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方法論記事

赤血球メカノセンシングを調査するための蛍光マイクロピペット吸引アッセイ

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DOI:

10.3791/66265

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2024年1月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4The University of Sydney Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney

この記事について

サマリー

機械的ストレス下での細胞の挙動の探索は、細胞力学とメカノバイオロジーの進歩にとって極めて重要です。蛍光マイクロピペット吸引(fMPA)技術は、制御された機械的刺激と単一細胞における細胞内シグナル伝達の包括的な解析を組み合わせた新しい方法です。この手法は、生細胞メカノバイオロジーの新しい詳細な研究を調査します。

要約

マイクロピペット吸引アッセイは、長い間、生細胞力学の研究の基礎となっており、機械的ストレスに対する細胞の応答に関する洞察を提供してきました。この論文では、蛍光結合マイクロピペット吸引(fMPA)アッセイの革新的な適応について詳しく説明します。fMPAアッセイは、イオンチャネルによって媒介される生細胞のメカノトランスダクションプロセスを同時にモニタリングしながら、正確な機械的力を投与する機能を導入します。洗練されたセットアップには、精密に設計されたホウケイ酸ガラス製マイクロピペットが、細かく調整された貯水槽と空気圧吸引システムに接続されており、1mmHg±まで細かく刻みで制御された圧力適用を容易にします。重要な機能強化は、落射蛍光イメージングの統合であり、吸引中の細胞形態学的変化と細胞内カルシウムフラックスの同時観察と定量化を可能にします。fMPAアッセイは、落射蛍光イメージングとマイクロピペット吸引の相乗的な組み合わせにより、機械的に困難な環境下での細胞メカノセンシングの研究に新たな基準を打ち立てます。この多面的なアプローチは、さまざまな実験設定に適応可能であり、シングルセルのメカノセンシングメカニズムに関する重要な洞察を提供します。

概要

細胞挙動の世界で次々と発見が明らかになり、接着、移動、分化などの動的な細胞活動を決定する上で、張力、流体せん断応力、圧縮、基質の剛性などの機械的刺激が果たす役割が強調されています。これらの機械生物学的側面は、細胞が生理学的環境とどのように相互作用し、応答し、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えるかを解明する上で最も重要です1,2。

過去10年間、マイクロピペットベースの吸引アッセイは、機械的刺激に対する多様な細胞応答を研究するための汎用性の高いツールとして際立っています。この手法は、細胞の弾性率、剛性、皮質張力など、単一細胞レベルでの生細胞の本質的な機械的特性に関する貴重な洞察を提供します。これらのアッセイにより、細胞膜の張力、細胞膜にかかる圧力、皮質の張力など、さまざまな機械的パラメータを測定できます(表1に要約)。野心的な力を研究することで、特に断片化、伸長、出芽などの膜動態の領域において、それらが細胞の機能とプロセスにどのように影響するかについての理解が深まりました3,4。

機械的パラメータ形容独創的なアプローチ
セルの剛性(Cell Stiffness)細胞の機械的剛性と弾性の測定。細胞膜の吸引と陰圧に対する変形応答の解析20,21.
接着強度細胞が表面にどれだけ強く接着するかの評価。付着した細胞を基質から剥離するための制御された吸引の適用2,22。
膜張力細胞膜内の張力またはストレスの評価。加えられた圧力23,24に応答する膜変形の測定。
粘 弾性細胞の粘性と弾性を組み合わせた挙動の特性評価。吸引に対する時間依存変形応答の解析23,25.
変形 能細胞の形状がどれだけ簡単に変化できるかの決定。制御された吸引下での変形の程度の評価20,24。
表面張力細胞表面の張力の測定。マイクロピペット膜突起部26を形成するのに必要な圧力の評価。
細胞-材料相互作用細胞と材料または基質との相互作用の研究。異種物質と接触する細胞の吸引と相互作用の観察2,24.
細胞間相互作用隣接細胞間の相互作用の検討細胞群の吸引と細胞間力の解析27.

表1:マイクロピペット吸引アッセイによって特徴付けられる機械的パラメータ。

マイクロピペットベースの吸引技術は、赤血球(RBC)の研究に広く使用されており、循環器系における赤血球の機能を理解するために不可欠な赤血球の変形性やさまざまな機械的特性を評価しています。赤血球は驚くべき適応性を示し、複雑な毛細血管ネットワークや内皮間裂を通過する際の変形に対する機械的汎用性を維持します5,6。この旅の間、赤血球は0.5〜1.0μmの狭い通路を横断しなければならず、引張や圧縮7,8,9を含む多数の機械的力にさらされます。また、循環中の血流によって発生するせん断応力に対しても高い感度を有する10。これらのプロセスは、機械的刺激に対する細胞応答において確立された役割を持つ重要なシグナル伝達イベントであるカルシウム流入を含む調節メカニズムの活性化を促進します11,12。カルシウムを介したメカノセンシングを支配する複雑なメカニズムは、現在進行中の研究の魅力的なテーマです。

これに関連して、fMPAは、精密に制御された機械的力の下でのカルシウム動員の程度を明らかにするための効果的なアプローチであり、機械的調節(マイクロピペット吸引システムを使用)とカルシウム強度の視覚化(蛍光インジケーターを使用)を同時に適用できます。特に、赤血球が狭窄した血管を通って移動する生理学的シナリオを模倣しています。特筆すべきは、当社が開発したfMPAシステムが1mmHgの分解能で圧力を発生させることです。実装された高速度カメラは、100msの時間分解能とサブミクロンメートルレベルの空間分解能を実現できます。これらの構成により、生細胞に機械的力を正確に適用し、同時に結果として生じる細胞シグナル伝達を捕捉することができます。さらに、このセットアップの統合的工学的性質により、マイクロピペット吸引アッセイは他の機器や技術を補完するために容易に適応することができ、細胞力学の複雑さをさらに探求することができます。この汎用性は、このアプローチのさらなる利点です。

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プロトコル

このプロトコルは、シドニー大学のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従い、承認されています。この研究のドナーからインフォームドコンセントが得られました。

1. ヒト赤血球単離

注:ステップ1.1は、治験審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して、訓練を受けた瀉血専門医が実行する必要があります。

  1. 19 Gのバタフライニードルを使用して、正中肘静脈から5 mLの血液を採取します。
  2. 採取した血液を1:200のエノキサパリンを含む15mLチューブに移し、凝固を防ぎます。
  3. 5 μL のエノキサパリン抗凝固血液を 1 mL の炭酸塩/重炭酸塩緩衝液 (C 緩衝液、pH = 8.5-9; Table of Materialsを参照)。
  4. 希釈した血液サンプルを900 × g で1分間遠心分離し、赤血球を沈殿させます。
  5. RBCペレットを1 mLのCバッファー(材料表)で2回洗浄し、毎回900 × g で1分間遠心分離します。
  6. 続いて、同じ遠心分離条件で RBC ペレットを 1 mL の Tyrode バッファーで 2 回洗浄し、最終ペレットを 1 mL の Tyrode バッファーに再懸濁して、洗浄したストック RBC 懸濁液を得ます。

2.カルシウムインジケーターのローディング

  1. 自動セルカウンター(材料表)を使用して得られた細胞数に基づいて、洗浄したストックRBC溶液の濃度をTyrodeの緩衝液中で10×106 cells/mLに調整します。
  2. カルシウム感受性色素である16.67 μM Cal-520 AMとインキュベートし、ロータリーチューブミキサーで1時間撹拌することにより、赤血球内のカルシウムを標識します。
  3. 赤血球を0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むチロードの緩衝液で1:50の比率で希釈します。これで、細胞を実験的に使用する準備が整いました。

3. マイクロピペットの作製

  1. ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(外径1mm×内径0.6mm)をP-1000マイクロピペットプーラーに取り付け、プリセットのプルプログラムを使用して、プル部位で先端が閉じた対応するマイクロピペットを2本作製します。このセットアップでは、熱 516、引張 150、速度 75、時間 250、圧力 500 のプル プログラム値を使用します。
    注:引っ張りプログラムで設定された加熱および引っ張りパラメータはカスタマイズ可能であり、実験計画12の所望の設定に依存する。 CHECKPOINT ( 補足表 S1 を参照)。
  2. マイクロピペットカッターに引っ張った後に調達したクローズエンドのマイクロピペットの1つを取り付けて、閉じたチップを開きます。加熱温度を約50〜60°Cに調整します。
  3. 10倍接眼レンズを使用してマイクロピペットの位置を確認します。マイクロピペットをホウケイ酸ガラスビーズに近づけて、ノブを使って調整します。
  4. 接眼レンズを30倍に交換してから、ピペットの先端を曲げずにマイクロピペットをホウケイ酸ガラスビーズにできるだけ近づけます。
  5. 加熱ペダルを踏んで、熱を使用してホウケイ酸ガラスビーズを柔らかくします。未加工の閉じたマイクロピペットチップを、目的の終点である開口部の直径に達するまで、柔らかくしたビーズにそっと挿入します。
  6. フットペダルを放し、ガラスビーズを冷まします。マイクロピペットの先端が常にビーズの内側に残っていることを確認してください。
    注意: チップをさらに挿入すると、開口部の直径が大きくなります。
  7. マイクロピペットを静かに引き抜くと、閉じたマイクロピペットがまっすぐに切り取られます。キャピラリーの最終直径が1μmであることを確認します。
    注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)

4. 細胞室の準備

  1. ダイヤモンドペンシルを使用して、標準的な40 mm x 22 mm x 0.17 mmのガラスカバーガラスを3等分します。
  2. カットしたガラスカバーガラスの1枚を、自家製のチャンバーホルダーの底に真空グリースで接着します。
    注意: チャンバーホルダーは、湾曲したハンドルでリンクされた2つの金属(銅/アルミニウム)の正方形で構成されています。金属ブロック間の距離は、カットカバーガラスがホルダーに付着して平行チャンバーを形成するために40mm未満に及ぶ必要があります。
  3. カットしたガラスカバーガラスの2枚目を、自家製のチャンバーホルダーの上部に真空グリースで接着します。
    注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)
  4. 200 μLのピペットガンを使用して、200 μLの標識RBC懸濁液を2枚のカバーガラスの間に注入します(図1)。

figure-protocol-1
図1:細胞室の図。 40 mm x 22 mm x 0.17 mmのガラスカバースリップの2つのカットピースをグリースを使用してチャンバーホルダーに接着します。2枚のカットガラスカバーガラスの間に、Tyrodeの緩衝液中の約200 μLの細胞溶液を播種します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

5. マイクロピペット吸引アセンブリ

  1. 細胞チャンバーを顕微鏡プラットフォームにあるホルダーステージに取り付けます。細胞室が対物レンズの真上になるように位置を調整します(図2B)。
  2. マイクロピペットホルダーを、接続されている貯水槽の液面より下まで下げます。
  3. 脱塩水またはTyrodeの緩衝液を作製したマイクロピペットに注入し、34 Gの針と組み合わせたシリンジを使用して、すべての気泡を慎重に除去します(材料表を参照)。
  4. マイクロピペットホルダーの端を半分ほど緩め、マイクロピペットホルダーから数秒間水が滴り落ちるのを待ちます。
    注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)
  5. マイクロピペットをホルダーチップに挿入します。ホルダーのネジを締めて、マイクロピペットが固定されていることを確認します。
  6. マイクロピペットを細胞チャンバーに挿入し、顕微鏡下でマイクロピペットと赤血球の位置を確認します。マイクロマニピュレーターを使用して位置を調整します。
  7. マイクロピペットチップをさらに下げて、チップが配置されたRBCと水平になるようにします。
    注: チェックポイント ( 補足表S1を参照)
  8. 貯水槽の高さを調整して、マイクロピペットチップの油圧をゼロにします。次に、貯水槽を少し上げて、先端に微妙な陽圧を発生させます。

6. 蛍光結合マイクロピペット吸引アッセイの実施

  1. 488 nmの蛍光励起光源をオンにします。この段階では、光退色を避けるために蛍光シャッターをオンにしないでください(図2C)。蛍光カメラと透過カメラの電源を入れます。
    注意: 両方のカメラは、適切なソフトウェアを使用して操作されます( 材料表を参照)。
  2. ソフトウェアで、両方のカメラに必要な 露光時間 (この研究では両方のカメラで100ミリ秒 )、関心領域(ROI)、ビニングサイズ(この研究ではなし)を設定します。 多次元取得パネル を開き 、取得フレーム番号(このスタディでは2,000)、および保存ディレクトリを設定します。
    注:アクイジションフレーム番号は、記録する吸引イベントの数によって異なります。1つの吸引イベントの場合、取得数の範囲は100〜500、つまり約10〜50秒の範囲で設定する必要があります。
  3. マイクロマニピュレーターを使用して、視野の下にあるマイクロピペットを見つけます。
  4. コントロールボックスとクランプシステムを含む空気圧クランプをオンにします(図2A)。 コントロールボックス が EXTRNLモードになっていることを確認してください。ノブをゆっくりと回転させることにより、システム内のオフセット圧力を補正します。
  5. 空気圧クランプを制御する別のソフトウェアをオンにします。このソフトウェアには、クランプシステムへのディスクリートアナログ入力を制御するための電気制御パネルがあります。圧力は20mV/mmHgの変換係数で制御されます。
  6. システム内の圧力をゼロにします。マイクロピペットを慎重に赤血球に近づけ、マイクロピペットの先端に微妙な陽圧がかかるまで貯水池の位置を調整します。
  7. カメラ操作ソフトウェアで撮影を開始します。 蛍光シャッターのスイッチを入れます。
  8. 計算した電圧の大きさをコントロールパネルに入力してRBCを吸引し、目的の圧力に到達します。
    注:RBCを吸引するための圧力は、通常、Δp = -5〜-40mmHg の範囲です。マイクロピペットチップ内に顕著な舌の伸びがあるはずです(図2D)。
  9. あらかじめ設定された期間、圧力を保持します。次に、圧力を解放します。
  10. マイクロピペットを動かして次の細胞を拾い上げ、実験を繰り返します。

7. 蛍光強度分析

  1. 保存した蛍光画像を解析ソフトウェアに読み込みます。
  2. ディスプレイ調整タブを使用して、強度しきい値を調整します。これを行うには、値を手動で入力するか、スライダーを使用して、解析ソフトウェアで蛍光画像に細胞の明確なコントラストが表示されるようにします(補足ファイル1-補足図S1を参照)。
  3. ソフトウェアの下部にあるタイムラインまでスクロールします。指定されたアスピレーションイベントを見つけます。
  4. Add new surfacesをクリックします。解析 ROI を定義します。
    メモ: このソフトウェアでは、セグメンテーションを調整して完了するためのガイド付きの 5 ステップのプロセスが用意されています( 補足ファイル 1 - 補足図 S2 および補足 図 S3 を参照)。
    注: 計算リソースを節約するために、ROI をできるだけ小さくしてください。
  5. 背景の減算スライダーを使用し、スライダーを使用してセグメンテーションの閾値を調整し、最適なセグメンテーション結果を得ることができます。
    注:これは、吸引イベントとは別に、背景を可能な限り正確にセグメント化する必要があることを意味します( 補足ファイル1-補足図S4 および 補足図S5を参照)。
  6. バックグラウンドノイズを除外する エリア フィルターを追加します( 補足ファイル1-補足図S6を参照)。
    注: これは、ポスト プロセスの段階で完了します。
  7. [統計情報] タブを選択します。 |詳細タブ |「平均値」タブ。スクロールして強度平均を見つけて選択します(補足ファイル1-補足図S7を参照)。
  8. 経時的な蛍光シグナルトレースを.csvファイルにエクスポートします。
  9. エクスポートした csv ファイルを開きます。すべての測定値からバックグラウンド信号 Fb を減算します。
  10. 式(1)を使用して、カルシウム強度の変化ΔFmaxを計算します。
    figure-protocol-2(1)
    但し、ΔFmaxは最大カルシウム強度変化量、FBはバックグラウンド強度、F0は静止強度である。

figure-protocol-3
図2:蛍光結合マイクロピペット吸引アセンブリ。 (A)倒立顕微鏡と明視野カメラおよび蛍光カメラを組み合わせたfMPAハードウェアシステムの概要。画像の左側は、自家製の水圧計と、空気圧ポンプの圧力を正確に調整できるコントロールボックスを示しています。(B)1本のマイクロピペットで実験細胞室とマイクロマニピュレーターシステムを描いた顕微鏡ステージ。(C) fMPAシステムのセットアップの概略図。2つのダイクロイックミラーを使用して明視野(黄色)と蛍光(青色発光、緑色励起)信号を同時にイメージングし、蛍光光源(青)からターゲットに光路を導き、次にイメージング用のカメラ(緑)に光路を向けます。(D)上段は明視野画像、下段は蛍光画像です。左は、赤血球が安静時の吸引前のマイクロピペットの位置です。中央の列は、赤血球が-40 mmHgの陰圧を受ける吸引プロセスのスナップショットです。右図は、負の吸引圧を受けた後の細胞の形態を示しています。スケールバー = 5 μm。略語: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration;DM = ダイクロイックミラー;RBC = 赤血球。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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結果

マイクロピペット吸引アッセイを確立するために、まず、ハンドルで接続された2つの金属製の正方形(銅/アルミニウム)で構成されるカスタムセルチャンバーを構築しました。2枚の3次カットガラスカバーガラス(40 mm × 7 mm × 0.17 mm)を貼り付けて、Tyrodeの緩衝液に懸濁した200 μLの赤血球で満たされたチャンバーを作成しました。赤血球をチャンバーに導入した後、テーラードホウケイ酸マイクロピペットをホルダーに固定し、マイクロマニピュレーターを使用してチャンバー内に慎重に配置しました。続いて、マイクロピペットを近づけて、ターゲットの赤血球を捕捉しました。

細胞吸引では、空気圧式高速圧力クランプを使用して負の吸引圧力を微調整しました。次に、さまざまな負の吸引圧を適用した場合のカルシウムの動員を調べるために、蛍光イメージングを実施しました。

fMPAを用いて、赤血球がさまざまな負圧吸引にどのように反応するかを調べることで、加えられた陰圧と吸引された赤血球に存在するカルシウム流入の間には明確な比例関係があることが明らかに...

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ディスカッション

マイクロピペット吸引アッセイは、細胞バイオメカニクスの深遠な複雑さを探るために、実質的な圧力調節、正確な空間オーケストレーション、信頼性の高い時間的識別力を駆使して、洗練された方法論を具現化しています。この研究は、さまざまな刺激下で赤血球が示す微妙な機械感受性反応を明らかにするための重要なツールとしてのfMPAの適用に特に重点を置きます。明視野信号と蛍光信号を同時に使用することで、細胞現象の多面的な調査が可能になり、細胞内カルシウム流入のリアルタイムでのモニタリングと検出が進みました。このアプローチは、赤血球の複雑なメカノセンシング反応に関する統合的な洞察を提供します。

重要なことは、fMPA技術の適用性は、血小板やニューロンなど、高い機械的感受性を欠く他の細胞タイプにも適用できるため、RBCにとどまらないことです9。さらに、fMPAは、実験中の細胞の完全性への影響が最小限に抑えられるため、細胞の自然な状態の維持を保証し、初代細胞での使用に非常に適しています1。さらに、fMPA法は、マイ...

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開示事項

著者らは、本研究に関して報告する競合する利害関係がないことを宣言する。

謝辞

Nurul Aisha Zainal Abidin氏とLaura Moldovan氏には、追加のドナー募集、採血、瀉血のサポートに感謝します。機器と試薬を整理してくれたTomas Anderson氏とArian Nasser氏に感謝します。この研究は、オーストラリア研究評議会(ARC)のディスカバリープロジェクト(DP200101970-L)から資金提供を受けました。A.J.);オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)のアイデア助成金(APP2003904-L。A.J.);NHMRC機器助成金-LAJ;ニューサウスウェールズ州心臓血管能力開発プログラム(初期-中期キャリア研究者助成金-LAJ);NSW CVRN-VCCRI研究イノベーション助成金;Office of Global and Research Engagement(シドニー・グラスゴー・パートナーシップ・コラボレーション・アワード-L.A.J.);L.A.J.は、National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2(105863)およびSnow Medical Research Foundation Fellow(2022SF176)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
&マイクロ;ManagerMicro-ManagerVersion 2.0.0
1 mLシリンジ テルモ210320Dマイクロフィルに協力する 
200 µLピペット エッペンドルフ 3123000055レッドクロードセル調製
22 x 40 mm カバースリップニットガラス MS0014セルチャンバーアセンブリ
50 mL シリンジ テルモ220617E給水塔に接続する
塩化カルシウム (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Tryode's  バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2.最終pH = 7.2
遠心分離機 5425エッペンドルフ 5405000280レッドクロード細胞製剤
クレキサンSigma-Aldrich1235820採取した血液の凝固を防ぐため 10,000 U/mL
DAQami勤勉な
蛍光光源CoolLEDpE-300マイクロピペット吸引ハードウェアシステム
ガラスキャピラリー成重G-1マイクロピペット製造
GlucoseSigma-AldrichG8270Tryode's  バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2 を補給。最終pH = 7.2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's 緩衝液調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2
高速GigEカメラMantaG-040Bマイクロピペット吸引ハードウェアシステム
高速圧力クランプ科学機器HSPC-2-SB圧力ポンプと協力
高速圧力クランプヘッドステージ 科学機器HSPC-2-SB圧力ポンプと協力
イマリス・オックスフォード・インスツルメンツ
倒立顕微鏡 オリンパス オリンパスIX83マイクロピペット吸引ハードウェアシステム
Microfil 世界の精密機器 MF34G-534 G (67 mm Long)
切断したマイクロピペット内の気泡を回収し、ピペットチップの開口部をテストします 
マイクロピペットプーラー サッター機器P1000マイクロピペット製造 
Milli Q EQ 7000 超純水製造装置Merck MilliporeZEQ7000T0C炭酸塩/重炭酸塩バッファー &Tryodeのバッファー調製
ピペットマイクロフォージ NarishigeMF-900マイクロピペット製造
塩化カリウム(KCl)Sigma-AldrichP9541Tryode's バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2
Pressue Pump 科学機器PV-PUMPは、実験中に制御された圧力を誘導します
Prime 95Bカメラ PhotometricsPrime 95B sCMOSFlourscent イメージング
ロータリーホイール リモートユニット センサペックス uM-RM3マイクロピペット位置調整用コントロールパネル 
Scepter 3.0 Handheld Cell CounterMerck MilliporePHCC340KIT自動セルカウンター
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761炭酸塩/重炭酸塩緩衝液調製 - 2.65 g の NaHCO3 と 2.1 g の Na2<>> と 250 mL の Mili Q 水 - 最終 pH = 8-9。
炭酸ナトリウム (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127炭酸塩/重炭酸塩緩衝液調製 - 2.65 g の NaHCO3 と 2.1 g の Na2CO3 を 250 mL の Mili Q 水に溶かして - 最終 pH = 8-9。
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's 緩衝液調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および5.5 mM D-グルコースに1 mM CaCl2を補給。最終pH = 7.2
ナトリウム一塩基
一水和物(NaH2PO4•H2O)		Sigma-AldrichS9638Tryode's  バッファー調製 - 12 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、および 5.5 mM D-グルコースに 1 mM CaCl2.最終pH = 7.2
タッチスクリーンコントロールユニット センサペックス uM-TSCマイクロピペットの位置調整用コントロールパネル 
Xドライ対物レンズ オリンパス オリンパス 60x/0.70 LUCPlanFLマイクロピペット吸引ハードウェアシステム
する リン酸

参考文献

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