このプロトコルはハイスループットのスクリーニングのアプローチを使用して蛍光性の染料の調査としてdihydroethidium (DHE)を使用して細胞内の活性酸素種(ROS)を量化する新しい方法を記述する。プロトコルは3つのhepatocellular癌腫のセルラインの細胞内の活性酸素種(ROS)の量的な査定のための方法を記述する。
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この記事について
サマリー
要約
活性酸素種(ROS)は、生理学的および病理学的プロセスにおける細胞代謝の調節において重要な役割を果たします。生理学的ROS産生は、増殖、シグナル伝達、アポトーシス、老化などの正常な細胞機能の空間的および時間的調節において中心的な役割を果たします。対照的に、慢性的なROSの過剰産生は、がん、心血管疾患、糖尿病など、幅広い疾患の原因となっています。したがって、正確で再現性のある方法でROSレベルを定量化することは、正常な細胞機能を理解するために不可欠です。細胞内のROS種を特徴付けるための蛍光イメージングベースの方法は、一般的なアプローチです。文献のイメージングROSプロトコルの多くは、2'-7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)色素を使用しています。しかし、この染料は、その使用法と解釈可能性に大きな制限があります。現在のプロトコルでは、ハイスループット設定で総ROS産生を定量化するための代替方法として、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光プローブの使用が実証されています。ハイスループットイメージングプラットフォームであるCX7 Cellomicsを使用して、ROS産生を測定および定量化しました。この研究は、HepG2、JHH4、およびHUH-7の3つの肝細胞がん細胞株で実施されました。このプロトコルはを含む細胞内のROSの評価にかかわるさまざまなプロシージャの詳細な記述を、含んでいる-DHEの解決の準備、DHEの解決が付いている細胞のインキュベーション、およびROSの生産を特徴付けるのに必要なDHEの強度の測定を提供する。このプロトコルは、DHE蛍光色素がハイスループット方式で細胞内ROS産生を特徴付けるための堅牢で再現性のある選択肢であることを示しています。ROS産生を測定するためのハイスループットアプローチは、毒物学、薬物スクリーニング、がん生物学など、さまざまな研究に役立つ可能性があります。
概要
活性酸素種(ROS)は、細胞内の正常な細胞代謝の一部として形成される、天然に存在する反応性が高く、時間的に不安定な化学ラジカルのグループです。ROSは、細胞で発生する正常な生理学的および生化学的プロセスの調節において重要かつ不可欠な役割を果たします1,2。細胞内のROS産生の主な原因は、正常な生体エネルギーサイクルの一部としてのミトコンドリア電子伝達鎖(ETC)経路からのものです。ROS産生の重要な追加源には、細胞内の細胞NADPHオキシダーゼなどの酵素反応が含まれます。食物分子(グルコースなど)の代謝は、ミトコンドリアマトリックスの酸化的リン酸化経路を介して起こります。ROS産生のベースラインレベルは、正常な生理学的細胞シグナル伝達プロセスを調節するために不可欠です。グルコース代謝シグナル伝達経路の一部である多くの重要なタンパク質分子(AktやPTENなど)は、細胞内のROSレベルに応答することが知られています。さらに、活性酸素は、キサンチンオキシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、ペルオキシソーム成分などのさまざまな細胞内酵素によって、細胞酵素経路の一部として産生されます1,2。天然のROSの発生源とは対照的に、生体異物、感染性病原体、紫外線、汚染、喫煙、放射線などの特定の環境要因も、細胞内の酸化ストレ....
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プロトコル
1. 細胞培養
- 試験細胞(HepG2、HUH7、およびJHH4肝細胞癌細胞)を96ウェルプレートに播種し、10,000細胞/ウェルの播種密度で、ウェルあたり200 μLの最終播種量で播種します。
- HepG2細胞を培養する前に、96個のプレートウェルをIV型コラーゲン(50 μg/mL)で室温(RT)で2時間コーティングします。ストックコラーゲンの固化を防ぐには、ストック溶液を氷に入れ、続いて目的の濃度に希釈プロセスを開始します。
- 2時間のインキュベーション期間後、余分なコラーゲンを吸引し、1x PBSでウェルを3回洗浄します。
- 加湿インキュベーター内で、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で37°C、5%CO2 濃度で一晩細胞を培養します。
- 翌日、または80%〜90%のコンフルエントに達したら、いずれか早い方で、細胞をH2O2(未処理、250μM、500μM、750μM、および1000μM)およびメナジオン(未処理、25μM、50μM、75μM、100μM)でそれぞれ30分間処理して、代表的な酸化ストレスを誘導する。
- あるいは、細胞内に酸化ストレスを誘発することができる目的の試験物質で細胞を試験することを選択します。
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結果
ジヒドロエチジウム(DHE)は、細胞内のROS状態に関する特異的な情報を提供するスーパーオキシド応答性蛍光色素です。DHE色素は、細胞質内で本質的に青色蛍光を発します。しかし、スーパーオキシドラジカルと相互作用すると、2-ヒドロキシエジウムに変換され、赤色の波長(>550 nm)の蛍光を発します(図1)。DHE色素は、細胞や核に容易に輸送されます。放出された蛍光は、多くのラボで一般的に利用可能な蛍光顕微鏡装置で視覚化できます。現在の研究では、複数の肝細胞癌細胞株(HUH7、JHH4、およびHepG2細胞)に対するDHE色素の有用性を、ROS種生成のプローブとして、ハイコンテントスクリーニングプラットフォームでテストしました。細胞を2つのROS生成剤((a)過酸化水素および(b)メナジオンで用量依存的に30分間処理し(投与の詳細については図2および図3を参照)、細胞に酸化ストレスを誘導し、続いて96ウェルプレートでDHE色素標識を行いました。H2.......
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ディスカッション
本研究では、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いたスーパーオキシド駆動の細胞内活性酸素種(ROS)産生を評価するプロトコルをハイコンテントスクリーニングシステム上に確立しました。文献で入手可能な現在のプロトコルの大部分は、ROS種を定量するための蛍光イメージングプローブとしてDCFH-DAを使用しています。しかし、複数の研究により、DCFH-DAは細胞内ROSの測定に理想的なプローブではないことが示されています。プローブとしてのDCFH−DAの不適性について仮定された種々の理由は、−(i)DCFH−DAはH2O2と直接反応を示さないため、細胞内のH2O2レベルを評価するための不適切な色素となる−(i)DCFH−DAはH2O2と直接反応を示さないため、細胞内のH2O2レベルを評価するための不適切な色素となる。(ii)OH.、NO2.、ONOO-などのいくつかの1電子酸化種は、DCFHをDCFに.......
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開示事項
著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。
謝辞
RKとRRGは、NIH NIGMS助成金P20 GM130422を通じて、UNM Center for Metals in Biology and Medicine(CMBM)からの助成金の支援を受けました。RRGは、NM-INSPIRES P30助成金1P30ES032755からのパイロット賞の支援を受けました。CX7 Cellomics装置のイメージング・コア・サポートは、NIHの助成金P20GM121176から資金提供を受けたAIMセンター・コアを通じて提供されました。シャリーナ・デサイ博士とリー・チェン博士には、CX7 Celomicsイメージング・プラットフォームの使用に関する技術的な問題について貴重なご支援をいただき、感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL遠心チューブ | VWR | 20170-038 | |
| 96ウェルプレート | コーニングコスター | 07-200-90 | |
| セロミクス CX7 | サーモフィッシャー | ||
| コラーゲン | アドバンスドバイオマトリックス | 5056 | |
| DHE(ジヒドロエチジウム) | サーモフィッシャー | D1168 | |
| DMEMの | シグマ | 6046 | |
| FBSの | VWR | 〒97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2細胞株 | ATCC | ||
| Hoechst | サーモフィッシャー | 33342 | |
| HUH7細胞株 | ATCC | ||
| 過酸化水素 | シグマ | 88597 | |
| JHH4細胞株 | ATCC | ||
| メナジオン | シグマ | M5625 |
参考文献
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
- Magnani, F., et al.
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再版と許可
