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方法論記事

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

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DOI:

10.3791/66271

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2024年6月14日

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1Division of Evolution, Infection and Genomics, School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Sciences, The University of Manchester, 3Department of Earth and Environmental Sciences, School of Natural Sciences, The University of Manchester

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、低コストでエネルギー効率の高いベンチトップサーモミキサーをインキュベーターとして利用し、好熱菌に適応するための実験的進化プロトコルを紹介します。この技術は、最適な成長温度が75°Cの古細菌である Sulfolobus acidocaldariusの温度適応の特性評価を通じて実証されています。

要約

古細菌 Sulfolobus acidocaldarius は、有望な好熱性モデルシステムとして浮上しています。好熱菌が温度変化にどのように適応するかを調べることは、基本的な進化過程を理解するためだけでなく、バイオエンジニアリングのシャーシとして S.acidocaldarius を開発するための重要な要件です。好熱菌を用いた実験的進化を行う上での大きな障害の1つは、機器のメンテナンス費用と、従来の高温成長のためのインキュベーターのエネルギー使用です。この課題に対処するために、低コストでエネルギー効率の高いベンチトップサーモミキサーを利用して、 S. acidocaldarius の実験進化を実施するための包括的な実験プロトコルが提示されます。このプロトコールには、比較的少量(1.5 mL)のバッチ培養技術が含まれており、複数の独立した系統での適応の追跡が可能です。この方法は、追加のサーモミキサーを使用することで簡単に拡張できます。このようなアプローチは、初期投資と実験的研究に関連する継続的なコストの両方を削減することにより、モデルシステムとしての S.acidocaldarius のアクセシビリティを高めます。さらに、この技術は、多様な環境条件への適応を探求するために、他の微生物システムにも応用できます。

概要

地球上の初期の生命は、非常に高い温度と酸性度を特徴とする熱水噴出孔などの極限環境で生まれた可能性があります1。微生物は、温泉や火山性ソルファタラなどの極限環境に生息し続けています。これらの極限条件下で発生する進化のダイナミクスを特徴づけることは、これらの条件下での生存を可能にする特殊な生理学的プロセスに光を当てるかもしれません。これは、生物多様性の起源の理解から、バイオテクノロジーへの応用による新しい高温酵素の開発まで、幅広い意味を持つ可能性があります。

極限環境における微生物の進化動態の理解は、その決定的な重要性にもかかわらず、まだ限られています。対照的に、中温性環境における進化に関する重要な知識は、実験的進化として知られる技術の適用を通じて獲得されました。実験的進化は、実験室条件下で進化的変化を観察することを含む2,3,4,5。多くの場合、これには定義された変化環境(例えば、温度、塩分、毒素または競合生物の導入)が含まれます7,8,9。全ゲノムシーケンシングと組み合わせることで、実験的進化により、並列性、再現性、適応のためのゲノム基盤など、進化プロセスの主要な側面をテストすることができました。しかし、今日まで、実験的進化の大部分は中温微生物(細菌、真菌、ウイルス2,3,4,5を含むが、古細菌は大部分を除く)で行われてきました。好熱性微生物に適用可能な実験的進化の方法により、微生物がどのように進化するかをよりよく理解し、進化のより包括的な理解に貢献することができます。これは、地球上の好熱性生命の起源の解読から、高温バイオプロセス10や宇宙生物学研究11で使用される「極限性」を含むバイオテクノロジーへの応用まで、潜在的に幅広い意味合いを持っています。

古細菌Sulfolobus acidocaldariusは、好熱菌の実験的進化技術を開発するためのモデル生物として理想的な候補です。S. acidocaldariusは好気的に繁殖し、最適な生育温度は75°C(55°Cから85°Cの範囲)で、酸性度は高い(pH 2-3)4,6,12,13,14です。驚くべきことに、その極端な成長条件にもかかわらず、S. acidocaldariusは中葉7,15,16,17,18に匹敵する個体密度と突然変異率を維持しています。さらに、比較的小さく、十分に注釈されたゲノム(DSM639株:2.2 Mb、36.7%GC、2,347遺伝子)12;S. acidocaldariusはまた、堅牢なゲノムエンジニアリングツールの恩恵を受けており、標的遺伝子ノックアウトを通じて進化過程を直接評価することができる19。この顕著な例は、MW00119 および SK-120 のウラシル補助栄養株など、S. acidocaldarius の遺伝子組み換え株の利用可能性であり、これらは選択可能なマーカーとして機能することができます。

S. acidocaldariusのような好熱菌を用いた実験的進化には大きな課題があります。これらの研究に必要な高温での長時間のインキュベーションは、液体と固体の両方の培養技術にかなりの蒸発を課します。高温での長時間の運転は、液体媒体の実験的進化で一般的に使用される従来の振とうインキュベーターを損傷する可能性もあります。複数の温度を探索するには、複数のインキュベーターを取得して維持するための多額の財政投資が必要です。さらに、必要なエネルギー消費量が多いため、環境面および財政面で大きな懸念が生じています。

この研究では、S. acidocaldariusのような好熱菌で実験的進化を行う際に遭遇する課題に対処する方法を紹介します。Baesらが熱ショック応答を調査するために開発した技術14,21に基づいて、ここで開発された方法は、ベンチトップサーモミキサーを利用して、一貫した信頼性の高い高温インキュベーションを実現します。その拡張性により、複数の温度処理を同時に評価することができ、追加のインキュベーション装置を購入するコストを削減できます。これにより、実験効率が向上し、好熱菌の進化ダイナミクスに影響を与える要因の堅牢な統計分析と広範な調査が可能になります22。さらに、このアプローチは、従来のインキュベーターと比較して、財務的な初期投資とエネルギー消費を大幅に削減し、より持続可能で環境に優しい代替手段を提供します。

私たちの方法は、地球上の生命の多様化の初期段階で重要な役割を果たした可能性のある極端な温度を特徴とする環境における進化のダイナミクスを実験的に調査するための基礎を築きます。好熱性生物は独自の特性を持っていますが、その極端な成長条件と特殊な要件により、モデルシステムとしてのアクセシビリティが制限されることがよくあります。これらの障壁を克服することは、進化のダイナミクスを調査するための研究機会を拡大するだけでなく、科学研究のモデルシステムとしての好熱菌の幅広い有用性を高めることにもなります。

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プロトコル

1. S. acidocaldarius 増殖培地(BBM+)の調製

注:S.acidocaldariusを培養するために、このプロトコルはBasal Brock Medium(BBM +)23を使用します。これは、まず以下に概説する無機ストック溶液を組み合わせてBBM−を作成することによって調製されます。これは、事前に調製することができます。次に、必要に応じて有機ストック溶液をBBM−に添加することにより、BBM+を調製します。ストック溶液のレシピも表1に示します。すべての培地およびストック溶液は、再蒸留H2O(ddH2O)で調製する必要があります。

  1. 成長培地用の無機ストック溶液の調製
    1. 微量元素ストック溶液を調製します。
      1. 9 g/Lの四ホウ酸ナトリウム十水和物(Na2B4O7・10H2O)をddH2Oに加え、続いて1:1 H2SO4 を溶解するまで滴下して、微量元素ストック溶液を調製します。
      2. 0.44 g/Lの硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4・7H2O)、0.1 g/Lの塩化銅(II)二水和物(CuCl2・2H2O)、0.06 g/Lのモリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4・2H2O)、0.06 g/Lのバナジウム(IV)硫酸二水和物(VOSO 4.2H2O)、0.02 g/Lのコバルト(II)硫酸塩七水和物(CoSO4・7H2O)を順次導入します。 3.6 g / Lの塩化マンガン(II)四水和物(MnCl2・4H2O)。溶液をオートクレーブで処理し、4°Cで保存します。
    2. 20 g/L の塩化第二鉄六水和物 (FeCl3・6H2O) を ddH2O に溶解して Fe ストック溶液 (1000x) を調製し、0.22 μm フィルターでろ過して溶液を滅菌し、4 °C で保存します。
    3. 70 g/L 塩化カルシウム (CaCl2・2H2O) を二重蒸留水 (ddH2O) に溶解して、ブロック溶液 I (1000x) を調製します。オートクレーブ処理し、4°Cで保存します。
      注意:CaCl2・2H2Oを水に溶解することは発熱プロセスです。この手順は注意して実行してください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。圧力がかかる可能性があるため、容器をしっかりと閉じないでください。
    4. 130 g/Lの硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、25 g/Lの硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O)、28 g/Lのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、および50 mLの先に調製した微量元素ストック溶液を組み合わせて、ブロック溶液II/IIIを調製します。1:1 H2SO4を使用して、原液のpHを2〜3に調整します。溶液をオートクレーブし、室温(RT)で保存します。
  2. 成長培地用の有機ストック溶液の調製
    1. D-グルコースストック溶液(100x)を調製し、300 g/L(30% w/v)のD-グルコースをddH2Oに溶解し、0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。4°Cで保存してください。
      注:実験要件に応じて、D-グルコースの代わりに他の炭素源(D-キシロースなど)を使用することができます。
    2. カゼイン原液(100x)からペプトンを調製し、カゼインからペプトンを100 g/LでddH2O.オートクレーブに溶解し、原液をRTで滅菌および保存します。
    3. 2 g/L のウラシルを ddH2O に溶解してウラシル原液 (100x) を調製し、滅菌をろ過します (0.22 μm フィルターを使用)。-20°Cで保存してください。
  3. 1倍の作業濃度でのBBM+ 増殖培地の調製
    1. まず、オートクレーブにより988mLの滅菌ddH2Oを調製します。
    2. 1 mLのBrock Stock Solution I、10 mLのBrock Stock Solution II/III、および1 mLのFeストック溶液を、以前にオートクレーブした988 mLの滅菌ddH2Oに添加して、1 L BBM−を調製します。中程度のpHを2〜3の範囲に調整し、1:1 H2SO4を使用します。
      注:BBM− は事前に作成し、RTで最大1ヶ月間保管することができます。
    3. 最後に、1 L BBM+を調製するには、D-グルコース原液、カゼイン原液のペプトン、およびウラシル原液をそれぞれ10 mLずつ組み合わせ、985 mLのBBM−を組み合わせます。よく混ぜて、1:1 H2SO4で培地のpHを2-3に調整します。
      注意: BBM + は必要に応じて新しく作る必要があります。
  4. BBM+ 固体培地の調製
    1. MgCl2 およびCaCl2の1 Mストック溶液を調製します。これらは、BBM固体媒体の固化に役立ちます。1 M MgCl2の場合、100 mLのddH2Oに9.5 gを加えます。1 M CaCl2の場合、100 mLのddH2O.オートクレーブに11 gを加えて滅菌します。
      注意:CaCl2・2H2Oを水に溶解することは発熱プロセスです。この手順は注意して実行してください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。圧力がかかる可能性があるため、容器をしっかりと閉じないでください。
    2. 3%(w / v)ジェランガム(例:30 g / L)をddH2Oおよびオートクレーブに混合して滅菌します。
      注:ここでは、標準的な細菌寒天は75°Cで固化できないため、ジェランガム(ジェライトなど)をゲル化剤として使用します。
    3. これとは別に、ステップ1.4.1で調製した滅菌ジェランガムと1:1の比率で混合する固形培地用のBBM+ を調製します。
      1. まず、ステップ1.3.2のように1L BBM− を準備します。887 mLのBBM− を1 mLのFeストック溶液と、D-グルコースストック溶液、カゼインストック溶液のペプトン、およびウラシルストック溶液の各20 mLと組み合わせます。.
      2. 40 mLの1 M MgCl2 と12 mLの1 M CaCl2を添加します。よく混ぜて、1:1 H2SO4で培地のpHを2-3に調整します。
        注:ここで添加するストック溶液の量は、ステップ1.3の液体BBM+ の調製よりも意図的に多くなっています。これは、次のステップで溶融したジェランガムと1:1の比率で混合するためです。
    4. 固体媒体のBBM+ を約75°Cに予熱し、ddH2Oで溶融したジェランガムと1:1の比率で混合します。よく混合し、熱安定性プラスチック(ポリプロピレンなど)、ガラスシャーレ、または6ウェルプレートに注ぎます。寒天は急速に固まるため、ブレンドしたらすぐに使用してください。
      注:微生物学に一般的に使用される一部のポリスチレン90mmシャーレは、高温で長期間インキュベートすると変形します。
      注意: 高温の液体を取り扱うときは、適切な安全対策を講じてください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。

2. 冷凍ストック培養物からの S.acidocaldarius の復活

  1. 十分な曝気と酸素の利用可能性を確保するための換気成長チューブの準備。
    1. 事前に、 Sulfolobus 増殖用の穴あけ2 mL微量遠心チューブを準備します。.鈍いワイヤー(>0.7mm、まっすぐに伸ばしたペーパークリップなど)をブンゼンバーナーの炎で丁寧に加熱し、チューブの蓋に穴を開けると、約1mmの小さな穴が開けられます。
    2. 穴を開けたチューブをオートクレーブ可能な容器(空のピペットチップボックスなど)に入れ、オートクレーブで滅菌します。
      注意: EN407定格のサーマルハザードグローブを着用して、加熱された金属による手の熱傷から保護してください。過熱を防ぐために、ワイヤーを短時間(1〜2秒)だけ加熱します。融解温度の高い金属(鋼)のみを使用します。
  2. S. acidocaldariusのスターター培養物を接種します。
    1. オートクレーブ処理したピアス2 mLチューブに、予熱したBBM+1.5 mL(セクション1で調製し、75°Cで少なくとも15分間プレインキュベート)を入れます。
    2. グリセロールストック(25%v / vグリセロール、-80°Cで保存)からBBM +充填チューブをスクレイピング(50〜60 mgに相当)して接種します。ここでは、 S. acidocaldarius 株DSM639を用いている。ネガティブコントロールとして、追加のチューブに1.5mLのBBM+を充填します。
  3. ピアスされた2 mLチューブの蓋からエアロゾルが漏れて成長環境(およびその他のサンプル)を汚染するのを防ぎ、チューブ内の培養蒸発のばらつきを減らすために、高温(65-85°C)に耐え、微生物の逃げ/浸透をブロックできるガス透過性メンブレンを蓋の上に置きます。
    注:チューブをシールするためにガス透過性メンブレンを使用すると、蒸発が大幅に減少します。75°Cでの48時間期間中、密封されたチューブの平均体積損失は8.63%(範囲:3.29-16.45%、 n = 24回のテクニカルレプリケート、2回繰り返される)であるのに対し、非密封チューブでは25.05%(範囲:11.92-62.91%、 n = 24テクニカルレプリケート、2回繰り返される)を示します。
  4. 接種したチューブをサーモミキサーで75°Cでインキュベートし、毎分400回転(RPM)で48〜72時間、または外径600nm が0.3〜0.8に達するまで分光光度計で測定します。
    注:2mLチューブの穴あけ蓋と振とうにより、最適な成長のための適切な曝気が可能になります。サーモミキサーの蓋は、一定の温度が維持され、蒸発を減らすために所定の位置にある必要があります。
  5. インキュベーション期間の後、復活した培養物に2回目の成長段階(プレコンディショニング)を与えます。
    1. チューブを5000 x g でRTで2分間回転させることにより、培養物をペレット化します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを新鮮な1.5 mLの温かいBBM+に再懸濁します。
      注:この実験では、 S.アシドカルダリウス 野生型DSM639株を使用していますが、これらの成長方法と実験的進化は、任意の スルフォロバス 株および潜在的に他の好熱性植物に適用することができます。

3. S. acidocaldariusの人口密度、倍加時間、指数関数的成長期の決定

  1. 選択した選択条件の人口密度と指数関数的成長フェーズまでの時間を決定します。テストする環境条件ごとに、手順2.1〜2.5に従って3つのスターター培養を準備します。
  2. BBM+ の3つの培養物をOD600nm の0.01に希釈します。各培養物から少なくとも20mLを作ります。これら 3 つのカルチャは、技術的なレプリケートを表します。
  3. 破壊的なサンプリングを使用して、OD600nm の成長曲線を経時的に再現します。
    1. ステップ 2.1 で穿孔した 2 mL チューブを 24 本調製し、8 本ずつの 3 セットに分けて、これらのテクニカルレプリケート 1、2、3 を標識します(例:8 本のチューブを replicate 1 などとラベル付けします)。
    2. ステップ3.2で希釈した3つの培養物のそれぞれから、1.5mLを7本の調製済みチューブにピペットで移します。残りのチューブに1.5mLのBBM+をネガティブコントロールとして充填します。
  4. 24本のチューブすべてをサーモミキサーで75°C、400RPMでインキュベートします。ガス透過性メンブレンでシールします。一定の間隔(0、4、8、12、24、36、48時間など)で、3回の繰り返しのそれぞれから1本のチューブを取り外し、分光光度計を使用して外径600nm を測定し、チューブを廃棄します。チューブを取り外した後、ガス透過性メンブレンを交換してください。
  5. 並行して、OD600nm と人口密度の関係を決定します。BBM+培地で少なくとも3つの時点(理想的には開始、中間、終了)で段階希釈(1 x 10-1から1 x 10-6)を実行します。各希釈液100 μLを固体BBM+培地に接種します(ステップ1.4で調製)。
    注:一貫したコロニー増殖と正確なカウントを達成するには、L字型スプレッダーやガラスビーズなどの機械的な拡散を行わずに、希釈した培養物をスポット内の固体培地にピペットで移すのが最善です。機械的な拡散は、コロニー形成に悪影響を与えるようです。
  6. プレートを75°Cの静的インキュベーターでコロニーが現れるまでインキュベートします(5〜7日)。
    1. この期間中は、プレートが過度に乾燥しないようにインキュベーターを湿度の高い状態に保ちます。そうしないと、コロニーが形成されません。
    2. これを実現するには、湿らせた布で裏打ちされた閉じたポリプロピレン製のボックスにプレートを置きます。ボックスの蓋に少なくとも3回穴を開けて、通気を有効にします。
    3. インキュベーターにバケツの水を入れて湿度を上げます。バケツは毎日補充してください。
  7. すべてのOD600nm 測定値が収集されたら、OD600nm と時間の関係にロジスティック曲線を当てはめることにより、倍増時間と指数関数的成長フェーズに到達するまでの時間を決定します(たとえば、RのgrowthcurverパッケージからSummarizeGrowthを使用します)。
  8. 固体培地上に目に見えるコロニーが形成されたら、希釈係数からカウントすることを目的としたコロニー形成単位(CFU)をカウントし、最高の精度を得るために50〜100コロニーを生成します。
  9. 次の式を使用して、培地中の細胞密度を計算します:CFU/mL = コロニー数/(容量メッキ × 希釈係数)。
  10. log-log 線形回帰を実行して、log10(CFU) と log10(OD600nm) の関係を決定します。したがって、回帰モデルの傾きと切片から、特定の OD の予測 CFU/mL を計算します: 予測 CFU = 10[slope × log10(OD600nm) + 切片]。
  11. (オプション)また、振とうインキュベーターでステップ3.1〜3.10を実行して、サーモミキサーで同等の成長が達成されているかどうかを判断します。

4. 実験的進化のための独立した系統の開始

  1. 1日目:単一のコロニーを生成するには、まず上記のセクション2のすべてのステップを実行して、開始培養を生成します。
  2. 3日目:培養物のOD600nm を測定して、指数関数的な段階で十分な密度に達したことを確認します(分光光度計でOD600nm 0.3-0.8)。
  3. 1 x 10-1-1 x 10-6 で S. acidocaldarius DSM639 培養液の段階希釈を行い、1 x 10-5 および 1 x 10-6 の各希釈液から 100 μL を、固体 BBM+ 培地 (セクション 1 および表 1) を含む 6 ウェルプレートのウェルに数回の繰り返しで広げます。ステップ3.5と同様に、静的インキュベーターでプレートを75°Cで5〜7日間インキュベートし、単一コロニーが出現します。
  4. 8-10日目(インキュベーション後5-7日):
    1. 単一のコロニーから進化する系統の数を確立します。系統ごとに、接種ループを使用してプレートからランダムに1つのコロニーを選択します。1.5 mLの予熱BBM+ 培地を含むピアス付き2 mLチューブにコロニーを再懸濁します。チューブに適切なラベルを付けます。
    2. 必要な系統数だけ繰り返します。ここでは、7つの系統が確立され、SA1-7とラベル付けされました。ネガティブコントロールとして、追加のチューブに1.5mLのBBM+を充填します。
    3. チューブの上部を通気性のあるメンブレンで密封し、培養物が濁るまで、75°C、400rpmで48〜72時間サーモミキサーでインキュベートします(分光光度計でOD600nm 0.3〜0.8に相当)。
  5. 10-12日目(接種後7-9日):
    1. ベンチトップ遠心分離機で、クローン培養物を5,000 x g でRTで1分間遠心し、上清を捨て、ペレットを200 μLの液体BBM+で再懸濁します。
    2. 200 μLの細胞懸濁液を200 μLの50%グリセロール(25% v/v グリセロール)と混合して、7つの独立した系統のグリセロールストックを作成し、-80°Cで保存します。 これらは、進化実験のための祖先の集団です。

5. 温度発生実験の実施

注:実験プロトコルの主な側面を概説する概念図を 図1に示します。

  1. セクション4で生成された7つの祖先集団を進化実験に使用します。
    1. すべての実験的進化アッセイは、透過性メンブレンで密封された滅菌済みのピアシングされた2 mLチューブで実施します(上記のセクション2)。
    2. これらの集団と並んで、1.5 mLのBBM+ をネガティブコントロールとして別々のピアス2 mLチューブを維持し、培養物から解放して(交差)汚染を監視し、培養物の成長がないことを示すODの閾値を設定します。.
  2. 温度処理の確立:サーモミキサーを使用すると、複数の温度処理を確立できます。ここでは、一定の75°C、一定の65°C、および4日ごとに1°Cずつ温度を下げて75〜65°Cから徐々に下降する温度処理を使用します(「温度低下処理」)。
    注:これらの治療法は、特定の実験要件に合わせて調整できます。温度処理ごとに個別のサーモミキサーが必要です。
  3. 1日目:セクション2で概説した手順に従って、祖先の集団をグリセロールストック(ステップ4.5で調製)から復活させます。
  4. 3日目:
    1. これらの培養物を外径600nm の0.01(分光光度計で測定)に希釈し、予熱したBBM+の総容量が少なくとも6mLになるようにします。7つの希釈祖先集団培養物のそれぞれから1.5 mLを、ステップ5.2で確立した温度処理ごとに1つずつ、3つの別々のピアス2mLチューブに分注します。
      注:この分注ステップにより、進化実験の開始時に、各祖先の集団に存在する遺伝的変異がすべての温度処理に存在することが保証されます。これらの培養物は、温度変化実験を開始するためのトランスファー0(Tx0)として機能します。
    2. チューブを通気性のあるメンブレンで密封し、7つの祖先の集団の各セットを別々のサーモミキサーに配置します。各サーモミキサーを必要な温度と400rpmに設定して、進化実験を開始します。
  5. 5日目:
    1. 48時間後、穿孔した2 mLチューブに加温したBBM+ 培地1.5 mLを、各Tx0培養物からの15 μLの培養液(1:100希釈)で接種することにより、トランスファー1(Tx1)を実行します。速度を上げるには、このステップを可変幅マルチチャンネルピペットで実行し、1つの実験から複数の移管を一斉に完了し、培養物がサーモミキサーから出る時間を短縮します。
    2. 以前と同様に、チューブを密閉してから、チューブをランダムな位置に戻して、それぞれのサーモミキサーに戻します。ランダム化は、手動またはiMetaLab 96ウェルランダマイザーを使用して実行します。
  6. プレートベースの分光光度計(96ウェルプレートで200μL、同量のBBM+をブランクとして使用)でTx0のOD600nmを測定し、独立した系統の成長を追跡します。
    注:OD600nm は、汚染を防ぐために、新しい媒体への転写を行った後に測定する必要があります。光学密度は、標準的な分光光度計などの他の手段で測定することもできます。プレートベースの分光光度計を使用することで、複数の培養物を同時に測定することができ、プロセスを合理化します。
  7. Tx2、Tx3、Tx4などに対応する7、9、11などの日に手順5.5と5.6を繰り返します。75°Cおよび65°Cの処理では、温度を一定に保ちます。温度降下処理は、2回目の転送ごとに温度を1°C下げます(つまり、Tx2、Tx4、Tx6など)。
  8. 10回目の 移入(すなわち、Tx10、Tx20など)ごとに集団のグリセロールストックを調製し(ステップ3.2.3)、チューブに祖先の集団識別子(例えば、1番目の 独立した集団のSA1)と移管番号(例えば、10回目の 移入のTx10)を標識します。これらのグリセロールストックは、後で集団を復活させ、集団が時間とともにどのように変化したかを研究したり、必要に応じて実験を再開したりするために使用します(例:汚染や培養物の損失につながる予期しない事故による)。
  9. 実験を所定の転送回数の間、または所定の世代数が経過するまで進行させます。最終的な移植時に、すべての子孫系統のグリセロールストックを調製します。
    注:ここでは、Tx22で発生した温度降下処理が65°Cに達するまで実験が進行しました。これは約 150 世代に相当します (4.6 の希釈係数 100 に基づいて計算: log2(100) = 6.64 世代/転送)。進化実験の長さは、実験の要件に応じて調整できます。

6. 進化後実験の成長アッセイ:祖先系統と進化系統

注:成長/適応度アッセイプロトコルを概説する概念図を 図2に示します。

  1. ピアスを開けた2 mLチューブを1.5 mL BBM+で調製します。すべての子孫の血統と各祖先の系統を成長させるのに十分なチューブを準備します。
  2. 進化実験の最終転送後、ステップ5.9で保存した祖先集団と各子孫集団を、ステップ2.2-2.5で概説した方法を用いて蘇生させますが、進化実験の最後の2回の転送で各集団が経験した温度、すなわち、75°Cの定数処理では75°C、65°Cの定数および温度低下実験では65°Cでのインキュベーションを行います。同等の個体群密度を達成するには、75 °C のインキュベーションを 72 時間、65 °C のインキュベーションを 120 時間実施します。
  3. プレートベースの分光光度計を介して、成長した培養物のOD600nm を測定します。
  4. 各子孫集団および各祖先系統の増殖アッセイを、両方の温度(すなわち、75 °Cおよび65 °C)で3回の繰り返しで実施します。穿孔した2 mL遠心チューブに1.5 mLのBBM+を調製します。進化した系統と祖先の系統ごとに6本のチューブを用意します。系統名(SA1-7または祖先)、増殖温度(75°Cまたは65°C)、および複製ID(1、2、または3)をチューブにラベル付けします。
    注:利用可能なサーモミキサーが6台未満の場合、成長アッセイは複数の実験ブロックにわたって数日間にわたって複製できます。この場合、各実験ブロックの各系統と祖先を測定して、ブロックの影響を統計的に推定および説明できるようにすることが重要です。
  5. 調製した6本のチューブに新鮮な培地に、各子孫系統および祖先系統からの15μLの培養液を接種します。
  6. 3つのサーモミキサーを75°Cに、3つのサーモミキサーを65°Cに設定し、各サーモミキサーにレプリケートIDを指定します。温度とレプリケートIDに対応するサーモミキサーにチューブを配置します。各サーモミキサー内で、系統と祖先がランダムに配置され、不均一性を制御することを確認します。
  7. 24本のチューブの各セットを透過性メンブレンで密封します。48時間インキュベートします。
  8. 各培養物から200μLを96ウェルプレートに移します。分光光度計を使用してOD600nm を測定します。
    注:可変幅マルチチャンネルピペットを使用して、微量遠心チューブと96ウェルプレート間の移乗を容易にすることができます。
  9. 統計ソフトウェア(Rなど)を使用してデータをプロットおよび分析します。

7. 進化した系統の全ゲノム解読と突然変異の同定

  1. ステップ5.9で保存された子孫系統を、セクション2、ステップ2.2-2.5のように、各凍結集団からの氷のスクレープをBBM+に接種することにより、48-72時間の75°Cで予熱したBBM+で復活させます。十分な量のゲノムDNAを得るために、1〜10 mLの培養量を調製します。必要な正確な量は、ステップ7.2または7.3(下記)でシーケンシング用に選択したオプションによって異なります。
    注:祖先の集団を開始するために使用される系統も配列決定することは良い習慣です。これは、子孫系統で検出された突然変異が進化実験中に発生したのであり、それ以前に生じたものではないかどうかを正しく判断するためです。
  2. (オプション1)ゲノムDNAを抽出し、Illuminaシーケンシング用のIlluminaシーケンシングライブラリを調製します。
    1. 市販の細菌用ゲノムDNA抽出キットを使用して、ゲノムDNAを抽出および精製します。
    2. 抽出されたゲノムDNAがシーケンシングプロバイダーの量と品質の要件を満たしていることを確認するには、プロバイダーが推奨する市販のキットを使用します。
    3. ゲノムDNAライブラリーの調製は、市販のキットを用いて、製造元のプロトコールに従って行ってください。250 bp のペアエンド プロトコルが推奨されます。抽出したゲノムDNAは、シーケンシングプロバイダーにサンプルを提出する準備ができるまで-20°Cで保存します。
  3. (オプション2)あるいは、DNA抽出、ゲノムDNA品質チェック、Illuminaライブラリ調製、Illuminaシーケンシングを複合サービスとして実施する商用プロバイダーにサンプルを送付することもできます。
  4. 配列決定されたゲノムを解析して、突然変異を特定します。
    1. FASTQ ファイルを受け取り、シーケンシング プロバイダーによってまだ実行されていない場合は、Trimmomatic を使用して、スライディング ウィンドウ品質カットオフを Q15 に設定してアダプター トリミングを実行します。
    2. トリミングされたFASTQファイルを使用して、breseqパイプライン(バージョン0.38.1)を実行して突然変異を検出し、ゲノムDNAリードを選択した株の参照配列と比較します。 S. acidocaldarius DSM639の場合、これはRefSeq ID NC_007181です。

8. (オプション)サーモミキサーとインキュベーターのエネルギー消費量の評価

  1. インキュベーターとサーモミキサーを使用した場合のエネルギー消費量を比較するには、エネルギー監視プラグを使用して各デバイスの24時間にわたるエネルギー消費量を測定します。
  2. 2つのプラグを使用して、両方のデバイスのエネルギー消費量を同時に測定します。または、連続する日のエネルギー消費量を測定します。
  3. インキュベーターまたはサーモミキサーをコンセントから外します。エネルギー監視プラグをソケットに差し込み、監視および制御ソフトウェアのインストールなど、製造元の指示に従って初期化します。
  4. インキュベーターまたはサーモミキサーをエネルギー監視プラグに差し込み、最低2時間(ただし理想的には24時間以上)稼働させて、一般的なエネルギー消費量を適切に推定します。各デバイスのエネルギー消費量を記録します。

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結果

成長曲線の測定
S. acidocaldarius DSM639の成長曲線を図3Aに示します。サーモミキサーを使用したインキュベーションと従来のインキュベーターを使用したインキュベーションを比較すると、成長は同様であることがわかりました。平均成長率パラメータは、反復された各成長曲線にロジスティック曲線を当てはめ、平均誤差と標準誤差を計算することによって推定されました。サーモミキサーとインキュベーターの指数関数的フェーズの中期までの時間は、それぞれ27.2時間±1.1時間、31.1時間±1.9時間でした。75°Cでのサーモミキサーとインキュベーターの推定初期倍加時間は、それぞれ4.29時間±0.28時間、4.19時間±0.44時間であり、これは以前に発表された値と一致している24。log10(OD600nm)とlog10(CFU)の関係は、線形モデル(調整済みR2 = 0.82、F...

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ディスカッション

この研究は、好熱菌のための実験的進化プロトコルを開発しましたが、ここでは古細菌S.acidocaldarius用に調整されていますが、高温成長を必要とする他の微生物にも適応できます。このプロトコルは、当初は中温性細菌用に設計された技術に基づいていますが、高温好気性成長2,4,5,24に関連する技術的課題を克服するために特別に変更されています。この手法の創出により、生命の進化1の最も初期の段階で存在した可能性のある条件に似た、極端な温度条件下で発生する、これまで特徴付けられていなかった進化のダイナミクスの探索が可能になります。

このプロトコルには、進化実験から信頼性の高い結果を得るために観察しなけれ...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言するものではありません。

謝辞

著者らは、S. acidocaldarius DSM639株について、S . acidocaldarius DSM639株について、S. Albers教授(フライブルク大学)、Eveline Peeters教授(ブリュッセル自由大学)、Rani Baes博士(ブリュッセル自由大学)に感謝します。この研究は、Royal Society Research Grant(DRG:RGS\R1\231308)、UKRI-NERC "Exploring the Frontiers" Research Grant(DRGおよびCGK:NE/X012662/1に授与)、およびクウェート大学の博士課程奨学金(ZAに授与)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上 μ;m シリンジ駆動メンブレンフィルターStarLabE4780-1226オートクレーブできない培地成分のフィルター滅菌用です。
1 μL接種ループグライナー731161、731165、または731101培養物への接種用。他のループも使用できます。
1000 μLピペットチップStarLabS1111-6811他のピペットチップも使用できます。
2 mL微量遠心チューブStarLabS1620-2700サーモミキサーでS. acidocaldariusを培養します。
200 μLピペットチップStarLabS1111-0816他のピペットチップも使用できます。
円錐形の底部を持つ50mLポリスチレンチューブコーニング430828または430829その他のチューブを使用することができます。75°Cで性能を確認してくださいプラグシールキャップ付きのチューブでは、十分な曝気ができない場合があります。使用前に確認してください。 
50 mLシリンジBD plastipak300865シリンジ駆動フィルターで使用します。
96ウェルマイクロタイタープレート(未処理、平底)Nunc260860分光光度計で600nmのODを測定するため。
幅調整可能なマルチチャンネルピペットPipet-LiteLA8-300XLSオプションですが、マイクロ遠心分離機と96ウェルプレート間の移載にかかる時間を節約できます。
硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)Millipore168355ブロックストック溶液I.
オートクレーブPriorclaveB60-SMARTまたはSV100-BASE他のオートクレーブも使用できます。
Breathe-EASY気体透過性シーリングメンブレンSigma-AldrichZ763624-100EAピアスマイクロ遠心チューブに使用するサイズにカットします。他のガス透過性メムルバンを代用する場合は、75°Cで性能が適切であることを確認してください。C
塩化カルシウム二水和物 (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306ブロックストックソリューション用 I.
CELLSTAR 6ウェルプレート(懸濁液/未処理)GreinerM9062他メーカーの6ウェルプレートで代用できる可能性が高いです。高温での性能を確認してください。
硫酸コバルト(II)七水和物(CoSO4·7H2O)Supelco1025560100微量元素ストック溶液用。
塩化銅(II)二水和物(CuCl2·2H2O)Sigma-Aldrich307483微量元素ストック溶液用。
D-(+)-グルコース無水物 (C6H12O6)Thermo Scientific Chemicals11462858他のペントース糖およびヘキソース糖も使用できます(例:D-キシロース、D-アラビノース)。グルコースは、S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
二蒸留水 (ddH2O)
GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite (gellan gum) は、融点が高いため、寒天の代わりに固体媒体を作るために使用されます。
ガラス100mmペトリ皿ブランドBR455742ガラスペトリ皿は、ほとんどの標準的なポリスチレン90mmペトリ皿が75°Cで変形するため、使用されます。C(ブランドに依存)。あるいは、高温で変形しないため、6枚のウェルプレートを使用することもできます。
インキュベーターNew BrunswickInnnova 42R他のインキュベーターも使用できます。多くのインキュベーターは65°Cを超える温度に耐えられないため、購入/使用する前に機器の動作温度を確認してください。
塩化鉄(III)六水和物(FeCl3·Feストック溶液用6H2O)Supelco103943
マグネシウム七水和物(エプソム塩)(MgSO4·7H2O)Sigma-Aldrich230391ブロックストックソリューション用 I.
塩化マンガン(II)四水和物(MnCl2·4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100G微量元素ストック溶液用。
ミニスマートWi-Fiソケット、エネルギー監視TapoTapo P110エネルギー消費を監視するには 
N-Z-アミンA - カゼイン酵素加水分解物 Sigma-AldrichC0626-500GN-Z-Amine-Aは、アミノ酸の供給源として使用されます。
ペーパークリップ(またはその他の頑丈なワイヤー)なしなし2mLの微量遠心チューブのピアス用。
リン酸二水素カリウム(リン酸一カリウム)(KH2PO4)Sigma-AldrichP0662ストック溶液I用。
PromegaウィザードゲノムDNA精製キットPromegaA1120オプションで、実験室でゲノムDNAを抽出する
モリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4·2H2O)Sigma-AldrichM1651-100G微量元素ストックソリューション用。
四ホウ酸ナトリウム十水和物(ホウ砂)(Na2B4O7·10H2O)Sigma-AldrichS9640微量元素ストック溶液用。
分光光度計BMGSPECTROstar OMEGA600nmでの外径測定用。600nmでODを読み取ることができる他の分光光度計も使用できます。
硫酸(水と1:1の比率で希釈)(H2SO4)Thermo Scientific Chemicals11337588ブロックストック溶液II/IIIのpHを最終pH2–3に調整するために使用されます。
サーモミキサーDLabHM100-Pro他のサーモミキサーも使用できます。主な考慮事項は、65&ndash を維持する能力です。75度;C温度と400RPM
ウラシル(C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750pyrEの欠失は、S.acidocaldariusで使用される一般的な遺伝マーカーです。欠失株は、成長のためにウラシルで補う必要があります。.DSM639野生型株については厳密には補充は必須ではありませんが、将来の実験で欠失株が含まれる可能性があるため、ここに含めています。
バナジル硫酸二水和物(VOSO4·2H2O)Sigma-Aldrich204862微量元素ストック溶液用。
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4·7H2O)Sigma-Aldrich221376微量元素ストック溶液用。
硫酸ブロック

参考文献

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