼病研究所(NEI)基金R01 EY029751-04の支援を受けました。Sylvia B. Smith博士は、このプロトコルがMüller細胞単離のプロトコルに基づいて修正されたバージョンであるため、感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビーカー : 100mLKIMAX14000
コラゲナーゼ IV ワージントン LS004188
使い捨て目盛り付きトランスファーピペット:3.2mL滅菌13-711-20
DMEM(1X) Thermo Scientific 11885084Media が Mü を成長させます。LLER細胞 
シ胎児血清(FBS)gibco26140079完全なミュラー細胞培地用
グルタミンシンターゼ細胞シグナル伝達80636
Heracell VISO 160i CO2 インキュベーターThermo Scientific50144906
KimwipesKimberly-Clark34155
Luer-Lok 針付きシリンジ 21 G x 1 1/2 インチ、滅菌、使い捨て、3 mLB-D309577
マイクロ遠心分離管:2 mLGrainger11L819
Pen Strepgibco15140-122完全なMü用。ller細胞培養培地
酸緩衝生理食塩水(PBS)Thermo ScientificJ62851。AP
ポジティブ アクション ピンセット、スタイル 5/45Dumont72703-DZ
さみ アイリス スタンダード ストレート 11.5cmGARANA INDUSTRIES2595
Sorvall St8 遠心分離機ThermoScientific75007200
Stemi 305 顕微鏡Zeissn/a
サージカルブレード、#11、ステンレススチールBard-Parker371211
懸濁培養皿 60mm x 15mm スタイルCorning430589
組織培養皿 : 100x20mm スタイルCorning353003
トルネードチューブ: 15mLMidsciC15B
トルネードチューブ: 50mLMidsciC50R
ピンセット 5MS、8.2cm、ストレート、0.09x0.05mm チップDumont501764
ピンセット ポジティブ アクション スタイル 5、生物学的、デュモスター、ポリッシュ仕上げ、110 mm OAL電子顕微鏡 Sciences Dumont50-241-57
アンダーパッド、中程度: 23 インチ X 36 インチMcKesson4033
Vannas スプリング ハサミ - 2.5mm 刃先FST15000-08
ビメンチン invitrogenMA5-11883
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/aZeiss
Zen Blue 2.6Zeissn/a
ウリン は

参考文献

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