クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証

サマリー

本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。

要約

特定の脳領域の定位固定装置注射は、基礎神経科学における基本的な実験手法を構成しています。研究者は通常、マウスの脳アトラスや、さまざまな集団/年齢のマウス、さまざまな定位固定装置を使用した公開資料に基づいて定位固定装置注射パラメータを選択するため、定位固定装置の座標パラメータをさらに検証する必要があります。カルシウムイメージング、化学遺伝学、および光遺伝学的操作の有効性は、関心領域内のレポーター遺伝子の正確な発現に依存しており、多くの場合、数週間の努力が必要です。そのため、目的の脳領域の座標を事前に確認しておかないと手間のかかる作業になります。ウイルスの代わりに適切な色素を使用し、クライオセクショニングを実施することで、研究者は色素投与後すぐに注入部位を観察することができます。これにより、実際の注入部位と理論上の位置との間に不一致がある場合に、パラメータを調整するためのタイムリーな調整が容易になります。このような調整により、その後の実験における標的領域内でのウイルス発現の精度が大幅に向上します。

概要

in vivoカルシウム記録、光遺伝学、化学遺伝学など、現代のほぼすべての神経調節ツールは、脳の関心領域を標的とするために定位固定座標の使用を必要としています^1,2,3、神経操作の基礎を形成しています。マウスの脳領域の定位固定装置座標は、頭蓋骨の骨のランドマークであるブレグマとラムダに関連して定義され、いわゆる頭蓋骨由来の定位固定装置座標系を形成します。bregma と lambda のどちらかが 3 次元座標のゼロ点として機能します。3つの軸は、前後軸(AP)、中外側軸(ML)、背腹軸(DV)で、脳定位固定装置のデジタルディスプレイ上のy軸、x軸、z軸を表しています。周知の脳領域については、特定の領域の定位固定座標パラメータは、マウス脳アトラス⁴(例えば、定位座標におけるPaxinosおよびFranklinのマウス脳)および/または公開された文献^5,6から得ることができる。ただし、脳定位固定装置のバリエーションや、研究者によって使用されるマウスの年齢/個体群が異なるため、さらなる検証が必要です。

構造は機能の基本です。神経回路は、認知活動、感情、記憶、感覚、運動機能など、多くの脳機能の基盤を形成しています¹。神経回路の構造をラベリングし、その活動を操作することは、特定の神経回路の機能を理解するために不可欠です。過去数十年にわたり、ニューラルトレーサーは何世代にもわたって進化してきました。初期の研究では、前向性トレーサーとして小麦胚芽凝集素(WGA)と尋常性凝集素(PHA)が採用され、逆行性トレーサーとしてフルオロゴールド(FG)、コレラ毒素サブユニットB(CTB)、カルボシアニンが採用されました。しかし、ウイルストレーサーとは異なり、これらの従来のニューラルトレーサーは外因性遺伝子を宿主に組み込むことができず、細胞型選択性も持っていません。今日、ウイルス戦略は基礎神経科学研究における重要な命題となっています。さまざまな研究目的のために、さまざまなウイルスツールを選択できます^7,8。非トランスシナプスウイルス、トランスマルチシナプスウイルス(逆行性および前行性)、およびトランスモノシナプスウイルス(逆行性および前行性)があります。各カテゴリには、それぞれの特性を持ついくつかのタイプが含まれています。

ウイルスの投与と発現のプロセスは非常に時間とリソースを大量に消費し、多くの場合、数週間またはそれ以上かかります。様々なウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは遺伝子送達の有望な手段として同定されており、^{実験手順7,8}のために注射後3〜8週間の範囲の広いウィンドウを提供する。AAVが進化するにつれて、投与後2〜3週間で分析を行うことができる^9,10。偽狂犬病ウイルス(PRV)や狂犬病ウイルス(RV)などの他の神経回路トレーサーも、少なくとも2〜7日の追跡期間を必要とします11,12,13,14,15。したがって、蛍光シグナルを観察する前に注入部位を事前に検証することは、時間と費用対効果の両方が高いです。

定位固定装置による注射を簡単かつ迅速に検証するために、この研究では、ウイルスベクターの前に色素を投与し、クライオ切片により、研究者は注射部位を観察し、注射後30分以内に追跡することができます。

プロトコル

すべての動物実験は、Animal Research Reporting In Vivo Experiments(ARRIVE)ガイドラインおよびNational Institutes of Health Guides for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠して実施されました。本研究は、上海交通大学医学部仁済病院の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、生後8週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しました。動物は商業的に入手され( 材料の表を参照)、標準的なケージ(22°C±2°C、12時間/12時間の明暗サイクル、餌、水を自由に)に収容されました。

1. 標的となる脳領域の選択

注:これは滅菌手順です。すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。手術器具と接触する前に、手袋にアルコールをスプレーしてください。器具の先端や手術部位に手袋をはめて触れないでください。処置を開始する前に、矯正反射の喪失や皮膚刺激に対する反応がないことを確認して、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。穿孔と注射の前に、呼吸数(毎分60〜220呼吸、毎分平均100〜150呼吸)と呼吸振幅(一貫していて、浅すぎたり深すぎたりしないように)を注意深く監視します。呼吸数または振幅の大幅な変化に注意する必要があります。.

1. 29 Gの針を使用して、1.25%トリブロモエタノール(250 mg / kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.立ち直り反射が消えたら、頭蓋骨の毛を剃ります。マウスを脳定位固定装置フレーム( 資料の表を参照)に固定するには、上切歯をノーズクランプで固定し、2本のイヤーバーで頭を安定させます。
2. 眼の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。頭皮をアネルディアン(消毒液; 材料の表を参照)で3回拭いて消毒します。.29 Gのインスリン針を使用して0.2 mLの1%リドカインを皮下に注射し、局所鎮痛を提供します。.
3. アイハサミを使用して0.5cmの切開を行い、頭蓋を露出させます。3%H₂O₂ に浸した綿棒を使用して、露出した頭蓋骨をこすり、骨膜を取り除きます。頭蓋骨を乾かします。
4. ドリルを脳定位固定装置に取り付けます。拡大鏡を使用してドリルチップをブレグマに正確に配置するように脳定位固定アームのノブを調整し、LCDデジタルディスプレイを使用してz軸値を記録します。
   1. ノブを調整し、ドリルチップをラムダに配置し、z軸の値を記録します。ノーズclを調整しますamp とイヤーバー 2つのz値を近づけ、2つのz値の差が0.1 mm未満になるまで上記の手順を繰り返します。
      注意: LCDデジタルディスプレイのx、y、およびz軸は、それぞれ中外側(ML)、前後(AP)、および背腹(DV)に対応します。ブレグマとラムダは、2 つの z 値の差が 0.1 mm 未満になると、同じ水平面上にあると見なすことができます。
5. 脳の左右の水平性を確保します。脳定位固定装置フレームに取り付けられているイヤーバーを同じスケールで調整します。例えば、後咽側被蓋核、腹側部分(LDTgV)を取ります。その定位座標は、Xが-5.2、Yが+0.8、Zが-4.0であると、PaxinosとFranklinのマウス脳アトラス¹⁶によると。
   1. イヤーバーを調整してドリルを(-5.2、+ 0.8)にして背腹方向のz値を測定し、ドリルを(-5.2、-0.8)に移動してz値を測定します。
      注意: 2つのz値の差が0.2 mm未満の場合、左右は等しいレベルにあると見なされます。耳道は対称的であるため、イヤーバーは適切な場所に挿入する必要があります。2つのz値の差が0.5mmを超えると、イヤーバーが間違った場所に挿入されている可能性があります。
6. ドリルを再びブレグマに合わせ、LCDデジタルディスプレイの3つの座標をゼロに設定します。参照座標を使用して、ドリルを関心領域の上に配置します。ドリルを開始します。
   1. 垂直アームを使用して、ドリルが頭蓋骨を貫通するまでドリルを徐々に下げます。綿棒を使用して破片や血液を取り除きます。
      注意: 脳組織を傷つけないように注意してください。

2.色素溶液の調製と脳マイクロインジェクション

1. ブロモフェノールブルー( 材料表を参照)を含む25 μLのSDS-PAGEローディングバッファーを200 μLの微量遠心チューブに取ります。50 μLのddH₂Oをチューブに加えて、色素溶液を調製します。
2. 頭蓋窓を生理食塩水で湿らせた綿パッドで覆います。生理食塩水を繰り返し吸引および排出することにより、マイクロシリンジの開存性を確保します。0.3 μLの色素をマイクロシリンジにロードします。シリンジと電動定位固定装置マイクロインジェクターを脳定位固定装置アームに取り付けます。
3. シリンジの先端をブレグマに置き、LCDデジタルディスプレイで座標をゼロに設定します。参照座標に従って、針を関心領域に調整します。注入速度を0.1 μL/minに設定し、電動マイクロインジェクターを始動して、0.3 μLの青色色素をターゲット領域に送達します。注射器を少なくとも10分間所定の位置に置いてから、インジェクターをゆっくりと引き抜きます。.
   注:同じマウスで異なる色の染料を使用して、近接した領域を区別することができます。他の染料は、その物理的特性に基づいて適切な濃度でテストします。ブロモフェノールブルー処方を使用し、閉塞を防ぐために使用前と使用後にシリンジを十分にすすぐことをお勧めします。色素の拡散に基づいて注入量を調整します。

3. 脳組織の採取と凍結切片

1. マウスを定位固定装置フレームから離します。29 G の針を使用して、50 mg/kg のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。マウスをテープで発泡スチロールボードに固定します。
2. 胸部の両側を開いて急速な窒息を誘発します。右心房付属器に1〜2mmの切開を行います。左心室に注入針を挿入します。予冷した生理食塩水20mLと氷漬けの4%パラホルムアルデヒド溶液20mLを注入します。
3. 組織解剖ハサミでマウスの首を切ります(制度的に承認されたプロトコルに従います)。首から鼻までの正中線に沿って切開して皮膚を切除し、頭蓋骨を露出させます。鉗子やハサミで頭蓋骨に残っている筋肉を取り除きます。
4. 細いハサミの片方の刃の先端を大孔と脳の間に置き、鋭いエッジを骨に向けて、矢状中央縫合糸の吻側端に配置します。スライドして、矢状中央縫合糸に沿って頭蓋骨を切断します。鉗子を使用して頭蓋骨を切除し、露出した脳を露出させます。
   注意: 手術中に脳に損傷を与えないように注意してください。骨片を取り除く前に、頭蓋骨に付着している可能性のある髄膜を慎重に剥がしてください。この予防措置は、プロセス中に脳組織が誤ってスライスされるのを防ぐために重要です。
5. 回転式ミクロトームクライオスタット( 材料の表を参照)の電源を入れ、チャンバー温度を-20°Cに設定します。 OCTコンパウンドを少量注ぎ、試料ディスクの表面を均一に覆います。それをクライオチャンバーに入れ、OCTが固まるのを待ちます。
6. ディスクを試料ヘッドに取り付けます。ブレードをブロックに近づけ、OCTブロックをトリミングして、ディスクと平行な平面を作ります。
7. 脳をシェービングブレードで脳スライス型で注射部位から離れた冠状方向に切断します。注射部位を含む脳組織を、切断面を下にしてOCT平面に置きます。
   1. OCTを脳に注ぎ、椎間板をクライオチャンバーに入れると、検体ブロックが固化します。脳にOCTが完全に埋め込まれるまで、OCTを繰り返し脳に注ぎます。
      注:OCTコンパウンドをレイヤーごとに追加します。OCTの前の層が凍結したら、OCT化合物の次の層を脳に注ぎます。
8. ターゲット領域が近づくまで試験片ブロックをトリミングします。注入部位レベルからいくつかのセクションを作成します。-20°Cに保たれた小さな筆を使用して、室温PBSを含む6ウェルプレートに冠状脳スライスを収集します。
   注意: 切断厚さを大きいものに設定してブロックをトリミングし、ブレードが注入部位に近づくにつれて切断厚さを40μmに設定します。神経回路トレーサーを使用する場合、マウスはすぐに犠牲にされません。麻酔からの回復のために、マウスを滅菌した術後回復ケージに加熱ブランケットの上に置きます。マウスを元のケージに戻すか、目覚めたら新しいケージに戻します。

4. イメージング

1. OCTを室温のPBSで洗浄します。ブラシを使って脳の切片を拾い上げ、スライド上に置きます。セクションを室温で風乾させます。
2. 注入された領域を視覚的に観察するか、標的核が極小の場合は顕微鏡を使用します。注入した色素の位置を脳アトラスの対応する領域と比較します。
   注:X、Y、およびZ軸の値は、注入点の偏差の方向と距離に応じて調整します。座標を正確に決定するために、このプロトコルのすべての手順を複数回繰り返す必要がある場合があります。

結果

この研究では、実証された方法を使用して、30分以内に注射部位を特定することに成功しました。最初に、ブロモフェノールブルーを含むSDS-PAGEサンプルローディング溶液をC57/BLマウスのLDTgVに注入しました。 図1A は、色素溶液注入の概略図を示しています。LDTgV中の青色色素の分布を 図1Bに示します。

ブロモフェノールブルーは、このプロトコルの普遍性を評価するために、mPFC前辺縁系皮質、mPFC下辺縁系皮質、およびバソメジア扁桃体(BMA)にも注入されました。図1C-Eおよび図2Aに示すように、青色色素はmPFC前辺縁皮質、mPFC下辺縁皮質、およびBMAに分布した。

さらに、蛍光mCherryタンパク質を持つアデノ随伴ウイルスをLDTgVに注入しました(色素溶液を用いて座標を確認しました)。ウイルスの発現には4週間かかりました。LDTgVにおけるmCherry+ニューロンの分布を 図2Bに示します。

図1:色素溶液の注入 (A)色素溶液注入の概略図。(B) LDTgVにおける青色色素の分布 (C) mPFC前縁系皮質における青色色素の分布。(D)mPFC下辺縁系皮質における青色色素の分布。(E)BMAにおける青色染料の分布。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:顕微鏡で見た青色色素の分布とmCherryの分布(A)mPFC前縁皮質における青色色素の分布(倍率10倍、スケールバー=500μm)。(B)蛍光顕微鏡法で取得したLDTgV領域のmCherry分布の代表画像(倍率10倍、スケールバー=500μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、ウイルス追跡の前に脳定位注射^5,6の精度をより迅速かつ簡単に検証するための安定した戦略について説明しましたが、脳領域でのレポーター遺伝子発現のかけがえのない側面は、脳領域の標識にとって非常に重要です。使用した青色の染料により、注射部位を即座に視覚化することができました。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、注入部位の精度の向上に貢献します。まず、ステップ1.5から脳定位固定装置の脳の左右レベルを確保します。このステップでは、オペレーターが頭蓋骨の解剖学に精通し、イヤーバーが正しい位置に配置されていることを確認する必要があります。イヤーバーのスケールと脳定位固定装置フレームも参考になります。次に、ステップ 1.6 とステップ 2.3 で正確なゼロ点 (ブレグマ) を見つけます。場合によっては、ステップ 1.6 と 2.3 で見つかった座標の大きな不一致は、ゼロ点の位置の大幅な違いが原因です。これにより、マイクロインジェクターの針が頭蓋窓を貫通できなくなる可能性があります。このような場合、ゼロポイントの位置を変更する必要があり、必要に応じて新しい頭蓋窓を作成する必要があります。それにもかかわらず、ステップ2.3でゼロ点を再確立し、新たに座標を見つけることが不可欠です。以前に作成した頭蓋窓からマイクロシリンジを直接挿入することはできません。

マウスの脳スライス型で凍結していない脳を切断する場合と比較して、この戦略では、固体試料ブロックがブレードが脳を圧迫し、色素が注入点から変位するのを防ぐため、より正確な結果が得られます。さらに、脳スライス型によって切断された脳切片は比較的厚く、小さな脳核を局在化することは不可能である。しかし、標準的な脳組織凍結切片^プロセス11,12,13,14,15と比較して、脱水ステップをスキップすることにより処理時間を少なくとも72時間短縮したため、脳切片がより壊れやすく、スライドガラスで拾いにくくなり、このプロトコルの大きな弱点を表していました。

頭蓋窓を染料注入用に作る際に、デンタルドリルを手で持つのではなく、定位固定装置アームにしっかりと取り付けることで、微調整ノブによる穴あけ深さのコントロールが容易になり、脳組織を損傷する可能性を減らすことができます。

結論として、この研究は、ウイルス追跡の前に正確な定位座標を事前に検証するための有望な方法を提供し、その後のニューロンの標識および追跡プロセスの信頼性を高めました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.0 & マイクロ;L、Neuros Syringe、モデル 7001 KH、32 G、ポイント スタイル 3	ハミルトン	65458-01
200 μLピペットチップ	バイオシャープ	BS-200-T
20mLシリンジ	親切なグループ
3%H2O2溶液	Lircon Company
6ウェルプレート	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
アンチロールプレート	ライカ	14047742497
BDインスリンシリンジ	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	328421
曲げ歯付き解剖鉗子	Jinzhong	JD1050
Cellsens 寸法ソフトウェア	オリンパス
綿棒	フィッシャーサイエンティフィック	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
ドリル	Longxiang
ファインブラシ	HWAHONG
ファインハサミ
顕微鏡オ	リンパス	BX63
凍結ミクロトーム	ライカ	CM1950
血鉗子ストレート歯	JinzhongJ31010
液針0.7ミリメートル	親切なグループ
リドカイン塩酸塩注射	ハーベスト製薬会社	71230803
虫眼鏡	M&G Chenguang文房具
オスC57 / BLマウス	上海計画家族研究所–BK実験
用マウス 冠状脳スライス金型	RWDライフサイエンス	68713
マイクロ遠心チューブ	バイオシャープ	BS-02-P
ミクロトームブレード	ライカ	819
眼科軟膏	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
パラホルムアルデヒド	バイオシャープ	BL539A
蠕動ポンプ	ハーバード装置	70-4507
リン酸緩衝生理食塩水	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	サーモフィッシャー	4642080
SDS-PAGE サンプルローディング ブロモフェノールブルーを含む	Beyotime	P0015A
シェービングブレード	BFYING	91560618
スライド	Citotest 科学	188105
脳定位固定装置	RWD ライフサイエンス	68807
ストレート歯付き解剖鉗子	Jinzhong	JD1060
リンジ	ホルダーRWDライフサイエンス	68206
ティッシュはさみ
ッシュテックOCTコンパウンド	サクラ	4583
トリブロモエタノール	愛北バイオテクノロジーM2910