ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その光透過性、遺伝的トラクタビリティ、および再生能力により、心臓の発達、生理機能、および修復を研究するために広く使用されているモデル生物です^1,2,3,4。心筋梗塞では、構造的および機能的な変化が心臓駆出と血行動態に影響を与えますが、技術的な制限により、高い時空間分解能で心臓再生中の動的プロセスを調査する能力が引き続き妨げられています。例えば、共焦点顕微鏡などの従来のイメージング法では、複数の心臓周期における動的変化を捉え、心収縮機能を評価するためのイメージング深度、時間分解能、または光毒性の点で限界^{があります5。}

ライトシート顕微鏡は、心臓の心室と心房にレーザーを素早く照射することで、これらの問題にうまく対処し、時空間分解能を高め、光退色や光毒性の影響を無視できる詳細な画像を実現する最先端のイメージング法です6,7,8,9,10,11。

このプロトコルは、LSMシステムの構築、4D画像再構築、3D細胞追跡、および複数の心臓周期¹²の間に心臓全体の心筋細胞の動態をキャプチャおよび分析するためのインタラクティブな分析を含む包括的なイメージング戦略を導入します。カスタマイズされたイメージングシステムと計算方法論により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の心筋の微細構造と収縮機能を単一細胞レベルで追跡できます。さらに、低分子化合物をマイクロインジェクションを用いて胚に送達し、薬物誘発性心障害とその後の再生を評価しました。このホリスティックな戦略は、心臓の発生と再生における心筋の構造的、機能的、機械的特性を単一細胞レベルでin vivo で調査するためのエントリーポイントを提供します。

この研究の承認は、テキサス大学ダラス校の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって、プロトコル番号 #20-07 の下で付与されました。本研究では、 Tg(myl7:nucGFP) トランスジェニックゼブラフィッシュ仔魚¹² を使用しました。すべてのデータ取得と画像の後処理は、研究または教育ライセンスを持つオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、妥当な要求に応じて著者から入手できます。

1. ゼブラフィッシュの育種と胚マイクロインジェクション

タイミング:2日間

1. ゼブラフィッシュの成魚を標準的なケアと繁殖手順で維持・繁殖させる。詳細な方法については、前のレポート¹³を参照してください。
2. 確立されたプロトコル¹⁴ に従ってマイクロインジェクションを実行します。本研究では、マイクロインジェクションを1-2細胞(受精卵)の段階で実施しました。
   注:効果的なマイクロインジェクションのためには、この段階を正確に特定し、発達の一貫性を確保することが重要です。1細胞の段階では、卵黄の上に小さなドームが形成され、この段階は通常約12分間続きます。2細胞期に進行すると、隣接する2つのドームが見え始め、この段階は受精後約45分間持続する¹⁵。システム構築のより詳細な情報は、他のレポートまたはプロトコル^12、16、17に記載されています。

2. ゼブラフィッシュの胚・幼生の準備と装着

タイミング:7日間

1. 受精後1日(dpf)で胚を0.2 mMの1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)( 材料表を参照)を含むE3水に移し、色素形成を防ぎます。
2. LSMイメージングまで毎日、培地をPTUを含む新鮮なE3水と交換します。
3. 実体顕微鏡で胚または幼虫を画像化し、0〜7dpfの所望の時点での発育を記録します。
4. ゼブラフィッシュの仔魚をLSMシステムに包埋するための内径2mmのセグメント化されたフッ素化エチレンプロピレン(FEP)チューブを準備します¹²。
   注:FEPチューブは、水などの周囲の媒体によく似た屈折率一致材料でサンプルを固定するために使用されます。
5. 3 dpf から始めて、魚を 150 mg/L トリカイン (MS-222) 溶液 ( 材料表を参照) に移し、イメージング前に魚を固定化します。
6. 150 mg/L のトリカインを含む 0.8% 低融点アガロースを調製し、室温まで冷却したら、トランスファーピペットを使用して麻酔をかけた魚をアガロースに移します¹⁸。
7. 別のトランスファーピペットを使用して、魚をアガロースと一緒にFEPチューブに取り付けます(図1)。
   注:発育中の胚のストレスを最小限に抑えるために、心拍数などの心臓活動の固定前後の検査を顕微鏡観察で行いました。これらの評価は、トリカイン麻酔前後の有意差を特定することを目的としていました。.浮腫などの心臓構造の不規則性について、皮膚と筋肉組織の追加検査も、固定後に実施できます。トリカインの濃度は心臓イメージングでも重要な役割を果たすため¹⁹、このプロジェクトでは150 mg / L濃度のトリカイン溶液をゼブラフィッシュ幼生の収縮のイメージングに利用しました。現在のレトロスペクティブ同期により、不整脈²⁰に対処することができますが、ゼブラフィッシュの不整脈の4Dイメージングと長期イメージングのための包括的なソリューションはまだ開発中です。

3. ライトシートイメージングシステムのセットアップと構成

タイミング:3-14日

1. 473nmや532nmなどの特定波長の連続波ダイオード励起固体(DPSS)レーザーシステムを照明源として使用し、シリンドリカルレンズをベースにした社内LSMシステムを構築します(図2A)。
2. LabVIEW( 材料表を参照)制御コードをカスタマイズして、並進サンプルステージ、ライトシート照明、およびsCMOSカメラの露光を同期させて、画像シーケンスをキャプチャします。
   注:システム構築のより詳細な情報は、他のレポートまたはプロトコル^12、16、17に記載されています。研究グループには、システム構築時に光学イメージングに関する確立された専門知識を持つ研究室との共同研究の機会を模索することを奨励しています。

4. ゼブラフィッシュのイメージング準備とデータ収集

タイミング:1日

1. LSMシステムの空間分解能を校正し、蛍光ビーズを測定することで、さまざまな深さでの不透明度の変動を最小限に抑えます。
   1. まず、直径0.53μmの蛍光ビーズ( 材料表参照)を0.8%低融点アガロースを用いて1:1.5×10⁵ の濃度に希釈し、溶液をセグメント化されたFEPチューブに移す。
   2. 次に、LSMシステムを使用してビーズを画像化し、サンプル全体の点像分布関数(PSF)を測定して、空間分解能とシステムアライメントを検証します¹²。
      注:このシステムでは、半値幅(FWHM)の代表的な結果を分析したところ、横方向の分離能は1.26 ± 0.15 μm、2.48 ± 0.15 μm(n = 60ビーズ)であることが示されています。これは、イメージング深度全体にわたって一貫した空間分解能を示唆しています。
2. ゼブラフィッシュの仔魚を取り付けたFEPチューブを6軸(x、y、z、ピッチ、ヨー、ロール)電動サンプルステージにしっかりと取り付け、E3水で満たされたサンプルチャンバーにチューブを沈めます。卵黄嚢による光の散乱を防ぎ、心臓の位置をより正確に特定するために、ゼブラフィッシュの幼生を回転させて腹側から画像を撮影します(図2B)。この場合、ほとんどの画像には心室と心房の両方が含まれます(図2C)。
   注:現在のイメージング手順は通常、魚1匹あたり1時間未満で、制御された室温環境で実施されたことを考えると、このプロジェクトではチャンバーの温度制御と酸素レベルの調整はオプションと見なされます。ただし、特に発生プロセスに焦点を当てた長期的なタイムラプスイメージング研究では、ゼブラフィッシュの生理学的環境を確保し、潜在的な発生異常を防ぐために、サンプルチャンバー内の27°Cでの継続的な温度モニタリングと調節が推奨されます。
3. 電動サンプルステージをワークステーションに接続し、希望の移動モードなど、必要なすべてのパラメータを設定します。
4. sCMOSカメラとワークステーション間の接続を確立します。5 ミリ秒の露光時間や目的の関心領域など、すべての重要な設定を調整します。
5. カスタマイズしたLabVIEW制御プログラム内で画像シーケンスとフレームの数を構成します。
6. レーザーの電源を入れ、サンプルのLSMイメージングを開始します。すべての画像シーケンスが正常に記録されるまで、プロセスを維持します。
7. 200フレーム/秒のフレームレートで幼虫の3〜5心臓周期をカバーするために、300フレームを2D画像シーケンスとして記録します。記録は、ライトシートによって照らされた選択面での心臓の収縮性を捉えます。
8. ライトシートの照明を横切って1 μmのステップサイズで幼虫を動かし、サンプルを仮想的にスライスします。
   注:サンプルステージのステップサイズは、ナイキスト・シャノンサンプリング定理¹²に従って、ライトシートシステムの軸方向分解能に基づいて設定する必要があります。
9. 手順 7 を繰り返して、心臓全体が覆われるまで、新しいサンプルスライスの別の画像シーケンスを記録します。一般に、ステップサイズ1μmの100〜200の画像シーケンスは、ゼブラフィッシュの幼生の心臓全体をカバーできます(図2D)。
   メモ:ステップ4.7〜4.9はLabVIEWプログラムによって制御され、LSMシステムによって自動的に実行されます(図3)。生成される画像データが大量にあることを考えると、画像シーケンスには標準化された命名規則が推奨されます。たとえば、「z-1」や「z-2」などの名前のフォルダーを指定して、さまざまな画像シーケンスにまたがってデータを分類します。各シーケンス内では、画像に順番に名前を付ける必要があります(例:「1」、「2」、...)。魚の装着、撮影角度の調整、ゼブラフィッシュの仔魚1匹分のすべてのデータ収集に要する時間は、約1時間です。

5. 並列計算による4次元画像再構成

タイミング:1日
注:私たちのグループによって開発された4D再構成アルゴリズムとサンプルデータは、一般に公開されています²¹。この方法により、前のステップで収集した画像シーケンスから4D心臓画像を再構築することができます(表1)。

1. ファイル test_Parallel.m を MATLAB で開きます ( 材料表を参照)。変数「baseDir」に、RAW画像シーケンスが格納されているフォルダの場所を指定します。
2. 変数 "numOfSlice" に画像シーケンスの総数 (通常は 100 から 150) を割り当て、変数 "numOfImage" に各シーケンスの画像の数 (通常は 300 から 500) を割り当てます。
3. ゼブラフィッシュの心臓の中央の平面を示す画像シーケンス (たとえば、合計 101 個のシーケンスのうち 51^番目のシーケンス) を調べます。このシーケンスで第 1 収縮期と第 4 収縮期のフレーム番号を特定し、それらを変数 systolicPoint_1st と systolicPoint_4th に割り当てます。
4. [ 実行 ]をクリックしてプロセスを開始します。
   注: 各イメージ シーケンスの心周期の長さは、まず、異なる時点におけるイメージ間の類似度 (差の二乗和) の比較を通じて、MATLAB プログラムによって識別されます。続いて、すべての画像シーケンスからのサイクル長の平均を使用して心周期が推定されます。次に、異なる軸方向位置における画像シーケンスの開始点は、最初の画像シーケンスから最後の画像シーケンスへの画像の類似性の反復比較を通じて、プログラムによって位置合わせされます。
5. 出力フォルダーで結果を確認します。プログラムは、画像をタイムスタンプ付きの「.tif」ファイルとして保存します。各「.tif」ファイルは、特定の時点での3Dハート画像です。2 つの 3D 画像間の時間間隔は、設定された露光時間と等しくなります。
   注:前の手順で取得した画像を再構築して、4D(3D空間的+1D側頭)の心臓収縮を描写します。レトロスペクティブ同期中の高スループット調査の習熟度を高めるために、このアプローチでは、MATLAB 並列計算ツールボックスを介して複数の CPU コアを活用し、イメージを gpuArray 形式に変換することで、GPU での同時計算操作を可能にします。

6. 3D細胞セグメンテーションと細胞追跡

タイミング:1日

1. 3DeeCellTrackerパッケージ( 材料表参照)をダウンロードし、Python環境²²をセットアップします。
2. ITK-SNAP アノテーション ソフトウェア²³ ( 資料表を参照) をダウンロードし、それを使用して、心室拡張期と心室収縮期の 2 つの選択した時点の 3D 心臓画像に手動でラベルを付け、トレーニングおよび検証データセットを作成します。
   注意: 他のラベリングソフトウェアも適用できる場合があります。
3. Python で 3DeeCellTracker トレーニング プログラムを実行し、TrainingUNet3D 関数の noise_level (この場合は 100)、folder_path、およびモデル パラメーターを初期化して、定義済みの 3D U-Net モデルを設定します。
4. MATLAB で imageDimConverter.m プログラムを使用して、学習データセットと検証データセットを読み込みに適した形式に変換し、名前を変更します。
5. Python では、 trainer.load_dataset() 関数と trainer.draw_dataset() 関数を使用して、トレーニング データセットと検証データセットを読み込みます。
6. Pythonで、3DeeCellTracker追跡プログラムの最初の部分を実行し、パラメータを初期化します。
   注:これには、画像の寸法を特徴付けるための画像パラメータの定義、細胞セグメンテーションに適用される機械学習モデルを選択するためのセグメンテーションパラメータ、および細胞レジストレーションに使用される事前トレーニング済みのディープニューラルネットワークモデルを選択するためのトラッキングパラメータが含まれます。初めて使用する場合は、セルセグメンテーションにU-Netモデルを使用し、セルレジストレーションにFFN+ PR-GLSを採用することをお勧めします。データ、モデル、および結果を、このステップで自動的に作成されるフォルダーに保存する必要があります。
7. MATLAB では、 imageDimConverter.m プログラムを使用して、すべての 3D ハート イメージを適切な形式に変換して名前を変更し、最後の手順で作成したデータ フォルダーに転送します。
8. Python では、 3DeeCellTracker プログラムの 2 番目の部分を実行して、セグメンテーションを開始します。
9. 最初の 3D 画像がセグメント化されたら、セグメンテーションの結果を生の画像と比較し、誤ったセグメンテーションが見つかった場合は手動で修正します。修正したセグメンテーションを作成した「/manual_vol1」フォルダに移動します。
10. Python では、 3DeeCellTracker プログラムの 3 番目の部分を実行して、すべての画像をセグメント化します。
11. Amira( 材料表を参照)を使用して、追跡された細胞の位置と対応する生の画像を比較することにより、追跡結果を視覚的に評価します。テスト結果が満足のいくものでない場合は、手順 6.6 から手順を再開し、セグメンテーションまたはセル登録に代替の機械学習モデルを使用してから、追跡プロセスを再開します。
    注: セグメンテーション後、セルラベルのデータはデフォルトで 8 ビット画像 (0 から 255) として保存されるため、セル分類のラベルとして提供されるのは 256 スケールのみです。追加のクラスが必要な場合にこの問題に対処するには、2 つの解決策があります。1つの解決策は、追跡プログラムでセルラベルのデータの形式を16ビット画像として設定することですが、この場合、処理時間が指数関数的に増加し、2日以上になります。もう1つの解決策は、「separateTrackingResults.py」プログラムを使用してセルラベルを後処理し、物理的な位置に基づいて同じラベルを持つセルを分離し、各セルに異なるラベルを割り当てることです。この場合、このプロセスには約 10 分かかります。

7.バーチャルリアリティモードでの心臓収縮性分析

タイミング:1日

1. 前のステップから細胞追跡結果を取得します。
2. データを手動で検証し、すべてのボリュームで一貫した画像強度を持つセルを選択します(約600個のセルのうち約500個のセル)。
3. cellLabelsToObj.ipynbスクリプト²¹を使用して、3Dスライサーソフトウェア²⁴(材料表を参照)を介して個々のセルごとにサーフェスメッシュを生成し、各セルに一意のカラーコードを割り当てます。
4. 1 つの時点のすべてのセルで構成される各 3D モデルを、セル ラベルを記述する .mtl ファイルを含む複数のサブオブジェクトで構成される 1 つの.obj ファイルとして書き出します。
5. 拡張現実に使用される開発エンジンである教育用ライセンスを使用して、モデルを Unity にインポートします。
6. C#で記述された関数で構成されるカスタマイズされたスクリプトをモデルとユーザーインターフェース要素に適用し、4Dの可視化とインタラクティブな分析を可能にします。手順 7.7 に従って VR インタラクションを実行します。
7. 以下の機能を使用して、仮想現実(VR)でモデルと対話します(図4)。
   1. セル選択: 一度に最大 2 つのセルを選択し、それらの軌跡、速度、体積、表面積、および相対距離を表示します。
   2. 時間ポイントの選択: データ内の特定の時点を選択して、拡張期の t = 0 ミリ秒、収縮期の t = 200 ミリ秒など、選択した細胞の出力を分析します。
   3. 時間一時停止: 動的モデルをフリーズして、選択したセルとその出力に焦点を合わせます。
   4. コントラスト: 選択したセルとモデル内の周囲のセルのコントラストを調整します。

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの調製とマイクロインジェクション、ライトシートイメージングと4D画像再構成、細胞追跡とVRインタラクションの3つの主要なステップで構成されています。ゼブラフィッシュの成体を交尾させ、受精卵を採取し、必要に応じてマイクロインジェクションを行い、実験を行いました(図1)。このステップは、心臓の発達と再生の研究におけるゼブラフィッシュの応用を探るための入り口となり、その後のイメージングと分析においても重要な役割を果たします。収縮する心臓は、特注のLSMシステムを使用してさまざまな段階(3 dpfから7 dpf)で画像化され、画像シーケンスをz軸に沿って位置合わせして、4Dゼブラフィッシュの心臓モデルを再構築しました(図2 および 図3)。これらのモデルは、深い表現型特性評価の基礎を提供し、発生タイムライン全体にわたる心臓の形態と機能のダイナミクスを明らかにする上で極めて重要です。ゼブラフィッシュの心臓の個々の細胞を追跡し、カスタマイズされたVRプラットフォームを使用して、その動きと相互作用を定量化しました。また、心房と心室の1回の心周期において、選択した細胞の速度と相対距離の変化を比較し、局所的な収縮性を評価し、局所的なひずみを調査しました(図4)。局所ひずみは、関心領域内の2つの隣接する心筋細胞間の変位の変動に基づいて決定されました。フラクショナルショートニング(FS)および駆出率(EF)は、公開された文献25に記載されている方法論を使用して推定されました。FS と EF の式は次のとおりです。

ここで、Dd およびDs は、それぞれ拡張末期および収縮末期の心室径(異なる心室細胞間の距離によって測定される短軸)であり、Vd およびVs は、それぞれ拡張末期および収縮末期の心室容積(心室の長軸および短軸の直径によって計算される)である。

まとめると、これらの結果は、ゼブラフィッシュモデルにおける体積イメージングとデータ解釈を容易にするために生理学と工学の両方を統合した新しい戦略を示しており、心臓の形態形成と力学の探求を前進させる上で大きな期待を寄せています。

図1:ゼブラフィッシュの採卵とマイクロインジェクションのプロセス。 このプロセスには、成体のゼブラフィッシュを交配させ、受精卵を採取し、オプションのマイクロインジェクションを実行することが含まれます。マイクロインジェクションでは、事前に引き出されたガラスピペットに目的の材料が装填されます。受精卵は、アガロースモールドのスリット内に一列に並び、針に対して垂直に配置されます。マイクロインジェクションは、卵子と針先の両方を常に顕微鏡で観察して行います。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ライトシートイメージングプロセスと4D画像再構成。 (A)自社ライトシートイメージングシステム構成の概略図。CL:シリンドリカルレンズ。EO:励起対物レンズ。DO:検出目標。TL:チューブレンズ。FL:フィルター。CAM:sCMOSカメラ。(B)FEPチューブに装着し、アガロースで包埋したゼブラフィッシュの模式図。(C)4 dpf のゼブラフィッシュの幼生からキャプチャされた生の 2D 画像シーケンス。各フレームの左上の時計は、収縮期末期から始まる心相を示します。(D)4Dゼブラフィッシュ画像レジストレーションのためのレトロスペクティブ同期の図。画像シーケンスは、z軸に沿った特定の深さでの連続記録を示します。画像シーケンスの各フレームは赤い点で表され、拡張末期から収縮期末までの開始段階と終了段階が黄色のボックスで強調表示されています。(E)2D画像シーケンスから4D再構成された心臓モデル。Dpf:受精後日数。この図は、Zhang et al.12 からの引用です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:LabVIEW制御パネル (A)コントロールパネルで使用される設定には、レーザー、カメラ、画像経路、およびモーターパターンの構成が含まれます。(B)LabVIEWプログラムで撮影したゼブラフィッシュの心臓の生画像の例。スケールバー:30 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:細胞追跡とVR相互作用は、ゼブラフィッシュの心臓の収縮性を明らかにするのに役立ちます。 (A)ゼブラフィッシュの心臓 Tg(myl7:nucGFP) の3 dpfで追跡した細胞。(B)VRプラットフォームは、4Dゼブラフィッシュの心臓モデルの没入型表示とインタラクティブな体験をユーザーに提供し、ユーザー定義の分析を通じて経時的な心臓機能を視覚化できるようにします。(C)VRプラットフォームから測定値を収集した後、3dpfと7dpfで選択した細胞間の1つの心臓周期中の速度と相対距離の変化を比較しました。最初の2つの図は、5つの心室細胞と5つの心房細胞の平均速度変化を示し、他の図は、3つの細胞群、すなわち、2つの心室細胞、心室細胞と心房細胞、および2つの心房細胞間の相対的な距離変化を示しています。(D)ゼブラフィッシュの心臓3dpfおよび7dpfの心機能評価。ゼブラフィッシュの心臓では合計370個の細胞を3 dpfで追跡し、580個の細胞を7 dpfで追跡しました。この図は、Zhang et al.12 からの引用です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表 1: カスタマイズされたリソース テーブル。サンプルコードとデータがZenodo21にアップロードされます。

著者には開示すべき利益相反はありません。