生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

地球上の初期の生命は、非常に高い温度と酸性度を特徴とする熱水噴出孔などの極限環境で生まれた可能性があります¹。微生物は、温泉や火山性ソルファタラなどの極限環境に生息し続けています。これらの極限条件下で発生する進化のダイナミクスを特徴づけることは、これらの条件下での生存を可能にする特殊な生理学的プロセスに光を当てるかもしれません。これは、生物多様性の起源の理解から、バイオテクノロジーへの応用による新しい高温酵素の開発まで、幅広い意味を持つ可能性があります。

極限環境における微生物の進化動態の理解は、その決定的な重要性にもかかわらず、まだ限られています。対照的に、中温性環境における進化に関する重要な知識は、実験的進化として知られる技術の適用を通じて獲得されました。実験的進化は、実験室条件下で進化的変化を観察することを含む2,3,4,5。多くの場合、これには定義された変化環境(例えば、温度、塩分、毒素または競合生物の導入)^{が含まれます7,8,9}。全ゲノムシーケンシングと組み合わせることで、実験的進化により、並列性、再現性、適応のためのゲノム基盤など、進化プロセスの主要な側面をテストすることができました。しかし、今日まで、実験的進化の大部分は中温微生物(細菌、真菌、ウイルス^2,3,4,5を含むが、古細菌は大部分を除く)で行われてきました。好熱性微生物に適用可能な実験的進化の方法により、微生物がどのように進化するかをよりよく理解し、進化のより包括的な理解に貢献することができます。これは、地球上の好熱性生命の起源の解読から、高温バイオプロセス¹⁰や宇宙生物学研究¹¹で使用される「極限性」を含むバイオテクノロジーへの応用まで、潜在的に幅広い意味合いを持っています。

古細菌Sulfolobus acidocaldariusは、好熱菌の実験的進化技術を開発するためのモデル生物として理想的な候補です。S. acidocaldariusは好気的に繁殖し、最適な生育温度は75°C(55°Cから85°Cの範囲)で、酸性度は高い(pH 2-3)^4,6,12,13,14です。驚くべきことに、その極端な成長条件にもかかわらず、S. acidocaldariusは中葉7,15,16,17,18に匹敵する個体密度と突然変異率を維持しています。さらに、比較的小さく、十分に注釈されたゲノム(DSM639株:2.2 Mb、36.7%GC、2,347遺伝子)¹²;S. acidocaldariusはまた、堅牢なゲノムエンジニアリングツールの恩恵を受けており、標的遺伝子ノックアウトを通じて進化過程を直接評価することができる¹⁹。この顕著な例は、MW001¹⁹ および SK-1²⁰ のウラシル補助栄養株など、S. acidocaldarius の遺伝子組み換え株の利用可能性であり、これらは選択可能なマーカーとして機能することができます。

S. acidocaldariusのような好熱菌を用いた実験的進化には大きな課題があります。これらの研究に必要な高温での長時間のインキュベーションは、液体と固体の両方の培養技術にかなりの蒸発を課します。高温での長時間の運転は、液体媒体の実験的進化で一般的に使用される従来の振とうインキュベーターを損傷する可能性もあります。複数の温度を探索するには、複数のインキュベーターを取得して維持するための多額の財政投資が必要です。さらに、必要なエネルギー消費量が多いため、環境面および財政面で大きな懸念が生じています。

この研究では、S. acidocaldariusのような好熱菌で実験的進化を行う際に遭遇する課題に対処する方法を紹介します。Baesらが熱ショック応答を調査するために開発した技術^14,21に基づいて、ここで開発された方法は、ベンチトップサーモミキサーを利用して、一貫した信頼性の高い高温インキュベーションを実現します。その拡張性により、複数の温度処理を同時に評価することができ、追加のインキュベーション装置を購入するコストを削減できます。これにより、実験効率が向上し、好熱菌の進化ダイナミクスに影響を与える要因の堅牢な統計分析と広範な調査が可能になります²²。さらに、このアプローチは、従来のインキュベーターと比較して、財務的な初期投資とエネルギー消費を大幅に削減し、より持続可能で環境に優しい代替手段を提供します。

私たちの方法は、地球上の生命の多様化の初期段階で重要な役割を果たした可能性のある極端な温度を特徴とする環境における進化のダイナミクスを実験的に調査するための基礎を築きます。好熱性生物は独自の特性を持っていますが、その極端な成長条件と特殊な要件により、モデルシステムとしてのアクセシビリティが制限されることがよくあります。これらの障壁を克服することは、進化のダイナミクスを調査するための研究機会を拡大するだけでなく、科学研究のモデルシステムとしての好熱菌の幅広い有用性を高めることにもなります。

1. S. acidocaldarius 増殖培地(BBM⁺)の調製

注:S.acidocaldariusを培養するために、このプロトコルはBasal Brock Medium(BBM ⁺)²³を使用します。これは、まず以下に概説する無機ストック溶液を組み合わせてBBM⁻を作成することによって調製されます。これは、事前に調製することができます。次に、必要に応じて有機ストック溶液をBBM⁻に添加することにより、BBM⁺を調製します。ストック溶液のレシピも表1に示します。すべての培地およびストック溶液は、再蒸留H₂O(ddH₂O)で調製する必要があります。

1. 成長培地用の無機ストック溶液の調製
   1. 微量元素ストック溶液を調製します。
      1. 9 g/Lの四ホウ酸ナトリウム十水和物(Na₂B₄O₇・10H₂O)をddH₂Oに加え、続いて1:1 H₂SO₄ を溶解するまで滴下して、微量元素ストック溶液を調製します。
      2. 0.44 g/Lの硫酸亜鉛七水和物(ZnSO₄・7H₂O)、0.1 g/Lの塩化銅(II)二水和物(CuCl₂・2H₂O)、0.06 g/Lのモリブデン酸ナトリウム二水和物(Na₂MoO₄・2H₂O)、0.06 g/Lのバナジウム(IV)硫酸二水和物(VOSO 4.2H₂O)、0.02 g/Lのコバルト(II)硫酸塩七水和物(CoSO₄・7H₂O)を順次導入します。 3.6 g / Lの塩化マンガン(II)四水和物(MnCl₂・4H₂O)。溶液をオートクレーブで処理し、4°Cで保存します。
   2. 20 g/L の塩化第二鉄六水和物 (FeCl₃・6H₂O) を ddH₂O に溶解して Fe ストック溶液 (1000x) を調製し、0.22 μm フィルターでろ過して溶液を滅菌し、4 °C で保存します。
   3. 70 g/L 塩化カルシウム (CaCl₂・2H₂O) を二重蒸留水 (ddH₂O) に溶解して、ブロック溶液 I (1000x) を調製します。オートクレーブ処理し、4°Cで保存します。
      注意:CaCl₂・2H₂Oを水に溶解することは発熱プロセスです。この手順は注意して実行してください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。圧力がかかる可能性があるため、容器をしっかりと閉じないでください。
   4. 130 g/Lの硫酸アンモニウム((NH₄)₂SO₄)、25 g/Lの硫酸マグネシウム七水和物(MgSO₄・7H₂O)、28 g/Lのリン酸二水素カリウム(KH₂PO₄)、および50 mLの先に調製した微量元素ストック溶液を組み合わせて、ブロック溶液II/IIIを調製します。1:1 H₂SO₄を使用して、原液のpHを2〜3に調整します。溶液をオートクレーブし、室温(RT)で保存します。
2. 成長培地用の有機ストック溶液の調製
   1. D-グルコースストック溶液(100x)を調製し、300 g/L(30% w/v)のD-グルコースをddH₂Oに溶解し、0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。4°Cで保存してください。
      注:実験要件に応じて、D-グルコースの代わりに他の炭素源(D-キシロースなど)を使用することができます。
   2. カゼイン原液(100x)からペプトンを調製し、カゼインからペプトンを100 g/LでddH₂O.オートクレーブに溶解し、原液をRTで滅菌および保存します。
   3. 2 g/L のウラシルを ddH₂O に溶解してウラシル原液 (100x) を調製し、滅菌をろ過します (0.22 μm フィルターを使用)。-20°Cで保存してください。
3. 1倍の作業濃度でのBBM⁺ 増殖培地の調製
   1. まず、オートクレーブにより988mLの滅菌_ddH2Oを調製します。
   2. 1 mLのBrock Stock Solution I、10 mLのBrock Stock Solution II/III、および1 mLのFeストック溶液を、以前にオートクレーブした988 mLの滅菌ddH₂Oに添加して、1 L BBM⁻を調製します。中程度のpHを2〜3の範囲に調整し、1:1 H₂SO₄を使用します。
      注:BBM⁻ は事前に作成し、RTで最大1ヶ月間保管することができます。
   3. 最後に、1 L BBM⁺を調製するには、D-グルコース原液、カゼイン原液のペプトン、およびウラシル原液をそれぞれ10 mLずつ組み合わせ、985 mLのBBM⁻を組み合わせます。よく混ぜて、1:1 H₂SO₄で培地のpHを2-3に調整します。
      注意: BBM ⁺ は必要に応じて新しく作る必要があります。
4. BBM⁺ 固体培地の調製
   1. MgCl₂ およびCaCl₂の1 Mストック溶液を調製します。これらは、BBM固体媒体の固化に役立ちます。1 M MgCl₂の場合、100 mLのddH₂Oに9.5 gを加えます。1 M CaCl₂の場合、100 mLのddH₂O.オートクレーブに11 gを加えて滅菌します。
      注意:CaCl₂・2H₂Oを水に溶解することは発熱プロセスです。この手順は注意して実行してください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。圧力がかかる可能性があるため、容器をしっかりと閉じないでください。
   2. 3%(w / v)ジェランガム(例:30 g / L)をddH₂Oおよびオートクレーブに混合して滅菌します。
      注:ここでは、標準的な細菌寒天は75°Cで固化できないため、ジェランガム(ジェライトなど)をゲル化剤として使用します。
   3. これとは別に、ステップ1.4.1で調製した滅菌ジェランガムと1:1の比率で混合する固形培地用のBBM⁺ を調製します。
      1. まず、ステップ1.3.2のように1L BBM⁻ を準備します。887 mLのBBM⁻ を1 mLのFeストック溶液と、D-グルコースストック溶液、カゼインストック溶液のペプトン、およびウラシルストック溶液の各20 mLと組み合わせます。.
      2. 40 mLの1 M MgCl₂ と12 mLの1 M CaCl₂を添加します。よく混ぜて、1:1 H₂SO₄で培地のpHを2-3に調整します。
         注:ここで添加するストック溶液の量は、ステップ1.3の液体BBM⁺ の調製よりも意図的に多くなっています。これは、次のステップで溶融したジェランガムと1:1の比率で混合するためです。
   4. 固体媒体のBBM⁺ を約75°Cに予熱し、ddH₂Oで溶融したジェランガムと1:1の比率で混合します。よく混合し、熱安定性プラスチック(ポリプロピレンなど)、ガラスシャーレ、または6ウェルプレートに注ぎます。寒天は急速に固まるため、ブレンドしたらすぐに使用してください。
      注:微生物学に一般的に使用される一部のポリスチレン90mmシャーレは、高温で長期間インキュベートすると変形します。
      注意: 高温の液体を取り扱うときは、適切な安全対策を講じてください。怪我から保護するために、EN407定格のサーマルハザードグローブを着用してください。

2. 冷凍ストック培養物からの S.acidocaldarius の復活

1. 十分な曝気と酸素の利用可能性を確保するための換気成長チューブの準備。
   1. 事前に、 Sulfolobus 増殖用の穴あけ2 mL微量遠心チューブを準備します。.鈍いワイヤー(>0.7mm、まっすぐに伸ばしたペーパークリップなど)をブンゼンバーナーの炎で丁寧に加熱し、チューブの蓋に穴を開けると、約1mmの小さな穴が開けられます。
   2. 穴を開けたチューブをオートクレーブ可能な容器(空のピペットチップボックスなど)に入れ、オートクレーブで滅菌します。
      注意: EN407定格のサーマルハザードグローブを着用して、加熱された金属による手の熱傷から保護してください。過熱を防ぐために、ワイヤーを短時間(1〜2秒)だけ加熱します。融解温度の高い金属(鋼)のみを使用します。
2. S. acidocaldariusのスターター培養物を接種します。
   1. オートクレーブ処理したピアス2 mLチューブに、予熱したBBM⁺1.5 mL(セクション1で調製し、75°Cで少なくとも15分間プレインキュベート)を入れます。
   2. グリセロールストック(25%v / vグリセロール、-80°Cで保存)からBBM ⁺充填チューブをスクレイピング(50〜60 mgに相当)して接種します。ここでは、 S. acidocaldarius 株DSM639を用いている。ネガティブコントロールとして、追加のチューブに1.5mLのBBM+を充填します。
3. ピアスされた2 mLチューブの蓋からエアロゾルが漏れて成長環境(およびその他のサンプル)を汚染するのを防ぎ、チューブ内の培養蒸発のばらつきを減らすために、高温(65-85°C)に耐え、微生物の逃げ/浸透をブロックできるガス透過性メンブレンを蓋の上に置きます。
   注:チューブをシールするためにガス透過性メンブレンを使用すると、蒸発が大幅に減少します。75°Cでの48時間期間中、密封されたチューブの平均体積損失は8.63%(範囲:3.29-16.45%、 n = 24回のテクニカルレプリケート、2回繰り返される)であるのに対し、非密封チューブでは25.05%(範囲:11.92-62.91%、 n = 24テクニカルレプリケート、2回繰り返される)を示します。
4. 接種したチューブをサーモミキサーで75°Cでインキュベートし、毎分400回転(RPM)で48〜72時間、または外径_600nm が0.3〜0.8に達するまで分光光度計で測定します。
   注:2mLチューブの穴あけ蓋と振とうにより、最適な成長のための適切な曝気が可能になります。サーモミキサーの蓋は、一定の温度が維持され、蒸発を減らすために所定の位置にある必要があります。
5. インキュベーション期間の後、復活した培養物に2回目の成長段階(プレコンディショニング)を与えます。
   1. チューブを5000 x g でRTで2分間回転させることにより、培養物をペレット化します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを新鮮な1.5 mLの温かいBBM⁺に再懸濁します。
      注:この実験では、 S.アシドカルダリウス 野生型DSM639株を使用していますが、これらの成長方法と実験的進化は、任意の スルフォロバス 株および潜在的に他の好熱性植物に適用することができます。

3. S. acidocaldariusの人口密度、倍加時間、指数関数的成長期の決定

1. 選択した選択条件の人口密度と指数関数的成長フェーズまでの時間を決定します。テストする環境条件ごとに、手順2.1〜2.5に従って3つのスターター培養を準備します。
2. BBM⁺ の3つの培養物をOD_600nm の0.01に希釈します。各培養物から少なくとも20mLを作ります。これら 3 つのカルチャは、技術的なレプリケートを表します。
3. 破壊的なサンプリングを使用して、OD_600nm の成長曲線を経時的に再現します。
   1. ステップ 2.1 で穿孔した 2 mL チューブを 24 本調製し、8 本ずつの 3 セットに分けて、これらのテクニカルレプリケート 1、2、3 を標識します(例:8 本のチューブを replicate 1 などとラベル付けします)。
   2. ステップ3.2で希釈した3つの培養物のそれぞれから、1.5mLを7本の調製済みチューブにピペットで移します。残りのチューブに1.5mLのBBM+をネガティブコントロールとして充填します。
4. 24本のチューブすべてをサーモミキサーで75°C、400RPMでインキュベートします。ガス透過性メンブレンでシールします。一定の間隔(0、4、8、12、24、36、48時間など)で、3回の繰り返しのそれぞれから1本のチューブを取り外し、分光光度計を使用して外径_600nm を測定し、チューブを廃棄します。チューブを取り外した後、ガス透過性メンブレンを交換してください。
5. 並行して、OD_600nm と人口密度の関係を決定します。BBM⁺培地で少なくとも3つの時点(理想的には開始、中間、終了)で段階希釈(1 x ^10-1から1 x ^10-6)を実行します。各希釈液100 μLを固体BBM⁺培地に接種します(ステップ1.4で調製)。
   注:一貫したコロニー増殖と正確なカウントを達成するには、L字型スプレッダーやガラスビーズなどの機械的な拡散を行わずに、希釈した培養物をスポット内の固体培地にピペットで移すのが最善です。機械的な拡散は、コロニー形成に悪影響を与えるようです。
6. プレートを75°Cの静的インキュベーターでコロニーが現れるまでインキュベートします(5〜7日)。
   1. この期間中は、プレートが過度に乾燥しないようにインキュベーターを湿度の高い状態に保ちます。そうしないと、コロニーが形成されません。
   2. これを実現するには、湿らせた布で裏打ちされた閉じたポリプロピレン製のボックスにプレートを置きます。ボックスの蓋に少なくとも3回穴を開けて、通気を有効にします。
   3. インキュベーターにバケツの水を入れて湿度を上げます。バケツは毎日補充してください。
7. すべてのOD_600nm 測定値が収集されたら、OD_600nm と時間の関係にロジスティック曲線を当てはめることにより、倍増時間と指数関数的成長フェーズに到達するまでの時間を決定します(たとえば、RのgrowthcurverパッケージからSummarizeGrowthを使用します)。
8. 固体培地上に目に見えるコロニーが形成されたら、希釈係数からカウントすることを目的としたコロニー形成単位(CFU)をカウントし、最高の精度を得るために50〜100コロニーを生成します。
9. 次の式を使用して、培地中の細胞密度を計算します:CFU/mL = コロニー数/(容量メッキ × 希釈係数)。
10. log-log 線形回帰を実行して、log10(CFU) と log10(OD_600nm) の関係を決定します。したがって、回帰モデルの傾きと切片から、特定の OD の予測 CFU/mL を計算します: 予測 CFU = 10^{[slope × log10(OD600nm) + 切片]}。
11. (オプション)また、振とうインキュベーターでステップ3.1〜3.10を実行して、サーモミキサーで同等の成長が達成されているかどうかを判断します。

4. 実験的進化のための独立した系統の開始

1. 1日目:単一のコロニーを生成するには、まず上記のセクション2のすべてのステップを実行して、開始培養を生成します。
2. 3日目:培養物の_OD600nm を測定して、指数関数的な段階で十分な密度に達したことを確認します(分光光度計でOD_600nm 0.3-0.8)。
3. 1 x ^10-1-1 x ^10-6 で S. acidocaldarius DSM639 培養液の段階希釈を行い、1 x ^10-5 および 1 x ^10-6 の各希釈液から 100 μL を、固体 BBM⁺ 培地 (セクション 1 および表 1) を含む 6 ウェルプレートのウェルに数回の繰り返しで広げます。ステップ3.5と同様に、静的インキュベーターでプレートを75°Cで5〜7日間インキュベートし、単一コロニーが出現します。
4. 8-10日目(インキュベーション後5-7日):
   1. 単一のコロニーから進化する系統の数を確立します。系統ごとに、接種ループを使用してプレートからランダムに1つのコロニーを選択します。1.5 mLの予熱BBM⁺ 培地を含むピアス付き2 mLチューブにコロニーを再懸濁します。チューブに適切なラベルを付けます。
   2. 必要な系統数だけ繰り返します。ここでは、7つの系統が確立され、SA1-7とラベル付けされました。ネガティブコントロールとして、追加のチューブに1.5mLのBBM+を充填します。
   3. チューブの上部を通気性のあるメンブレンで密封し、培養物が濁るまで、75°C、400rpmで48〜72時間サーモミキサーでインキュベートします(分光光度計でOD_600nm 0.3〜0.8に相当)。
5. 10-12日目(接種後7-9日):
   1. ベンチトップ遠心分離機で、クローン培養物を5,000 x g でRTで1分間遠心し、上清を捨て、ペレットを200 μLの液体BBM⁺で再懸濁します。
   2. 200 μLの細胞懸濁液を200 μLの50%グリセロール(25% v/v グリセロール)と混合して、7つの独立した系統のグリセロールストックを作成し、-80°Cで保存します。 これらは、進化実験のための祖先の集団です。

5. 温度発生実験の実施

注:実験プロトコルの主な側面を概説する概念図を 図1に示します。

1. セクション4で生成された7つの祖先集団を進化実験に使用します。
   1. すべての実験的進化アッセイは、透過性メンブレンで密封された滅菌済みのピアシングされた2 mLチューブで実施します(上記のセクション2)。
   2. これらの集団と並んで、1.5 mLのBBM⁺ をネガティブコントロールとして別々のピアス2 mLチューブを維持し、培養物から解放して(交差)汚染を監視し、培養物の成長がないことを示すODの閾値を設定します。.
2. 温度処理の確立:サーモミキサーを使用すると、複数の温度処理を確立できます。ここでは、一定の75°C、一定の65°C、および4日ごとに1°Cずつ温度を下げて75〜65°Cから徐々に下降する温度処理を使用します(「温度低下処理」)。
   注:これらの治療法は、特定の実験要件に合わせて調整できます。温度処理ごとに個別のサーモミキサーが必要です。
3. 1日目:セクション2で概説した手順に従って、祖先の集団をグリセロールストック(ステップ4.5で調製)から復活させます。
4. 3日目:
   1. これらの培養物を外径_600nm の0.01(分光光度計で測定)に希釈し、予熱したBBM⁺の総容量が少なくとも6mLになるようにします。7つの希釈祖先集団培養物のそれぞれから1.5 mLを、ステップ5.2で確立した温度処理ごとに1つずつ、3つの別々のピアス2mLチューブに分注します。
      注:この分注ステップにより、進化実験の開始時に、各祖先の集団に存在する遺伝的変異がすべての温度処理に存在することが保証されます。これらの培養物は、温度変化実験を開始するためのトランスファー0(Tx0)として機能します。
   2. チューブを通気性のあるメンブレンで密封し、7つの祖先の集団の各セットを別々のサーモミキサーに配置します。各サーモミキサーを必要な温度と400rpmに設定して、進化実験を開始します。
5. 5日目:
   1. 48時間後、穿孔した2 mLチューブに加温したBBM⁺ 培地1.5 mLを、各Tx0培養物からの15 μLの培養液(1:100希釈)で接種することにより、トランスファー1(Tx1)を実行します。速度を上げるには、このステップを可変幅マルチチャンネルピペットで実行し、1つの実験から複数の移管を一斉に完了し、培養物がサーモミキサーから出る時間を短縮します。
   2. 以前と同様に、チューブを密閉してから、チューブをランダムな位置に戻して、それぞれのサーモミキサーに戻します。ランダム化は、手動またはiMetaLab 96ウェルランダマイザーを使用して実行します。
6. プレートベースの分光光度計(96ウェルプレートで200μL、同量のBBM⁺をブランクとして使用)でTx0の_OD600nmを測定し、独立した系統の成長を追跡します。
   注:OD_600nm は、汚染を防ぐために、新しい媒体への転写を行った後に測定する必要があります。光学密度は、標準的な分光光度計などの他の手段で測定することもできます。プレートベースの分光光度計を使用することで、複数の培養物を同時に測定することができ、プロセスを合理化します。
7. Tx2、Tx3、Tx4などに対応する7、9、11などの日に手順5.5と5.6を繰り返します。75°Cおよび65°Cの処理では、温度を一定に保ちます。温度降下処理は、2回目の転送ごとに温度を1°C下げます(つまり、Tx2、Tx4、Tx6など)。
8. 10^回目の 移入(すなわち、Tx10、Tx20など)ごとに集団のグリセロールストックを調製し(ステップ3.2.3)、チューブに祖先の集団識別子(例えば、1^番目の 独立した集団のSA1)と移管番号(例えば、10^回目の 移入のTx10)を標識します。これらのグリセロールストックは、後で集団を復活させ、集団が時間とともにどのように変化したかを研究したり、必要に応じて実験を再開したりするために使用します(例:汚染や培養物の損失につながる予期しない事故による)。
9. 実験を所定の転送回数の間、または所定の世代数が経過するまで進行させます。最終的な移植時に、すべての子孫系統のグリセロールストックを調製します。
   注:ここでは、Tx22で発生した温度降下処理が65°Cに達するまで実験が進行しました。これは約 150 世代に相当します (4.6 の希釈係数 100 に基づいて計算: log₂(100) = 6.64 世代/転送)。進化実験の長さは、実験の要件に応じて調整できます。

6. 進化後実験の成長アッセイ:祖先系統と進化系統

注:成長/適応度アッセイプロトコルを概説する概念図を 図2に示します。

1. ピアスを開けた2 mLチューブを1.5 mL BBM⁺で調製します。すべての子孫の血統と各祖先の系統を成長させるのに十分なチューブを準備します。
2. 進化実験の最終転送後、ステップ5.9で保存した祖先集団と各子孫集団を、ステップ2.2-2.5で概説した方法を用いて蘇生させますが、進化実験の最後の2回の転送で各集団が経験した温度、すなわち、75°Cの定数処理では75°C、65°Cの定数および温度低下実験では65°Cでのインキュベーションを行います。同等の個体群密度を達成するには、75 °C のインキュベーションを 72 時間、65 °C のインキュベーションを 120 時間実施します。
3. プレートベースの分光光度計を介して、成長した培養物の_OD600nm を測定します。
4. 各子孫集団および各祖先系統の増殖アッセイを、両方の温度(すなわち、75 °Cおよび65 °C)で3回の繰り返しで実施します。穿孔した2 mL遠心チューブに1.5 mLのBBM⁺を調製します。進化した系統と祖先の系統ごとに6本のチューブを用意します。系統名(SA1-7または祖先)、増殖温度(75°Cまたは65°C)、および複製ID(1、2、または3)をチューブにラベル付けします。
   注:利用可能なサーモミキサーが6台未満の場合、成長アッセイは複数の実験ブロックにわたって数日間にわたって複製できます。この場合、各実験ブロックの各系統と祖先を測定して、ブロックの影響を統計的に推定および説明できるようにすることが重要です。
5. 調製した6本のチューブに新鮮な培地に、各子孫系統および祖先系統からの15μLの培養液を接種します。
6. 3つのサーモミキサーを75°Cに、3つのサーモミキサーを65°Cに設定し、各サーモミキサーにレプリケートIDを指定します。温度とレプリケートIDに対応するサーモミキサーにチューブを配置します。各サーモミキサー内で、系統と祖先がランダムに配置され、不均一性を制御することを確認します。
7. 24本のチューブの各セットを透過性メンブレンで密封します。48時間インキュベートします。
8. 各培養物から200μLを96ウェルプレートに移します。分光光度計を使用して_OD600nm を測定します。
   注:可変幅マルチチャンネルピペットを使用して、微量遠心チューブと96ウェルプレート間の移乗を容易にすることができます。
9. 統計ソフトウェア(Rなど)を使用してデータをプロットおよび分析します。

7. 進化した系統の全ゲノム解読と突然変異の同定

1. ステップ5.9で保存された子孫系統を、セクション2、ステップ2.2-2.5のように、各凍結集団からの氷のスクレープをBBM⁺に接種することにより、48-72時間の75°Cで予熱したBBM⁺で復活させます。十分な量のゲノムDNAを得るために、1〜10 mLの培養量を調製します。必要な正確な量は、ステップ7.2または7.3(下記)でシーケンシング用に選択したオプションによって異なります。
   注:祖先の集団を開始するために使用される系統も配列決定することは良い習慣です。これは、子孫系統で検出された突然変異が進化実験中に発生したのであり、それ以前に生じたものではないかどうかを正しく判断するためです。
2. (オプション1)ゲノムDNAを抽出し、Illuminaシーケンシング用のIlluminaシーケンシングライブラリを調製します。
   1. 市販の細菌用ゲノムDNA抽出キットを使用して、ゲノムDNAを抽出および精製します。
   2. 抽出されたゲノムDNAがシーケンシングプロバイダーの量と品質の要件を満たしていることを確認するには、プロバイダーが推奨する市販のキットを使用します。
   3. ゲノムDNAライブラリーの調製は、市販のキットを用いて、製造元のプロトコールに従って行ってください。250 bp のペアエンド プロトコルが推奨されます。抽出したゲノムDNAは、シーケンシングプロバイダーにサンプルを提出する準備ができるまで-20°Cで保存します。
3. (オプション2)あるいは、DNA抽出、ゲノムDNA品質チェック、Illuminaライブラリ調製、Illuminaシーケンシングを複合サービスとして実施する商用プロバイダーにサンプルを送付することもできます。
4. 配列決定されたゲノムを解析して、突然変異を特定します。
   1. FASTQ ファイルを受け取り、シーケンシング プロバイダーによってまだ実行されていない場合は、Trimmomatic を使用して、スライディング ウィンドウ品質カットオフを Q15 に設定してアダプター トリミングを実行します。
   2. トリミングされたFASTQファイルを使用して、breseqパイプライン(バージョン0.38.1)を実行して突然変異を検出し、ゲノムDNAリードを選択した株の参照配列と比較します。 S. acidocaldarius DSM639の場合、これはRefSeq ID NC_007181です。

8. (オプション)サーモミキサーとインキュベーターのエネルギー消費量の評価

1. インキュベーターとサーモミキサーを使用した場合のエネルギー消費量を比較するには、エネルギー監視プラグを使用して各デバイスの24時間にわたるエネルギー消費量を測定します。
2. 2つのプラグを使用して、両方のデバイスのエネルギー消費量を同時に測定します。または、連続する日のエネルギー消費量を測定します。
3. インキュベーターまたはサーモミキサーをコンセントから外します。エネルギー監視プラグをソケットに差し込み、監視および制御ソフトウェアのインストールなど、製造元の指示に従って初期化します。
4. インキュベーターまたはサーモミキサーをエネルギー監視プラグに差し込み、最低2時間(ただし理想的には24時間以上)稼働させて、一般的なエネルギー消費量を適切に推定します。各デバイスのエネルギー消費量を記録します。

成長曲線の測定
S. acidocaldarius DSM639の成長曲線を図3Aに示します。サーモミキサーを使用したインキュベーションと従来のインキュベーターを使用したインキュベーションを比較すると、成長は同様であることがわかりました。平均成長率パラメータは、反復された各成長曲線にロジスティック曲線を当てはめ、平均誤差と標準誤差を計算することによって推定されました。サーモミキサーとインキュベーターの指数関数的フェーズの中期までの時間は、それぞれ27.2時間±1.1時間、31.1時間±1.9時間でした。75°Cでのサーモミキサーとインキュベーターの推定初期倍加時間は、それぞれ4.29時間±0.28時間、4.19時間±0.44時間であり、これは以前に発表された値と一致している24。log10(OD600nm)とlog10(CFU)の関係は、線形モデル(調整済みR2 = 0.82、F(1,22)= 104、p < 0.00001、傾き = 1.73 ± 0.17、切片 = 9.73 ± 0.14)によってよく特徴付けられました。したがって、OD600nm と CFU の関係は、式 CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)) で与えられます。したがって、外径600nmが0.3の場合、約6.7 ×10 8 CFU/mLに相当します(図3B)。

温度発生実験
S . acidocaldarius DSM639に由来する7つの独立した系統を用いて、一定75°C、一定65°C、一定65°C、および温度降下(75-65°C、2回の転移ごとに1°C減少)の3つの温度条件を開始した。OD600nm の測定は、実験の45日間(75°Cで約150世代)の各移し替えの後に行われ、 図4に示されています。日をまたいで行われるOD600nm の測定は、成長期間や温度などの微妙な違いに左右されるため、本質的にノイズが多くなります。ただし、日をまたいで行われた測定は、集団の生存率を評価するだけでなく、フィットネスが時間の経過とともに改善しているかどうかの指標を提供するのに依然として役立ちます。OD600nm では、75°Cの一定の条件からの系統が、実験終了までに初期範囲0.125-0.3から0.248-0.471の範囲に増加しました。これは、この治療によりフィットネスが向上したことを示唆しています。対照的に、65°Cの定常処理からの系統は、ODが600nmで、初期範囲0.018-0.087から最終時点で0.008-0.04に低下したことを示しました。このことは、個体群が一定の65°Cの温度に適応できなかったことを示唆しているが、生存可能な生物が回収できたという事実は、個体群が連続的な希釈によって洗い流されなかったことを示しており、ある程度の適応を示唆している。最後に、温度降下処理の集団は、Tx6(この処理では288時間および73°Cに相当)で0.099-0.279の初期OD600nm 範囲から0.3-0.39に増加し、その後、最終時点で0.003-0.024の範囲まで着実に減少しました。

成長/フィットネスアッセイ
適応度アッセイは、進化実験に続いて各子孫集団に対して実施された。OD600nm は、7つの独立した系統すべてについて48時間成長後にアッセイされ、続いて、各アッセイ温度に対して「選択環境」を主効果として、「replicate/thermomixer」をブロック効果として、線形モデルをRに適合させました。祖先系統の成長は、治療造影剤の参照レベルとして使用されました。データを 図 5 に示します。

75°Cでアッセイした場合、一定75°C(t検定: t210=3.64、 p = 0.0003)および定数65°C(t検定: t210=2.8、 p = 0.005)処理による系統の系統では、祖先系統よりも平均して適応度が有意に増加しましたが、温度低下処理(t検定: t210=−0.87、 p=0.38)。65°Cでアッセイした場合、平均して、すべての処理の系統でフィットネスの増加が示されました(一定の75°C系統; t検定: t210 = 4.68、 p<0.0001、定数65°C系統; t検定: t210、= 4.24、 p<0.0001、温度低下系統; t検定: t210 = 3.15、 p = 0.002)。しかし、どちらのアッセイ温度でも、系統間の適応度には大きな差がありました(図5)。一部の系統は、先祖代々の系統と大きく異なっていなかったか、適応度が低下していました。これは、温度低下処理の系統で特に顕著でした。

OD600nm とCFU/mLの関係が進化実験中に変化した可能性があることは注目に値します。これは、進化した系統の成長パラメータを決定することで評価できます(ステップ3.1〜3.10に従う)。

全ゲノムシーケンシング結果
全ゲノム解析は、S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq accession NC_007181.1) の参照ゲノムを用いて、75°C条件の7系統についてbreseq(version 0.38.1)を用いて行った。すべての子孫系統のゲノム全体で、挿入、欠失、および一塩基多型(SNP)を含むさまざまな突然変異が明らかになりました(表2)。複数の挿入突然変異と非同義変異は、タンパク質をコードする遺伝子だけでなく、遺伝子のプロモーター領域のフレームシフトにより遺伝子発現に影響を与える可能性のある遺伝子間領域にも見られました。一部の突然変異は、細胞壁の生合成、転写、代謝、細胞輸送、触媒活性などのさまざまな機能に関与する遺伝子の複数の子孫系統にわたって一貫していました(表2)。これらの突然変異の中には、7つの系統のうち5つで54,667塩基対の大幅な欠失がありました。これは、各母集団の欠落カバレッジ証拠プロット(頻度93.2%から100%の範囲)によって確認されました。欠失した領域は、53個の遺伝子の喪失に相当します。これらの遺伝子の適応における役割については、今後の研究で検討する予定です。DSM639の使用した単離物と公表されている参照配列(補足表1を参照)との間には、いくつかの違いが認められました。

振とうインキュベーターとサーモミキサーのエネルギー消費
振とうインキュベーターのエネルギー消費量は、一般的なインキュベーション温度の範囲とここで使用される75°Cの温度で、市販のエネルギーモニタリングスマートプラグを使用したサーモミキサーと比較されました。75°Cでは、サーモミキサーは従来の振とうインキュベーターの約1/40の エネルギーを消費し(図6)、サーモミキサーが実験の進化に関連する二酸化炭素排出量を削減する可能性のある手段であることが示唆されています。

図1:3つの温度処理にわたる進化実験プロトコルを示すフローチャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:成長/フィットネスアッセイプロトコルのステップを示すフローチャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: S. acidocaldarius DSM639の主要な増殖パラメータの決定とインキュベーションデバイスの比較。 3つの複製培養物を7つの別々のチューブで75°Cで増殖させました。破壊サンプリングを使用して、(A)OD600nm ( n = 3テクニカルレプリケートの標準誤差±平均;一部のエラーバーはプロットシンボルよりも小さい)を測定しました。曲線は、適合したロジスティック成長モデルと(B)コロニー形成ユニット(CFU)を表します。線は近似された対数-対数線形回帰モデルを表します)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:進化実験で得られた光学密度(OD600nm)の代表的な結果。 進化実験で測定した独立系統の光学密度を、約150世代にわたって3つの温度処理(定温65°C、定温75°C、低下75°C-65°C)で測定しました。曲線は、各独立した系統の経時的な黄土の滑らかさを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:成長アッセイの代表的な結果。 S. acidocaldarius DSM639に由来する独立系統の増殖アッセイ (祖先株と比較した温度変化実験 (定数 65 °C、定数 75 °C、低下 75 °C-65 °C) の後。すべての系統について、65°Cおよび75°Cで増殖をアッセイしました。 色付きのポイントは、技術的反復の平均±標準誤差を示しています(灰色で表示、祖先はn = 12、進化した系統ごとにn = 3)。灰色のバーは、先祖代々のフィットネスの平均±標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:従来のインキュベーターとサーモミキサーデバイスのエネルギー消費量。 エネルギー消費量は、市販のエネルギー監視スマートプラグを使用して2時間以上記録されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1: S.acidocaldariusの増殖に必要な培地レシピとストック溶液。 すべての培地およびストック溶液は、再蒸留H2O(ddH2O)で調製し、オートクレーブ滅菌または0.22 μmフィルターによるフィルター滅菌のいずれかで滅菌する必要があります。すべての培地およびストック溶液の調製方法の詳細な説明については、プロトコールのセクション1を参照してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:子孫系統の全ゲノムシーケンシングの代表的な結果。 S. acidocaldarius DSM639の子孫の子孫系統に見られる突然変異は、一定の75°C処理から得られます。突然変異は、系統の直接の祖先に対する相対的な変化を示し、系統はS. acidocaldarius DSM639の参照配列に対していくつかの変化を有する(RefSeq NC_007181;祖先の突然変異は補足表1に示されている)。n は、突然変異が見つかった系統の数を示します。「フォワードリーディングフレーム」上の→遺伝子。「逆読み取りフレーム」上の←遺伝子。†これらの変化は、S. acidocaldarius DSM639の分離株に存在する(A)10→11フレームシフトに関連しています(補足表1)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 

補足表1:参照配列に対する S.acidocaldarius DSM639の分離株に存在する変異(RefSeqアクセッションNC_007181.1)。 「フォワードリーディングフレーム」上の→遺伝子。「逆読み取りフレーム」上の←遺伝子。NC_007181.1ではSACI_RS04020が偽遺伝子としてアノテーションされていますが、ここで観察されたΔ1 bpフレームシフト変異は、突然変異と同様にその機能を回復し、 rgy 逆ジャイレース遺伝子と100%同一性を持つタンパク質をコードしていると推定されています(RefSeqアクセッションWP_176586667.1)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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