Method Article

B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)

DOI:

10.3791/66249

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December 15th, 2023

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13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

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B型肝炎ウイルス(HBV)DNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検出および定量は、HBV感染を診断およびモニタリングするための高感度で正確な方法です。ここでは、HBV DNA検出とサンプルのウイルス量測定のプロトコルを紹介します。

Abstract

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B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界中の肝疾患の重要な原因です。急性または慢性感染症を引き起こす可能性があり、致命的な肝硬変や肝臓がんに非常にかかりやすくなります。血液中のHBV DNAの正確な検出と定量は、HBV感染の診断とモニタリングに不可欠です。HBV DNAを検出する最も一般的な方法はリアルタイムPCRであり、ウイルスを検出し、ウイルス量を評価して抗ウイルス療法への反応をモニターするために使用できます。ここでは、IVDマーク付きリアルタイムPCRベースのキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なプロトコルについて説明します。このキットは、HBVゲノムの高度に保存されたコア領域を標的とするプライマーとプローブを使用しており、すべてのHBV遺伝子型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)を正確に定量できます。このキットには、PCR阻害の可能性を監視するための内因性内部コントロールも含まれています。このアッセイは 40 サイクル実行され、カットオフは 38 カラットです。 臨床サンプル中の HBV DNA を定量するために、5 種類の定量標準試料がキットに付属しています。この標準物質には、核酸検査用のHBV DNAに関するWHO第4国際 規格(NIBSCコード10/266)に照らして校正されたHBV特異的DNAの既知の濃度が含まれています。この標準試料は、HBV特異的DNA増幅の機能を検証し、検量線を作成するために使用され、サンプル中のHBV DNAの定量を可能にします。2.5 IU/mLという低濃度のHBV DNAをPCRキットを用いて検出しました。このキットは感度と再現性が高いため、臨床検査室での強力なツールとなり、医療従事者がHBV感染症を効果的に診断・管理するのに役立ちます。

Introduction

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B型肝炎ウイルス(HBV)は、オルソヘパドナウイルス属およびヘパドナウイルス科1に属する部分二本鎖DNAウイルスです。生涯にわたって持続する慢性感染症を引き起こし、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性があります2,3,4。世界保健機関(WHO)によると、2019年には推定2億9,600万人が慢性B型肝炎に感染し、毎年150万人が新たに感染しています5。

血清または血漿サンプル中のHBV DNAの同定と測定は、進行中のB型肝炎感染患者を検出し、抗ウイルス治療の有効性を評価し、治療の成功確率を予測するための貴重な方法として機能します6,7,8,9,10,11。ウイルス量が多いと....

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Protocol

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この研究には、ヒトの参加者や臨床サンプルは含まれていませんでした。使用された唯一の生物学的材料は、核酸検査用のHBV DNAに関する第4回 WHO国際基準(NIBSCコード10/266)でした。この規格は、個人情報や識別可能なデータを含まない、一般に入手可能な参考資料です。そのため、この研究には倫理的な承認は必要ありませんでした。

1. DNA抽出

  1. ヒト血清または血漿サンプルからウイルスDNAを抽出します。抽出したDNAは、PCRでさらに使用するまで-20°Cで保存してください。
    注:DNA抽出用の血清または血漿の推奨容量は500 μLで、溶出量は50 μLです。本研究では、ウイルス核酸抽出キット(材料表)を用いてウイルスDNAを抽出した。

2. リアルタイムPCR

  1. PCRを開始する前に、リアルタイムPCRキットのすべての試薬(表1)を室温(室温;15〜25°C)で解凍します。解凍したら、適度な速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離します。
  2. 反応調製
    1. 表2に従ってPCR....

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Results

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ヒト血漿/血清からHBV DNAを検出および定量するワークフローの概略図を 図1に示します。 図2に、HBVとICの両方について、標準2(PCとして使用)とNTCの増幅プロットを示します。 図3 は、HBV陽性サンプル、HBV陰性サンプル、およびPCR阻害サンプルの増幅曲線を示しています。NIBSCコード10/266の増幅曲線、HBVのCt値、および得られたHBV濃度(国際単位/マイクロリットル(IU/μL))を 図4に示します。キットの 5 つの HBV 標準試料すべての HBV ターゲットの増幅曲線と、その代表的な標準曲線を 図 5 に示します。検量線の傾きは-3.361、R2 は0.99996、効率は0.98です。5つのHBV規格すべてのICターゲットの増幅曲線を 図6

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Discussion

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NIBSC コード 10/266 には、サプライヤー情報21 に従って 9,55,000 mL のヌクレアーゼフリー水に再構成した場合、0.5 IU/mL の単位が割り当てられています。これは、高負荷のHBV陽性サンプルと見なすことができます。この研究で使用したウイルス量キットで測定したHBVウイルス量は6,65,900 IU/mLでした(図4)。DNA抽出キットのDNA抽出効率は100%ではないため、精製プロセス中に一部のDNAが失われることがよくあります。キットによって決定されたウイルス量は、試薬(NIBSCコード10/266)サプライヤーの割り当て値よりもわずかに低いですが、2つの値の間のlog10の差はわずか0.157であり、カットオフ値(0.5)22よりも小さいため、データは満足のいくものです。

このプロトコルで使用されるウイルス量キットは、 図7に示すように.......

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Disclosures

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著者らは、この研究で使用されたHBVウイルス量キットの製造元であるKilpest India Limitedと関係があります。

Acknowledgements

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技術支援をしてくれたPraveen氏、Kusum氏、Chandan氏、Isha氏、Rashmi氏、Babli氏、Shivani氏、Ankita氏、Shikha氏に感謝の意を表します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th WHOB型肝炎ウイルス国際標準 DNAののNIBSCコード:10/266B型肝炎ウイルス(HBV)DNAの第4回WHO国際標準は、HBV核酸増幅技術(NAT)で使用される二次参照試薬の校正に使用することを目的としています。
ABIリアルタイムPCR装置 サーモフィッシャーサイエンティフィックABI 7500;QuantStudio 5リアルタイムPCRマシンです 
HBV、HCV、HIVマルチプレックス 14/198NIBSCNIBSCコード:14/198これは、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)を含むNATアッセイ用の非常に低い陽性トリプレックス試薬です
QIAGENリアルタイムPCRマシンQiagenRotor-Gene QこれはリアルタイムPCRマシン 
TRUPCR HBVウイルス負荷キット Kilpest India Limited3B294これは、HBV DNA検出およびウイルス量決定のためにこの研究で使用されるリアルタイムPCRベースのキットです
TRUPCRウイルス核酸抽出キットKilpest India Limited3B214これは、NIBSC:10/266およびNIBSC:14/198からHBVウイルスDNAを抽出するために使用されるDNA抽出キットです
DNA

References

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  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....

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Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

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