この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。
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この記事について
サマリー
要約
網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。
概要
ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜1内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る1。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している2。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します3。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は....
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プロトコル
動物を用いたすべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠し、Institute for Animal Care and Use Committee(IACUC)およびオークランド大学のポリシー(プロトコル番号2022-1160)によって承認された動物プロトコルに従って行われました。
1. 培地と溶液の調製
- Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM、材料表の詳細)にペニシリン/ストレプトマイシンを1:1000の希釈で添加することにより、Müller細胞眼液を調製します。例えば、10 mLのDMEMには、10 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。
注:これは調製されたシンプルな無血清培地です。また、細胞培養作業に使用する前に、培地全体を37°Cのウォーターバスで温めてください。 - DMEMに10%ウシ胎児血清(FBS、熱不活化)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、完全な初代ミュラー細胞増殖培地を調製します。たとえば、(500 mLのDMEM培地+ 50 mLのFBS+ 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン)。.
- 0.05% トリプシン-EDTA溶液をコラゲナーゼIVと200 U/mLの濃度で調製します(トリプシン-EDTAを使用して、計算された量のコラゲナーゼIV粉末を....
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結果
単離されたMüller細胞の特異性、純度、およびバリア機能の検証
単離されたミュラー細胞の生存率、形態、および独特の性質を確認するために、細胞を光学顕微鏡で調べました。P0およびP1の画像が記録されました(図1A)。単離されたミュラー細胞のRPE細胞によるコンタミネーションをチェックし、その純度を確認するために、RPE細胞マーカーであるRPE65に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色(IF)を行いました。ヒト網膜色素細胞(ARPE-19)をポジティブコントロールとして使用した。RPE65で染色したRPE細胞(核染色は赤と青)を 図1B (下段)に示します。RPE65特異的抗体は、単離されたミュラー細胞を染色しませんでした(図1B、上パネル)。RPE65がARPE-19細胞(赤)を染色し、単離された細胞を染色しなかったという事実は、単離された細胞がRPE細胞で.......
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ディスカッション
マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、最近の出版物1 2,13で使用した修正されたプロトコルに基づいています。手順は簡単ですが、ミュラー細胞の単離を成功させるには、特定の制限と基本的な要件を順守する必要があります。このプロトコルを最適化するための試行錯誤の回数が経った結果、その成功に影響を与える複数の要因が特定されました。
私たちの実験で観察されたように、理想的なマウスの年齢は、単離された細胞を最大4継代まで成長させるために5〜11日であることがわかりました。また、その文化は、どれだけ多くの.......
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開示事項
著者は、この記事の内容に関連することを宣言する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国立眼病研究所(NEI)、国立眼病研究所(NEI)基金R01 EY029751-04の支援を受けました。Sylvia B. Smith博士は、このプロトコルがMüller細胞単離のプロトコルに基づいて修正されたバージョンであるため、感謝の意を表します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ビーカー : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| コラゲナーゼ IV | ワージントン | LS004188 | |
| 使い捨て目盛り付きトランスファーピペット:3.2mL滅菌 | 13-711-20 | ||
| DMEM(1X) | Thermo Scientific 11885084 | Media が Mü を成長させます。LLER細胞  | |
| シ胎児血清(FBS) | gibco | 26140079 | 完全なミュラー細胞培地用 |
| グルタミンシンターゼ | 細胞シグナル伝達 | 80636 | |
| Heracell VISO 160i CO2 インキュベーター | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok 針付きシリンジ 21 G x 1 1/2 インチ、滅菌、使い捨て、3 mL | B-D | 309577 | |
| マイクロ遠心分離管:2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | 完全なMü用。ller細胞培養培地 |
| 酸緩衝生理食塩水(PBS) | Thermo Scientific | J62851。AP | |
| ポジティブ アクション ピンセット、スタイル 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| さみ アイリス スタンダード ストレート 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 遠心分離機 | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 顕微鏡 | Zeiss | n/a | |
| サージカルブレード、#11、ステンレススチール | Bard-Parker | 371211 | |
| 懸濁培養皿 60mm x 15mm スタイル | Corning | 430589 | |
| 組織培養皿 : 100x20mm スタイル | Corning | 353003 | |
| トルネードチューブ: 15mL | Midsci | C15B | |
| トルネードチューブ: 50mL | Midsci | C50R | |
| ピンセット 5MS、8.2cm、ストレート、0.09x0.05mm チップ | Dumont | 501764 | |
| ピンセット ポジティブ アクション スタイル 5、生物学的、デュモスター、ポリッシュ仕上げ、110 mm OAL | 電子顕微鏡 Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| アンダーパッド、中程度: 23 インチ X 36 インチ | McKesson | 4033 | |
| Vannas スプリング ハサミ - 2.5mm 刃先 | FST | 15000-08 | |
| ビメンチン | invitrogen | MA5-11883 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/aZeiss | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
参考文献
- Liu, Y., Wang, C., Su, G. Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration. J Ophth. 2019, 5743109(2019).
- Goldman, D.
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