オルガノイドは、疾患モデリングのための貴重なツールとなっています。細胞外マトリックス(ECM)は、オルガノイド生成中の細胞運命を導き、天然組織に似たシステムを使用することで、モデルの精度を向上させることができます。この研究では、動物由来のECMとゼノフリーのハイドロゲルにおける人工多能性幹細胞由来ヒト腸オルガノイドの生成を比較しています。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の挙動と発生において重要な役割を果たします。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から作製したオルガノイドは、多くの研究分野で注目されています。しかし、従来の細胞培養材料には生理的な手がかりがないため、効率的なiPS細胞の分化が妨げられています。市販のECMを幹細胞培養に組み込むと、細胞の維持に有益な物理的および化学的手がかりが得られます。動物由来の市販基底膜製品は、ECMタンパク質と細胞の維持をサポートする成長因子で構成されています。ECMは細胞の運命を調節できる組織特異的な特性を保持しているため、ゼノフリーマトリックスを使用して翻訳を臨床研究に流します。市販のマトリックスは、hiPSCやオルガノイドの研究に広く使用されていますが、これらのマトリックスの同等性はまだ評価されていません。本研究では、マトリゲル(Matrix 1-AB)、Geltrex(マトリックス2-AB)、Cultrex(マトリックス3-AB)、VitroGel(マトリックス4-XF)の4つの異なるマトリックスにおけるヒトヒト腸管オルガノイド(hIO)の産生について比較研究を行いました。コロニーは完全な円形を欠いていましたが、自発的な分化は最小限であり、細胞の85%以上が幹細胞マーカーSSEA-4を発現していました。マトリックス4-XFは、3Dの丸い塊の形成につながりました。また、Matrix 4-XFハイドロゲル溶液の調製に用いる培地中のサプリメントおよび成長因子の濃度を上げると、SSEA-4のhiPSC発現が1.3倍改善しました。マトリックス2-AB維持型ヒトPSCの分化により、他の動物由来の基底膜と比較して、中腸/後腸期のスフェロイド放出が少なくなりました。他のものと比較して、ゼノフリーオルガノイドマトリックス(Matrix 4-O3)は、より大きく、より成熟したhIOをもたらし、ゼノフリーハイドロゲルの物理的特性を利用してオルガノイド生成を最適化できることを示唆しています。全体として、この結果は、異なるマトリックスの組成の変動がIO分化の段階に影響を与えることを示唆しています。この研究は、市販の行列の違いについての認識を高め、iPSCおよびIO作業中の行列最適化のガイドを提供します。
概要
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の挙動と発生の調節に中心的な役割を果たす組織の動的で多機能な構成要素です。複雑なネットワークとして、構造的な支持体、細胞接着性リガンド1、細胞シグナル伝達を調節する成長因子やサイトカインの貯蔵を提供します。例えば、創傷治癒中、ECMは移動する細胞の足場として、また組織修復に関与する成長因子の貯蔵庫として機能します2。同様に、ECMの調節不全は、線維症や癌などのさまざまな疾患の重症度の増加につながる可能性があります3,4。胚発生中、ECMは組織の形態形成を導きます。例えば、心臓の発達において、ECMコンポーネントは、心臓組織の正しい構造および機能を作り出す役割を果たす5。10年以上にわたる研究により、微小環境の硬さだけでも6,7が幹細胞の系統の仕様を制御できることが示されています。したがって、in vitroでの細胞分化中に、ECMが分化のシグナルを提供することで幹細胞の運命に影響を与えることは驚くべきことではありません。
オルガノイドは、人工多能性幹....
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プロトコル
1. hiPSCのメンテナンス
注意:すべての作業は、標準的な無菌技術に従ってバイオセーフティキャビネット(BSC)で行われます。白衣、手袋、ゴーグルなどの個人用保護具の適切な使用を含む、研究所のOSHA安全基準に従う必要があります。
- マトリックス、アリコート、細胞培養培地の調製
- 市販の動物由来基底膜(BM;Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB)は、 表1 に要約されたメーカーの推奨に従って作業量のアリコートを調製し、-20°Cまたは-80°Cで長期保存します。気泡の形成を避けてください。気泡が形成された場合は、保存する前に、サンプルを4°C、<200 x gで1~2分間遠心分離して 、 気泡を表面に浮かべます。
注:シングルユースアリコートを作成すると、ECMアーキテクチャを混乱させる凍結融解サイクルの繰り返しを回避できます。BM濃度はロット番号によって異なるため、メーカーの推奨に従ってシングルユースアリコートを準備し、コーティング溶液を調製してください。高濃度のBMは粘性があり、ピペッティングが困難です。以前に-20°Cで保存したコールドチップを使用してください。 - 幹細胞培養液は、メーカーの推奨に従って調製してください。このプロトコルで使用される特定の市販の完全培地を調製するには、100 ....
- 市販の動物由来基底膜(BM;Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB)は、 表1 に要約されたメーカーの推奨に従って作業量のアリコートを調製し、-20°Cまたは-80°Cで長期保存します。気泡の形成を避けてください。気泡が形成された場合は、保存する前に、サンプルを4°C、<200 x gで1~2分間遠心分離して 、 気泡を表面に浮かべます。
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結果
このプロトコールに従って、市販の基底膜とゼノフリーのハイドロゲルシステムを利用して、hiPSC細胞を培養し、それらをhIOに分化させることに成功しました。これらの実験の主な目的は、hiPSCおよびhIO研究のためのさまざまなソースからのマトリックスの同等性を体系的に評価することでした。このプロトコールの最初のセクションでは、効率的な腸内オルガノイド生成をもたらす健康なiPS細胞培養の維持と特性評価に焦点を当てました。動物由来のマトリックス1-AB、マトリックス2-AB、およびマトリックス3-ABで培養器をコーティングするプロセスについて説明し、ゼノフリーのハイドロゲルシステムであるマトリックス4-XFと比較しました。
図3Aに示すように、hiPSCのBXS 0116(CD34+由来)は、3つの動物由来のマトリックスで培養した場合、同等の形態を示します。それにもかかわらず、BXS 0116細胞株をMatrix 1-ABコーティングウェルで培養したSCTi003-A(PBMC由来)と比較すると、細胞株間の本質的な違い(
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ディスカッション
幹細胞およびオルガノイドの作業に最適な微小環境を選択することは、これらのプラットフォームを幅広いアプリケーションに使用する際の極めて重要な初期ステップです。私たちの代表的な結果は、マトリックス4-XFO3が高濃度の成長因子と組み合わさってより大きなオルガノイドにつながることを示しており、ゼノフリーハイドロゲルの物理的特性を利用して、これらのシステムを使用してオルガノイド生成を最適化できることを示唆しています。細胞外マトリックス(ECM)のユニークな特性が、臓器内の細胞の同一性と密接に絡み合っていることが以前に示されている12。細胞はインテグリンや他の受容体を介して外力を感知するため、ECMの機械的特性は幹細胞に深く影響し、それに応じて幹細胞は内力を生成することができる12。幹細胞とその微小環境との間の相互作用は、多様なシグナル伝達経路を開始する鍵となる12。さらに、ECMは、細胞の挙動に影響を与える成長因子やその他のシグナル伝達分子を保存および放出するためのリザーバーとして機能することが示されて.......
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開示事項
ジョン・フアン博士は、TheWell Bioscienceの創設者兼CEOです。
謝辞
著者らは、Christina Pacak博士、Silveli Susuki-Hatano博士、Russell D'Souza博士によるhiPSCおよびオルガノイド研究の開始に関する以前のトレーニングと一般的な推奨事項を認めています。彼らは、 in vitro 細胞培養作業にハイドロゲルシステムを使用するための指導を提供してくれたChelsey Simmons博士に感謝しています。また、著者らは、hiPSC培養に関する指導をいただいたSTEMCELL TechnologiesのChristine Rodriguez博士とThomas Allison博士に感謝します。また、著者は、出版費用を負担してくれたTheWell Bioscienceにも感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェルプレート(培養処理済み、滅菌) | ファルコン | 353504 | |
| 37 °Cウォーターバス | VWR96 | ||
| ウェルプレート | フィッシャーサイエンティフィック | FB012931 | |
| アドバンスドDMEM / F12 | テクノロジー | ズ12634 | |
| アドヒアランスリンスSolutioSTEMCELL | テクノロジー | ズ7010 | |
| 生物学的安全キャビネット(BSC) | Labconco | ロジック | |
| 明視野顕微鏡 | エコー反逆者 | REB-01-E2 | |
| BXS0116 | ATCC | ACS-1030 | |
| 温度制御付き遠心分離機(4°;C 機能) | ThermoScientific | 75002441 | |
| コニカルチューブ、15 mL、滅菌済み | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| コニカルチューブ、50 mL、滅菌済み | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Cultrex RGF BME、Type 2 | Bio-techne | 3533-005-02 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME | Bio-techne | 3434-010-02 | |
| D-PBS (Ca++およびMg++なし) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor | Gibco | A14133-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) | Luminex | 0500-3115 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C、5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| JMP Software | SAS Institute | JMP 16 | |
| MATLAB | MathWorks, Inc | R2022b | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free | Corning | ||
| マトリゲル基質高濃度(HC)、成長因子低減(GFR)LDEVフリー | コーニング | ||
| mTeSR Plus Medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| Nunclon Delta 表面処理 24 ウェルプレート | Thermo Scientific | 144530 | |
| PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) | BD Pharmingen | 566841 | |
| PE Mouse Anti-human CDX2 | BD Pharmingen | 563428 | |
| PEマウス反ヒトFOXA2 | BD Pharmingen | 561589 | |
| PerCP-Cy 5.5マウス反ヒトSSEA4 | BD Pharmingen | 561565 | |
| ReLeSR | STEMCELL | 5872 | |
| SCTi003-A | STEMCELL Technologies | 200-0510 | |
| 血清ピペット (10 mL) | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-11E | |
| 血清ピペット (5 mL) | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-11D | |
| STEMdiff 腸管オルガノイド増殖培地 | STEMCELL Technologies | 5145 | |
| STEMdiff 腸オルガノイドキット | STEMCELL Technologies | 5140 | |
| Vitrogel ハイドロゲルマトリックス | TheWell Bioscience | VHM01 | |
| VitroGel オルガノイドディスカバリーキット | TheWell Bioscience | VHM04-K |
参考文献
- Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
- Hinz, B., Gabbiani, G.
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再版と許可
