B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)

Summary

B型肝炎ウイルス(HBV)DNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検出および定量は、HBV感染を診断およびモニタリングするための高感度で正確な方法です。ここでは、HBV DNA検出とサンプルのウイルス量測定のプロトコルを紹介します。

Abstract

B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界中の肝疾患の重要な原因です。急性または慢性感染症を引き起こす可能性があり、致命的な肝硬変や肝臓がんに非常にかかりやすくなります。血液中のHBV DNAの正確な検出と定量は、HBV感染の診断とモニタリングに不可欠です。HBV DNAを検出する最も一般的な方法はリアルタイムPCRであり、ウイルスを検出し、ウイルス量を評価して抗ウイルス療法への反応をモニターするために使用できます。ここでは、IVDマーク付きリアルタイムPCRベースのキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なプロトコルについて説明します。このキットは、HBVゲノムの高度に保存されたコア領域を標的とするプライマーとプローブを使用しており、すべてのHBV遺伝子型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)を正確に定量できます。このキットには、PCR阻害の可能性を監視するための内因性内部コントロールも含まれています。このアッセイは 40 サイクル実行され、カットオフは 38 カラットです。 臨床サンプル中の HBV DNA を定量するために、5 種類の定量標準試料がキットに付属しています。この標準物質には、核酸検査用のHBV DNAに関するWHO第4^国際 規格(NIBSCコード10/266)に照らして校正されたHBV特異的DNAの既知の濃度が含まれています。この標準試料は、HBV特異的DNA増幅の機能を検証し、検量線を作成するために使用され、サンプル中のHBV DNAの定量を可能にします。2.5 IU/mLという低濃度のHBV DNAをPCRキットを用いて検出しました。このキットは感度と再現性が高いため、臨床検査室での強力なツールとなり、医療従事者がHBV感染症を効果的に診断・管理するのに役立ちます。

Introduction

B型肝炎ウイルス(HBV)は、オルソヘパドナウイルス属およびヘパドナウイルス科¹に属する部分二本鎖DNAウイルスです。生涯にわたって持続する慢性感染症を引き起こし、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性があります^2,3,4。世界保健機関(WHO)によると、2019年には推定2億9,600万人が慢性B型肝炎に感染し、毎年150万人が新たに感染しています⁵。

血清または血漿サンプル中のHBV DNAの同定と測定は、進行中のB型肝炎感染患者を検出し、抗ウイルス治療の有効性を評価し、治療の成功確率を予測するための貴重な方法として機能します6,7,8,9,10,11。ウイルス量が多いと、肝硬変や肝がんなどの肝疾患の進行リスクが高まります^12,13。したがって、ウイルス量の正確な測定は、HBV感染の進行を追跡し、治療に関する決定に情報を提供するために重要です。

定量的リアルタイムPCRアッセイは、従来のPCR技術よりも感度が高く、ダイナミックレンジが広く、HBV DNAの定量精度が高い^14,15,16,17。血清または血漿サンプル中のHBV DNAを定量するための市販のリアルタイムPCRベースの分子診断キットがいくつか市場に出回っています。ここでは、市販のIVDマーク付きリアルタイムPCRベースキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なワークフローについて説明します。このキットは、広く使用されている^18,19、低コストでありながら高感度のアッセイであり、その性能特性は、他の市販のCEマーク付きキットに匹敵します¹⁸。HBV標的領域の増幅とは別に、内在性内部制御遺伝子もキットに含まれており、サンプルの品質、抽出されたDNAの品質、PCR増幅、およびPCR阻害の可能性を検証します。

Protocol

この研究には、ヒトの参加者や臨床サンプルは含まれていませんでした。使用された唯一の生物学的材料は、核酸検査用のHBV DNAに関する第4^回 WHO国際基準(NIBSCコード10/266)でした。この規格は、個人情報や識別可能なデータを含まない、一般に入手可能な参考資料です。そのため、この研究には倫理的な承認は必要ありませんでした。

1. DNA抽出

1. ヒト血清または血漿サンプルからウイルスDNAを抽出します。抽出したDNAは、PCRでさらに使用するまで-20°Cで保存してください。
   注:DNA抽出用の血清または血漿の推奨容量は500 μLで、溶出量は50 μLです。本研究では、ウイルス核酸抽出キット(材料表)を用いてウイルスDNAを抽出した。

2. リアルタイムPCR

1. PCRを開始する前に、リアルタイムPCRキットのすべての試薬(表1)を室温(室温;15〜25°C)で解凍します。解凍したら、適度な速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離します。
2. 反応調製
   1. 表2に従ってPCRミックスを調製する。添加する試薬の量は、サンプル数、標準試料、テンプレートコントロールなしに基づいて計算します。
      注:PCRミックスを調製する際には、各試薬の少なくとも10%の容量を追加する必要があります(例えば、10回の反応が必要な場合は、11回の反応について計算します)。
   2. 上記で調製したPCRミックス15μLを各PCRチューブにピペットでつなぎます。次に、抽出したサンプルDNAを15μL添加します。HBV DNAを検出するためのポジティブコントロール(PC)としてHBV用標準試料(HBV標準試料1-5)の少なくとも1つを15 μL、ネガティブコントロール(NC)としてPCRグレードのヌクレアーゼフリー水15 μLを加えます。HBV DNA の定量に必要な検量線を作成するには、キットに付属の 5 種類の定量標準試料(HBV 標準試料 1-5)をすべて PCR ランごとに使用します。
   3. チューブを閉じ、中程度の速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離してから、サーマルサイクラーに進みます。反応液中に気泡が入っていないことを確認してください(気泡は蛍光検出に干渉する可能性があるため)。
3. プログラムのセットアップ
   1. サーマルサイクラーは、 表3で推奨されているサイクル条件を使用してプログラムします。
4. チャンネル/蛍光色素の選択
   1. 表 4 に示すように、一般的に使用されるリアルタイム PCR プラットホーム用の蛍光色素を選択してください。
5. データ解析
   1. 実行が完了したら、線形スケールで増幅プロットを解析します。
   2. 閾値設定
      1. PCR反応の指数関数的相内の閾値を設定します。キットの推奨閾値を 表5に示します。しきい値の設定と一致します。アッセイに最適な閾値が決定されたら、特定のPCRマシンのすべてのサンプルに一貫して使用してください。これにより、結果が正確で再現性のあるものになります。
         注意: しきい値の設定が低すぎると、信号がノイズレベルを下回る可能性があり、Ct値は信頼できません。閾値の設定が高すぎると、シグナルが反応のプラトー相にあり、増幅効率が悪く、Ct値が不正確になる可能性があります。
   3. 期限
      1. キットを40回の増幅サイクルで実行します。38サイクルを超える増幅は考慮しないでください。
   4. 定性的な結果分析
      1. HBV DNAの定性検出にキットをご使用ください。標準 2 を PC として使用し、HBV では 20 ± 2、IC では 24 ± 3 の期待値を使用します。
      2. テンプレートコントロール(NTC)がHBVと内部コントロール(IC)の両方のターゲットで増幅を示さないことを確認します。NTC反応で増幅反応が起こると、試料のコンタミネーションが起きている可能性があります。
      3. アッセイのカットオフは 38 であるため、HBV 陽性サンプルとしての HBV ターゲットの 38 Ct より前の増幅を検討してください。すべてのコントロールが上記の要件を満たしている場合は、 表 6 に記載されている解釈に従って標本を検討してください。
   5. 定量的な結果分析
      1. 核酸増幅技術(NAT)²⁰ の HBV DNA に関する 4 番目の WHO 国際標準に照らして較正された、HBV 特異的 DNA の既知の濃度の 5 つの定量標準試料のセットを使用します(表 7)。
      2. これらの標準を使用して、検量線を生成します。検量線を利用して、未知サンプルのHBV DNAを定量します。
         注:リアルタイム PCR ソフトウェアは、5 つの標準試料すべての HBV ターゲットについて得られた Ct 値と、それに対応する国際単位/マイクロリットル(IU/μL)での濃度を使用して、検量線を生成します。
      3. 標準試料の傾きが -3.1 から -3.6 の間にあり、R² 値が 0.99 から 1.0 の間にあり、PCR 効率が 90%-110%(0.9-1.1)の間にあり、ネガティブコントロールに増幅がない場合にのみ、未知のサンプルの値を解釈します。
      4. ソフトウェアは、各HBV陽性サンプルの濃度をマイクロリットルあたりの国際単位(IU / μL)で計算します。ウイルス量(IU/μLから国際単位/ミリリットル[IU/mL]への変換)を計算するには、次の式を使用します。
         結果(IU/mL) = (結果 [IU/μL] x 溶出量 [μL])/サンプル量(mL)
         注:HBV DNAに関するWHO国際標準第4回NIBSCコード10/266は、0.5 mLの血漿からウイルスDNA精製用に抽出し、精製したウイルスDNAを50 μLの溶出バッファーに溶出し、5つのHBV標準およびNTCとともにPCRキットとともに参照サンプルとして使用しました。参照サンプル(NIBSC コード 10/266)の HBV ウイルス量は、(6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL として計算されました。

Results

ヒト血漿/血清からHBV DNAを検出および定量するワークフローの概略図を 図1に示します。 図2に、HBVとICの両方について、標準2(PCとして使用)とNTCの増幅プロットを示します。 図3 は、HBV陽性サンプル、HBV陰性サンプル、およびPCR阻害サンプルの増幅曲線を示しています。NIBSCコード10/266の増幅曲線、HBVのCt値、および得られたHBV濃度(国際単位/マイクロリットル(IU/μL))を 図4に示します。キットの 5 つの HBV 標準試料すべての HBV ターゲットの増幅曲線と、その代表的な標準曲線を 図 5 に示します。検量線の傾きは-3.361、^R2 は0.99996、効率は0.98です。5つのHBV規格すべてのICターゲットの増幅曲線を 図6

Discussion

NIBSC コード 10/266 には、サプライヤー情報²¹ に従って 9,55,000 mL のヌクレアーゼフリー水に再構成した場合、0.5 IU/mL の単位が割り当てられています。これは、高負荷のHBV陽性サンプルと見なすことができます。この研究で使用したウイルス量キットで測定したHBVウイルス量は6,65,900 IU/mLでした(図4)。DNA抽出キットのDNA抽出効率は100%ではないため、精製プロセス中に一部のDNAが失われることがよくあります。キットによって決定されたウイルス量は、試薬(NIBSCコード10/266)サプライヤーの割り当て値よりもわずかに低いですが、2つの値の間のlog10の差はわずか0.157であり、カットオフ値(0.5)²²よりも小さいため、データは満足のいくものです。

このプロトコルで使用されるウイルス量キットは、 図7に示すように...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHOB型肝炎ウイルス国際標準 DNAの	のNIBSC	コード:10/266	B型肝炎ウイルス(HBV)DNAの第4回WHO国際標準は、HBV核酸増幅技術(NAT)で使用される二次参照試薬の校正に使用することを目的としています。
ABIリアルタイムPCR装置	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ABI 7500;QuantStudio 5	リアルタイムPCRマシンです
HBV、HCV、HIVマルチプレックス 14/198	NIBSC	NIBSCコード:14/198	これは、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)を含むNATアッセイ用の非常に低い陽性トリプレックス試薬です
QIAGENリアルタイムPCRマシン	Qiagen	Rotor-Gene Q	これはリアルタイムPCRマシン
TRUPCR HBVウイルス負荷キット	Kilpest India Limited	3B294	これは、HBV DNA検出およびウイルス量決定のためにこの研究で使用されるリアルタイムPCRベースのキットです
TRUPCRウイルス核酸抽出キット	Kilpest India Limited	3B214	これは、NIBSC:10/266およびNIBSC:14/198からHBVウイルスDNAを抽出するために使用されるDNA抽出キットです