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方法論記事

半発酵無菌食によるAxenic Delia antiqua の飼育

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DOI:

10.3791/66259

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2023年12月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 2Agriculture and Rural Bureau of Changqing District

この記事について

サマリー

半発酵無菌食でアキセニック デリアアンティクア を飼育するための簡単な手順が説明されています。PCRを用いて、Axenic D. antiqua の各星から1つのボルバキア株のみが検出された。

要約

抈性昆虫は、無菌培地を使用した無菌人工飼育システムから得られます。これらの昆虫は、サイズが小さく、成長サイクルが短く、飼料要件が少ないことを特徴とし、微生物と宿主の関係を研究するのに理想的です。腸内細菌叢は宿主昆虫の生理学的特性に大きく影響し、特定の菌株を軸性昆虫に導入することで、腸内細菌の機能を検証する方法を提供します。双翅目、Anthomyiidae科、およびDelia属の脅威となる害虫である Delia antiquaは、主にタマネギ、ニンニク、ネギ、およびユリ科の他の野菜を食べます。幼虫は球根を食べ、植物全体を腐らせたり、しおれたり、枯れさせたりします。軸幼虫を飼育することで、腸内細菌叢が D. antiquaの成長と発達に及ぼす影響を観察するための追跡調査を行うことができます。抗生物質による関連微生物の除去を含む方法とは異なり、本稿では、アキセニック D.antiquaを飼育するための低コストで高効率なアプローチを紹介します。 D. antiqua 卵の表面殺菌後、半発酵無菌飼料を用いて幼虫を飼育し、培養依存性および培養非依存性アッセイにより D. antiqua の軸の状態を検証しました。結論として、昆虫の卵の滅菌と幼虫培養のための無菌飼料の調製の組み合わせにより、アキセニック D.アンティクアを得るための効率的で簡単な方法の開発が可能になりました。この方法は、昆虫と微生物叢の相互作用を研究するための強力なアプローチを提供します。

概要

生菌や寄生虫が検出されない動物として定義される軸動物は、宿主と微生物の相互作用を研究するための貴重な実験モデルです1,2。無脊椎動物の最大のグループである昆虫は、微生物と共生関係を形成することができます3。軸性昆虫は、共生系における宿主と共生生物の相互作用を研究するために使用できます4。例えば、西出ら5は、悪臭を放つ線虫Plautia staliの実用的な無菌飼育手順を確立し、モデル共生システムにおける宿主と共生生物の相互作用の信頼性の高い厳密な解析を可能にしました。扈虫は、卵期を殺菌し、幼虫と成虫に無菌の餌を与えることによって生産することができる6,7。扈虫は非常に重要であり、生物学研究で広く使用されています。例えば、Somervilleらが実施した研究では、エンテロバクター・クロアカエを接種したダイアモンドバック蛾がトランスジェニックオスの適応性を向上させることが実証されました。

Delia antiqua Meigenは、世界中のタマネギやその他のユリ科作物の経済的に重要な害虫であり、その幼虫はタマネギや他のユリ科作物の球根に損傷を与えます9。D. antiquaは主に温暖な気候で見られ、アメリカ大陸、ヨーロッパ、アジアのタマネギ栽培地域に広く分布しています。適切に管理しないと、タマネギ(Allium cepa L.)、ニンニク(Allium sativum L.)、エシャロット(Allium fistulosum L.)、ネギ(Alliumchoenoprasum L.)の作物が50%から100%の範囲で失われる可能性があります10,11。幼虫は植物の地下部分を食べ、この餌は苗を萎れさせ、やがて枯れてしまいます。さらに、損傷した植物は病原体の侵入を許し、球根の腐敗につながる可能性があります12。幼虫が完全に食べていなくても、幼虫が引き起こす被害により、タマネギは市場に出回らなくなり、経済的損失につながります。

昆虫は腸内細菌叢と密接に関連しており、ほとんどの昆虫の腸には、宿主が提供する栄養素で繁殖するさまざまな共生細菌が含まれています13,14。Jingら15は、腸内共生群集の主な機能は必須栄養素を提供することであり、消化と解毒に関連する機能が続くことを示しました。場合によっては、腸内細菌は害虫管理の目的で微生物資源として役立つ可能性があります。したがって、D. antiquaの体内における個々の腸内細菌の性能と特定の機能を研究することが望ましい。したがって、アキセン幼虫の調製は、特定の細菌株と昆虫との相互作用を研究するために特に重要である16。現在、昆虫の腸内細菌を除去するために一般的に使用されている方法は、関連する微生物を根絶するための抗生物質の組み合わせの使用です17,18,19。微生物の数を減らすことしかできない抗生物質のみを使用するのとは異なり、昆虫の軸飼育は微生物の組成と量を制御できるため、腸内細菌叢の機能をより正確に検証できます。

そこで、本稿では、アキセニック D.アンティクアを調製・飼育するためのプロトコルについて紹介する。アキセン幼虫の餌は、半発酵食品と組み合わせた自然飼料の高温殺菌を利用することによって得られます。卵は、軸卵を得るための実験プロトコルに従って滅菌され、最後に、軸子の幼虫が軸の卵から培養されます。アキセニック飼育システムは、実験のために1世代だけ実施されました。これは、昆虫と腸内細菌叢の相互作用を研究するのに便利です。

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プロトコル

D. antiqua はFanzhen、Taianの分野から得られます。

1.無菌食の準備

  1. ネギの外層をはがし、緑の葉を捨てます。ねぎの白い部分(図1A)を残し、滅菌水で洗い、すすぎプロセスを3回繰り返します。後で使用するために、75%EtOH溶液(ステップ2.5で説明)で滅菌したハサミ( 材料表を参照)を使用して、ネギの白い部分を1〜2cmのさいの目に切った部分に切ります。
  2. さいの目に切ったネギ50gの重さを量り、フードプロセッサーに入れます( 材料表を参照)。50mLの滅菌水を加え、それぞれ2分間、5回粉砕します。さいの目に切ったネギはすべて、ペースト状の粘稠度に粉砕する必要があります(図2A)。
  3. ピンセットを用いて、D. antiquaの第3幼虫10個を10mLの1x PBSを含む10mLの遠心チューブに移し、使い捨ての粉砕乳棒(材料表参照)で約5分間粉砕し、幼虫粉砕液を得る。
  4. ペースト状のネギ液と幼虫の粉砕液を清潔な500 mLのコニカルフラスコに注ぎます( 材料表を参照)。円錐形のフラスコの口を2層の透明なシーリングフィルムで包み、フラスコを振とうインキュベーター( 材料表を参照)に入れて、25°C、180rpmで12時間発酵させます(図2B)。
  5. 一辺10cmの正方形ガーゼを7層(無菌状態は不要)をハサミで切り取り、重ねて簡単なろ過装置を形成します。発酵させたネギ液をガーゼにゆっくりと注ぎ、ろ過した液体を新しい500mLのコニカルフラスコに絞り出します。ガーゼに残ったネギの残留物をスズ箔で包み、後で使用する。
  6. 前のステップで得られた濾液を、真空ポンプ( 材料表を参照)とBuchner漏斗を使用してろ過します。脱イオン水で濡らした濾紙をブフナー漏斗に置き、濾液を注ぎ、異なる濾紙で3回吸引濾過を行います。最終濾液を500mLのコニカルフラスコに集めます。
  7. 0.22μMのフィルターボトルと真空ポンプを用いて再度ろ過を行う。サクションフィルターフラスコのカバーを超クリーンベンチ( 材料表を参照)にねじ込み、さらに使用します。この時点で、発酵したネギ残渣と濾液が得られます(図2C)。
    注:このステップから得られたろ過された液体は無菌になります。(0.22μMフィルターボトルは、濾液を滅菌するための滅菌真空ろ過システムです)。
  8. 前の手順を繰り返して、未発酵のネギの残留物と濾液を取得します。ここでの違いは、発酵が不要なことです。
  9. 塩化コリン0.24gとL-アスコルビン酸0.56g( 材料表参照)を10 mL遠心チューブに入れて秤量します。3 mLの脱イオン水を加え、完全に溶解するまで激しく振とうします。ウルトラクリーンベンチで、新しい5 mLシリンジを使用し、3つの0.22 μMシリンジフィルター( 材料表を参照)を取り付けて溶液を滅菌し、後で使用するために滅菌済みの10 mL遠心チューブに入れます。
    注:塩化コリンは昆虫の成長に不可欠な神経伝達物質であり、L-アスコルビン酸は防腐剤として作用します。
  10. 寒天粉末2gとTSB6g( 材料表を参照)を秤量し、500mLのコニカルフラスコに注ぎます。次に、100 mLの脱イオン水を加えて培地を調製します。ガラス棒を脱イオン水ですすいだ後、それを使用して混合物をよく混ざるまで攪拌します。次に、2層の透明シールフィルムを使用して円錐形のフラスコを密封します。
  11. 発酵ネギと未発酵ネギ(ステップ1.5およびステップ1.8で記載)をアルミホイルで包み、培地とともにオートクレーブで121°Cで20分間滅菌します。
  12. 超クリーンベンチで、滅菌した塩化コリン、L-アスコルビン酸、滅菌濾液を静かに旋回させながら培地に注ぎ、完全に混合します。最後に、発酵したネギと発酵していないネギを加え、手で激しく振って無菌食を作ります。50 mLの遠心チューブ(滅菌済み、0.22 μMのPVDF疎水性メンブレン付きベントキャップ)( 材料表を参照)に斜めに飼料を注ぎます(図2D)。
    注:滅菌後、ネギやその他の材料を添加する際の急激な冷却と固化を防ぐために、培地の温度を65〜80°Cに維持する必要があります。その上、各チューブに、約10〜15mLの食事を注ぎます。飼料が固まったら、すぐに使用しない場合は、チューブを4°Cの冷蔵庫に保管してください。

2. 軸卵の獲得

  1. D. antiquaの実験室飼育システム
    1. 25°CのLED内部照明式インキュベーター(24時間サイクル、明暗比16:8)に飼育ケージを置き、雄と雌の成虫を飼育し、交尾して産卵できるようにします。ウォーターディスペンサー(図1B)に水を入れ、湿らせた脱脂綿で密封して大人に水を供給します。
    2. 35 mm x 12 mmのシャーレの底を4つ、94 mm x 16 mmのシャーレの蓋に入れます。脱脂綿をイオン水で濡らし、湿らせた脱脂綿をペトリ皿の底の2つに置き、脱脂綿の上に大さじ1杯のスクロースを加えます。
    3. 他の2つのペトリ皿の底に、成虫の餌となるスクロースと酵母エキス( 材料表を参照)を大さじ2杯入れます(図1C)。
      注意: ステップ2.1.2およびステップ2.1.3に記載されているスクロースおよび酵母抽出物は、滅菌する必要はありません。
    4. 湿らせた砂と根をはがさず、皮をむいたニンニクのクローブ(図1D)を入れた94 mm x 16 mmのシャーレの底をフライケージに入れて卵を集めます。メスはニンニクの匂いに惹かれ、その周りに卵を産みます。
  2. 卵の収集
    1. 産卵装置である、前述の砂とニンニクが入った94mm×16mmのシャーレ(ステップ2.14)をケージから取り出す。にんにくと一緒に砂を500mlのビーカーに注ぎ、水道水を使用してにんにくの残りの卵をビーカーに洗い流します。この時点で、卵は水に浮かんでいます。
    2. 100メッシュのふるい( 材料表を参照)を取り、水道水で湿らせます。次に、ビーカーから浮遊卵を含む水をふるいに注ぎます。卵はふるいに残ります。
    3. 卵がふるいで自然に乾いたら、ブラシを使用して卵をペトリ皿にそっと掃きます。
  3. 初日は、産卵装置を洗い流して、消毒や滅菌をせずに卵を採取します。2日目の午後4時に、卵を再び洗い流し、きれいな水でふるいにかけて集めます。
    注:2日目に卵を採取することは、その後の段階で一貫した成長率を確保するためです。午後4時が D. antiquaの産卵のピークです。したがって、この時点で卵を集めるのが理想的です。
  4. 採取した卵を、超クリーンベンチの滅菌細胞ふるい( 材料表を参照)に置きます(図3A)。
  5. 卵殺菌用の溶液を準備します
    1. 5 mL の 5.2% NaClO ( 材料表を参照) を、滅菌した 250 mL コニカルフラスコに移します。95 mL の滅菌水を加えて総容量を 100 mL にし、0.26 % NaClO 溶液にします。
    2. 75% EtOH溶液を調製するには、75 mLの99.7%EtOHを採取し、滅菌した250 mLのコニカルフラスコに移します。25 mL の滅菌水を加えて合計容量を 100 mL にし、75% EtOH 溶液にします。
  6. 30 mL の NaClO をペトリ皿に注ぎ、30 mL の EtOH を別のペトリ皿に注ぎます。ステップ2.4で述べた卵を含むセルふるいをNaClOを含む皿に入れます。0.26% NaClO溶液に0.5分間浸します。次に、ふるいをEtOHを含む皿に移し、75%EtOH溶液にさらに0.5分間浸します。
  7. このプロセスを 0.5 分ごとに 0.26% NaClO と 75% EtOH を交互に 3 回繰り返します。その後、軸卵が得られます。この時点で、卵を含むふるいをEtOHに浸す必要があります。
    注:完全な滅菌を確実に行うには、1 mLのピペットを使用してNaClOとEtOHを吸引し、卵を分散させます。すすぎプロセスを複数回繰り返します。このステップでは、卵の表面から残留バクテリアや不純物をさらにきれいにし、清潔で無菌の表面を確保します。

3. アキノシラ幼虫の飼育

  1. 滅菌した卵を移すには、アルコールランプで滅菌したハサミを使用して、1 mLピペットの先端を切断します(図3B)。カットしたピペットの端の開口部が卵の直径(約2 mm)よりも大きいことを確認してください。次に、ピペットを使用して卵をEtOH溶液(卵と溶液)から無菌飼料を含む遠心分離チューブに移し(図3C)、各チューブには約20〜50個の卵が含まれている必要があります(図3D)。すべての卵が移されるまで、このプロセスを繰り返します。
    注意: ピペットチップの直径は、移植中に卵が壊れて死に至らないように、できるだけ大きくする必要があります。
  2. ピペットを使用して、チューブから余分なエタノールを取り除きます。遠心分離管を蓋をして閉じた状態でセルフシールバッグに入れ、バッグの開口部に綿を置き、空気が循環できるようにします。最後に、25°Cのインキュベーター(相対湿度:50%-70%、日長:16時間、明:8時間暗)に入れ、観察・培養する。
  3. 約3日後、餌中の軸卵が孵化し始めます(図4A)。孵化した幼虫は活動的になり、無菌飼料の表面は滑らかではなくなります。幼虫は餌を食べ始めます。
  4. 幼虫が2番目の 幼虫の段階に達するまで観察を続けます。この期間中、彼らの成長と発展を監視し続けてください。
  5. 9〜12日後、卵の80%以上が3番目の 幼虫に成長しました(図4B)。これは、幼虫の成長と発達が成功したことを示しています。

4. 培養依存性アッセイによる軸幼虫のバリデーション

  1. 遠心チューブから3匹のアキセニック3齢 幼虫をランダムに選択します。
  2. 幼虫を75%アルコールを含む94 mm x 16 mmのシャーレに入れて洗浄します。その後、滅菌水を入れた容器に移し、さらにすすいでください。
  3. 75% EtOH溶液で滅菌した消毒解剖鉗子を使用して、幼虫をつかみます(頭と尾を 図5Aに示します)。解剖ハサミを使用して、頭と尾の端を取り除きます(図5B)。幼虫の尾を鉗子で持ち、別の鉗子で尾から頭に向かって優しく絞って内臓を抜出します( 図5Cに示す結果)。内臓を脱イオン水に入れ、鉗子で脂肪組織を押して腸を静かに引き抜き、抽出した内臓(図5D)を滅菌水に入れてさらに使用します。
  4. 腸を滅菌済みの1.5 mL遠心チューブに入れ、500 μLの滅菌済み1x PBSバッファーを加え、使い捨ての乳棒を使用して腸組織をホモジネートに粉砕します。
  5. ホモジネート100μLを採取し、栄養寒天培地に加えます。寒天プレートの縞模様には、L字型のスプレッダー( 材料表を参照)を使用します。
  6. ペトリ皿を28°Cの生化学的インキュベーターに入れ、72時間インキュベートしてコロニーの成長を観察します。

5. 培養に依存しないアッセイによる軸幼虫のバリデーション

  1. メーカーの指示に従って、DNA抽出キット( 材料表を参照)を使用して、軸幼虫の腸組織から全DNAを抽出します。
  2. 紫外分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。
  3. ユニバーサルバクテリア16S rRNAプライマー(1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3'、27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3')を用いてPCR反応を行います。総反応容量は25 μLで、DNAテンプレート1 μL、フォワードプライマー0.5 μL、リバースプライマー0.5 μL、ddH2O10.5 μL、2x Taq PCR Master Mix12.5 μLで構成されています( 材料表を参照)。PCR反応条件を次のように設定します:94°Cで3分間の初期変性。94°Cで30秒間の変性を35サイクル、55°Cで30秒間アニーリング、72°Cで90秒間伸長。72°Cで10分間最終伸長。PCR産物は、さらなる分析のために4°Cで保存してください。
  4. ユニバーサル真菌ITSプライマー(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')を用いてPCR反応を行います。総反応容量は25 μLで、DNAテンプレート1 μL、フォワードプライマー0.5 μL、リバースプライマー0.5 μL、ddH2O10.5 μL、2x Taq PCR Master Mix12.5 μLで構成されています。PCR条件を95°Cで5分間設定します。95°Cで30秒、55°Cで1分間、72°Cで90秒の35サイクル。続いて72°Cで10分間。PCR産物は、さらなる分析のために4°Cで保存してください。
  5. Super Green 核酸色素( 材料表を参照)を使用して、2 種類の PCR 産物のそれぞれと均一に混合し、1x TAE バッファー(50x TAE から希釈、材料表を参照)中の 1% アガロースゲルで電気泳動により分析します。3 μLのDNAマーカー( 材料表を参照)を参考として使用します。
  6. UVトランスイルミネーターを使用してゲルを観察し、ターゲットフラグメントを見つけます。

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結果

D. antiquaのライフステージを図4に示します。ライフサイクル全体は、卵、幼虫、蛹(図4C)、成虫(図4D)で構成されています。無菌遠心チューブで培養され、その外観と生存率は、非軸条件下で飼育されたD.antiquaと見分けがつきません。D. antiqua の各段階の成長と発達の時期を図6に示します。非軸飼育のD. antiquaの産卵期は2.83±0.29日、軸子飼育のD. antiquaの産卵期は2.83±0.29日であり、両者の間に有意差はなかった(独立t検定、t = 0.00、p = 1.00)。正常幼虫期は13.83±0.76日、軸幼虫期は14.50±0.50日で、両者の間に有意差はありませんでした(独立t検定、t = 1.27、p = 0.27)。通常飼育の...

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ディスカッション

昆虫は非常に複雑な腸内細菌叢を持っているため20,21、昆虫と微生物の相互作用を研究するには、特定の腸内細菌株を接種した軸性昆虫を使用する必要があります。このような研究活動には、アキセニウムシの作製が不可欠です。抗生物質治療は、腸内細菌叢を排除するために使用される方法です。例えば、JungとKim22はSpodoptera exiguaにペニシリンを与え、Raymond23はP. xylostellaに腸内細菌を除去するためにリファンピシンを含む人工飼料を与えた。しかし、抗生物質治療は腸内細菌を完全に排除することはできず、宿主昆虫には多くの副作用があります。これらには、代謝酵素活性の変化、腸機能障害、成長、発達、生殖の阻害、および死亡率の増加が含まれます23,24,25。

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(32272530)、済南大学新20政策プロジェクト(2021GXRC040)、山東省主要科学技術イノベーションプロジェクト(2021TZXD002)、啓魏理工大学科学教育統合プロジェクト(2022PYI009、2022PY016、2022PT105)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上 μ;MフィルターボトルThermo Scientific450-0045
0.22 μMシリンジフィルターバイオシャープBS-QT-011
100メッシュふるい浙江Shangyu Jinding標準ふるい工場カタログ番号
1x PBS溶液SolarbioP1020
2x Taq PCRマスターミックスGENVIEWGR1113-1ML
5.2%NaClO溶液Sinopharm化学試薬株式会社
500 mL コニカルフラスコThermo Scientific4103-0500
50 mL ベント式遠心分離管JET BIOFILBRT-011-050
50x TAE bufferGENVIEWGT1307
寒天粉末Ding GuoDH010-1.1
生化学インキュベーターSTIK21040121500010
細胞ふるいSAINING5022200
塩化コリンSangon BiotechA600299-0100
ddH2ODing GuoPER018-2
使い捨て粉砕乳棒JET BIOFILCSP-003-002
DNA 抽出キットSangon BiotechB518221-0050
DNA マーカーSangon BiotechB600335-0250
エタノール絶対シノファーム化学試薬(株)
濾紙NEWSTAR1087309025
フードプロセッサー広東省美的生命電器製造有限公司
Illuminated  インキュベーターShanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.
L-アスコルビン酸サンゴンバイオテックA610021-0100
L字型スプレッダーSAINING6040000
栄養寒天培地ホープバイオHB0109
ハサミBing ゆ BY-103Jingdong
ShockインキュベーターShanghaiZhichu Instrument Co., Ltd.
ショ糖GENVIEWCS326-500G
スーパーグリーン核酸染料バイオシャープBS355A
スーパークリーンテーブルヒールフォースAC130052
TSBホープバイオHB4114
真空ポンプ浙江泰州精密真空ポンプ株式会社を求めて。
酵母エキスThermo ScientificLP0021B
なし8001042810009218WBL25B26A16110768での購入202000001422051031

参考文献

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