方法論記事

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

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DOI:

10.3791/66279

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2024年1月19日

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1Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 2Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, 3Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, 4Department of Physics and Astronomy, Clemson University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

アフリカのトリパノソーマの血流型のグリコソームの環境的手がかりにpHがどのように応答するかを研究する方法について説明します。このアプローチでは、pH感受性遺伝性タンパク質センサーとフローサイトメトリーを組み合わせて、経時アッセイとハイスループットスクリーニングフォーマットの両方でpHダイナミクスを測定します。

要約

グルコース代謝は、アフリカのトリパノソーマ( Trypanosoma brucei)にとって、寄生虫発生の必須代謝プロセスおよび調節因子として重要です。環境中のグルコースレベルが変化したときに生じる細胞応答については、ほとんど知られていません。血流寄生虫とプロサイクリック型(昆虫期)寄生虫の両方で、グリコソームは解糖の大部分を収容しています。これらの細胞小器官は、グルコース欠乏に応答して急速に酸性化され、その結果、ヘキソキナーゼなどの解糖酵素のアロステリック調節が起こる可能性があります。以前の研究では、pH測定に使用する化学プローブの局所化が困難であり、他のアプリケーションでの有用性が制限されていました。

この論文では、遺伝性タンパク質pHバイオセンサーであるグリコソーム局在性pHorin2を発現する寄生虫の開発と使用について説明します。pHluorin2 はレシオメトリック pH バリアントであり、395 nm で pH(酸)依存的な励起の低下を示すと同時に、475 nm での励起の増加を示します。トランスジェニック寄生虫は、pHluorin2オープンリーディングフレームをトリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングすることによって生成され、どちらのライフサイクルステージでも誘導可能なタンパク質発現を可能にしました。免疫蛍光法を用いて、pHluorin2バイオセンサーのグリコソーム局在を確認し、バイオセンサーの局在をグリコソーム常在タンパク質アルドラーゼと比較しました。センサーの応答性は、以前にフルオレセインベースのpHセンサーのキャリブレーションに使用したアプローチである、pH 4 から 8 の範囲の一連のバッファーで細胞をインキュベートすることにより、異なる pH レベルでキャリブレーションしました。次に、フローサイトメトリーを用いて405 nmおよび488 nmのpHluorin2蛍光を測定し、グリコソームのpHを測定しました。PF寄生虫のグリコソーム酸性化の引き金として知られているグルコース欠乏に反応してpHを経時的にモニタリングし、生きたトランスジェニックpHluorin2発現寄生虫の性能を検証しました。このツールは、ハイスループット薬物スクリーニングに使用される可能性など、さまざまな用途が考えられます。グリコソームのpHだけでなく、このセンサーを他のオルガネラに適合させたり、他のトリパノソーマチドに使用したりして、生細胞環境におけるpHダイナミクスを理解することができます。

概要

寄生キネトプラスチドは、ほとんどの生物と同様に、中枢炭素代謝の基本的な構成要素としてグルコースに依存しています。このグループには、アフリカのトリパノソーマ、トリパノソーマ・ブルーセイなどの医学的に重要な生物が含まれます。アメリカのトリパノソーマ、T. cruzi; リーシュマニア属の寄生虫。グルコース代謝は、病原性ライフサイクル段階における寄生虫の増殖に不可欠です。例えば、グルコースが奪われると、アフリカトリパノソーマの血流型(BSF)は急速に死滅します。特に、解糖系は、感染のこの段階でATPの唯一の供給源として機能します1。リーシュマニア寄生虫も同様に宿主のグルコースに依存しており、宿主マクロファージに存在するアマスティゴートのライフサイクルステージは、成長のためにこの炭素源に依存しています2。

これらの寄生虫は、異なる昆虫媒介者を含む異なるライフスタイルを持っていますが、ブドウ糖への反応と消費方法には多くの共通点があります。例えば、これらの寄生虫は、ほとんどの解糖酵素をグリコソームと呼ばれる修飾ペルオキシソームに局在化させます。このキネトプラスト特異的細胞小器官は、保存された生合成メカニズムと形態に基づいて、哺乳類のペルオキシソームに関連しています3,4,5,6。

解糖系経路酵素のほとんどをグリコソームに区画化することで、寄生虫特異的な経路制御手段が提供されます。化学的pHプローブを用いて、栄養欠乏がプロサイクリック型(PF)グリコソームの急速な酸性化を引き起こし、主要な解糖酵素であるヘキソキナーゼ7,8のアロステリック調節因子結合部位の露出により解糖酵素活性を変化させることを立証しました。以前の研究では、化学プローブは使用するために一定の送達を必要とし、他の用途での有用性は限られていました。さらに、BSF中のグリコソーム内のプローブ分布を維持するという課題により、そのライフステージにおけるグリコソームのpHを調査するためのアプローチの有用性が制限されていました。

本研究では、蛍光タンパク質バイオセンサーpHluorin2を用いて、グルコース飢餓などの環境要因に応答したBSF T. brucei のグリコソームpH変化をモニターしました9 (図1)。この研究の結果は、BSF T. brucei が飢餓に応答してグリコソームを急速に酸性化することを示唆しています。このバイオセンサーにより、 T. brucei および関連寄生虫の解糖系制御に関する理解が深まることが期待されます。

プロトコル

単型寄生虫株である T. brucei brucei 90-13 BSFトリパノソーマは、バイオセーフティレベル2の施設で取り扱うべきリスクグループ2の生物とされているため、安全性への配慮が必要です。

1. トリパノソーマの培養とトランスフェクション

  1. HMI-9培地中の培養T. brucei brucei 90-13 BSFトリパノソーマに、5%CO2、10%、37°Cで10%熱不活化FBSおよび10%Nu-Serumを添加した。
    注:培養を健康に保つには、細胞密度を2〜104 〜5〜10×6 細胞/mL×維持してください。
  2. pHluorin2-PTS1のpLEW100v5へのクローニング
    1. pHluorin2オープンリーディングフレームを商業的に合成して、2つのグリシンリンカーをコードする3'伸長とそれに続くPTS1局在タグであるトリペプチドAKLを有する遺伝子を産生する。
    2. 制限酵素消化により、このコンストラクトを誘導性トリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングします。pHluorin2-PTS1 と pLEW100v5 を含むクローニングベクターを、HindIII と BamHI11 を用いて二重消化します。クリーンアップステップを、好ましくはアガロースゲル精製により行い、制限酵素、望ましくないクローニングベクター骨格、および切除したルシフェラーゼ遺伝子含有断片を除去する。
    3. pHluorin2含有インサートを消化されたpLEW100v5にT4 DNAリガーゼ12でライゲーションします。(クローニングのスキームについては、 補足図S1 を参照)。
  3. 次世代全プラスミドシーケンシングによりプラスミドをシーケンシングし、インサートとベクターが正しくライゲーションされ、クローニングプロセス中にpHluorin2-PTS1遺伝子内に変異が導入されていないことを確認します。
    注:完全なプラスミド配列は Addgene.org に提出され、#83680が割り当てられています。
  4. 20 μgのプラスミドを40単位のNotIで消化して直鎖化します。次に、参照したヒトT細胞キット( 材料表を参照)を使用して、ヌクレオフェクションを介してBSF 90-13寄生虫にトランスフェクションします。Burkard et al.13 によって記述されているように、安定した積分を選択します。

2. pHlourin2-PTS1の免疫蛍光共局在

  1. 顕微鏡スライドをポリ-L-リジン0.1%(w/v)含有H2Oで10分間処理して作製します。ポリ-L-リジン溶液を除去した後、スライドをPBSで一度洗浄します。
  2. pHluorin2-PTS1発現を誘導するには、採取の24時間前に2×105細胞/mLの細胞をテトラサイクリンまたはドキシサイクリン(1μg/mL)で処理します。遠心分離(室温[RT]、10分、1,000×g)により、親および誘導されたpLEWpHluorin2-PTS1(pHL)寄生虫を2×10 6ペレットし、PBSで1回洗浄する。
  3. 市販の16%EMグレード溶液から調製したPBSに調製した200 μLの2%パラホルムアルデヒドに細胞を再懸濁します。固定液中の細胞をスライドに塗布し、細胞を30分間沈降させます。接着した細胞を洗浄液(PBS中の0.1%正常ヤギ血清)で2回洗浄します。
  4. 透過処理溶液(0.5% Triton X-100 in PBS)を細胞に塗布し、正確に30分間インキュベートします。透過処理液を取り出し、十分な量の洗浄液で一度洗浄してください。
  5. ブロック溶液(10%正常ヤギ血清と0.1%Triton X-100 PBS溶液)を塗布し、30分間インキュベートします。
  6. T. brucei aldolase 1:500に対して提起した抗血清をブロック溶液で希釈し、細胞に塗布する14。室温で1時間インキュベートし、スライドを洗浄液で3〜5分間5回洗浄します。
  7. ヤギ抗ウサギAlexa fluor 568 1:1,000をブロック溶液で希釈し、細胞に塗布します。室温で1時間インキュベートし、スライドを洗浄液で3〜5分間5回洗浄します。
  8. 封入剤を塗布し、カバーガラスをスライドに密封します。
  9. 100倍の対物レンズ(NA 1.4-0.7)で細胞を画像化し、ImageJを使用して画像を解析します。ImageJ の 'Coloc 2' プラグインを使用して Pearson の共局在解析を実行します。代表的なセルのフィールドについては、 補足図S2 を参照してください。)
    1. これを完了するには、画像ファイルをフィジーに追加し、[ 画像] を選択します。
    2. 各チャンネルの明るさとコントラストを調整して、背景が見えないようにします。
    3. 画像を 16 ビットから 8 ビットに変更し、画像を結合してから、チャンネルが分割された 1 つのセルにトリミングします。
    4. 「解析と共局在化」で、「Coloc2」プラグインを選択します。チャンネル 1 としてアルドラーゼ(赤チャンネル)、チャンネル 2 として pHL(緑チャンネル)を選択し、[OK] をクリックして Pearson 相関の計算を開始します。

3. フローサイトメトリー用のサンプル調製

  1. テトラサイクリンまたはドキシサイクリン(1 μg/mL)のいずれかでpHL細胞を一晩誘導します。
  2. 遠心分離(RT、10分、1,000 × g)により細胞(~4 × 107 pHLおよび~1 × 106 pHL)をペレット化します。上清を除去し、サンプルが飢餓状態にあるか、飢餓状態になっていないかに応じて、10 mMグルコースの有無にかかわらず、細胞を1 mLのPBSに再懸濁します。経時アッセイでは、洗浄が完了するまで細胞が飢餓状態にならないように、10 mMグルコースを添加したPBSに再懸濁します。ハイスループットスクリーン(HTS)アッセイでは、グルコースのキャリーオーバーを最小限に抑えるために、グルコースを含まないPBSに再懸濁します。さらに2回洗浄を繰り返します。
  3. 細胞を4回目に遠心分離し、上清を除去し、処理に応じて、細胞ペレットをPBS、PBSと5 mMグルコース、またはPBSと10 mMグルコースのいずれかに再懸濁します。生死測定のために、1 μg/mL のヨウ化プロピジウム(PI)または 100 nM チアゾールレッド(TR)をサンプルに添加します。各サンプルをフローサイトメーターに適合する5 mLチューブに移します。

4. フローサイトメトリー

注:405 nm(紫色)、488 nm(青色)、561 nm(黄色)または638 nm(赤色)のレーザーを含むフローサイトメーターで実験を準備します。以下で説明するチャネルの一般名については、 補足表 S1 を参照してください。

  1. pHL蛍光を測定するには、チャンネルKO525(VL2-H、励起405 nm、発光542/27 nm)およびFITC(BL1-H、励起488 nm、発光530/30 nm)を使用します。生細胞と死細胞を区別するには、PIまたはTRを使用します。YL2-Hチャンネル(励起561 nm、発光620/25 nm)のPIを測定します。RL1-Hチャンネル(励起波長638 nm、660/10 BP)でTRを測定します。
    1. フローサイトメーターソフトウェアで実験をセットアップするには、1)YL2-Hチャネルヒストグラム(PIを使用する場合)またはRL1-Hチャネルヒストグラム(TRを使用する場合)、2)FSC-AとSSC-Aのドットプロット、3)FSC-AとFSC-Hのドットプロット、4)BL1-HとVL2-Hのチャネルのドットプロットを作成します。
    2. 最初に未染色のWT(親細胞株)コントロールをサンプル注入ポート(SIP)に置き、ステージを所定の位置に持ち上げます。サイトメーターで最低流速でデータの取得を開始し、必要な調整を行う時間を確保します。偽の破片や死細胞のスコアリングを回避するには、サンプル取り込み開始から 5 秒後にイベントの記録を開始します。
    3. YL2またはRL1電圧を調整して、メインピークが103-10 4 相対蛍光強度(RFI)単位以内になるようにします。イベントの>90%がドットプロットに収まるようにFSCとSSCの電圧を調整します。FSC閾値を調整して、デブリ集団を除外しますが、可能性の低い細胞は除外します。
    4. VL2 および BL1 チャンネルを調整して、一次ピークが 103 から 104 RFI 単位以内になるようにします。
    5. PIまたはTRで染色した誘導pHLを含む最初のサンプルをSIPに置き、ステージを所定の位置に上げます。最低流量でデータの集録を開始し、各プロットのイベントを注意深く観察します。イベントの>90%が各プロット内にあり、VL2-HおよびBL1-Hチャネルを飽和させるイベントがないことを確認します。
  2. サンプルの実行を続行します。サンプルごとに少なくとも 10,000 個のイベントを記録してください。
  3. サンプルのデータを .fcs ファイル形式で保存し、分析用にエクスポートします。

5. フローサイトメトリー結果のデータ解析

注:このデータ分析ワークフローでは、FlowJoソフトウェアを使用します。他のフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用する場合は、ソフトウェアに適したツールを使用して、以下に説明する主要な手順を引き続き実行してください。プロットとゲーティングを可視化するには、 補足図S3 および 補足図S4を参照してください。

  1. 新しいレイアウトを開き、手順 4.3 で取得した .fcs ファイルを開きます。.fcs ファイルをレイアウト ウィンドウにドラッグ アンド ドロップします。
  2. 生細胞用のゲート。
    1. 染色されていないWTコントロールをダブルクリックして、このサンプルのウィンドウを開きます。
    2. YL2-Hチャネル(PIを使用する場合)またはRL2-Hチャネル(TRを使用する場合)のいずれかのヒストグラムとしてデータを表示します。これと生存色素で染色したサンプルを切り替えて、生きている個体群と死んだ個体群を同定します。
      注:このサンプルには生存率色素が添加されていないため、すべてのイベントは染色されていない必要があります。
    3. 生きている集団と死んだ人口を分ける二等分線ゲートを作成します。左のゲートに 「Live 」、右のゲートに 「Dead」という名前を付けます。このゲートをすべてのサンプルに適用し、サンプルを切り替えて、このゲートがすべてのサンプルに対して適切に描画されるようにします。必要に応じてゲートを調整します。
  3. セルのゲート。
    1. 染色されていない WT コントロールで、 ライブ ゲートをダブルクリックして、そのゲートのイベントを表示します。ドットプロットの x軸 を FSC-A に、 y軸 を SSC-Aに変更します。
    2. ポリゴン ゲート ツールを使用して、セル集団の周囲にゲートを描画し、「Cells」という名前を付けます。破片/死にかけている細胞(通常はドットプロットの左端と下部)と凝集体(ドットプロットの右端と上部)を除外するように注意してください。
    3. このゲートは、すべてのサンプルの ライブ ゲートの下に適用します。サンプルを切り替えて、ゲートがすべてのサンプルの可能性のある細胞集団を網羅していることを確認し、必要な調整を行います。ゲートを変更した後は、必ずすべてのサンプルにゲートを再適用してください。
      注:細胞集団の分布は、FSCとSSCの飢餓状態と非飢餓状態の間で顕著に変化します。 セルゲート がすべての条件で細胞集団を包含していることを確認します。
  4. pH測定の品質を向上させるシングルセル用のゲート。
    1. 染色されていないWTコントロールで、 セル ゲートをダブルクリックして、そのゲートのイベントを表示します。ドットプロットの x軸 を FSC-A に、 y軸 を FSC-Hに変更します。
    2. このドットプロットで、シングルセルの対角分布を探し、シングレット集団の右下に2次母集団を形成しているダブレットを探します( 補足図S1 の3番目のプロットを参照)。 ポリゴン ゲート ツールを使用して、ダブレット母集団を除いたシングレット イベントの周囲にゲートを描画します。このゲートに 「シングレット」という名前を付けます。
    3. すべてのサンプルについて、Cellゲートの下にSingletsゲートを適用します。ここでも、サンプルを切り替えて、ゲートが一重項母集団を含めながらダブレット母集団を適切に除外していることを確認します。必要に応じて調整します。
  5. 蛍光pHL細胞用のゲート。
    1. 染色されていないWTコントロールサンプルで、 シングレット ゲートをダブルクリックして、その母集団のドットプロットを開きます。 x軸 を BL1-H に、 y軸 を VL2-Hに変更します。
    2. pHセンサpHluorin2は、VL2とBL1の両方で蛍光を発します。 ポリゴンゲートツールを使用して 、ドットプロットの左下の自家蛍光集団から上部と直後に伸びる斜めのゲートを描画します。このゲートに pHL+ という名前を付けます。
    3. すべてのサンプルについて、シングレットゲートの下にpHL+ゲートを適用します。pHLサンプルに切り替え、WTコントロールよりもVL2-HとBL1-Hの両方で蛍光強度が高いイベントが含まれるようにゲートを調整します。グリコソームのpHが変化すると、この集団の位置が変化するため、このゲートがすべてのサンプルでこの蛍光集団を包含するようにしてください。
      注:pHL+ 集団におけるこの小さいながらも目に見える変化は、蛍光色素の励起スペクトルの pH 依存的な変化によるものです。
  6. 統計情報をエクスポートします。
    1. [テーブル エディター] |編集バー |[列の追加] をクリックして、エクスポートする新しい統計を追加します。
      注: エクスポートする統計ごとに、それぞれの統計とエクスポート元の母集団を選択します。[中央値] など、該当する統計情報に適切なパラメーターを選択してください。サンプルは変更しないでおきます。
    2. 統計量として、 Total (ungated) Count、pHL+ Count、Live Freq. of Total (percentage based on total events)、pHL+ Freq. of Parent (percentage based on parent gate)、pHL+ Median VL2-H、pHL+ Median BL1-H の列を追加します。
    3. [テーブル エディタ] をクリックし、エクスポート設定の [表示先→ ファイルへ] と [テキスト → CSV] を変更し、ファイルの保存先と名前を選択します。[テーブルの作成] をクリックします。
  7. 蛍光比を計算します。
    1. エクスポートした.csvファイルをスプレッドシートファイルとして保存します。
    2. 実験のすべてのサンプルで、サンプルあたりのイベント数、ライブイベントの割合、pHL+ イベントの割合を比較して、品質管理分析を実行します。実験に応じて、棒グラフまたは散布図でこれらを視覚的に比較します。
    3. 新しい列に pHL+ 中央値 VL2/BL1 というラベルを付けます。各サンプルについて、式(1)に示すように、VL2-H値の中央値をBL1-H値の中央値で割ります。
      figure-protocol-1(1)
  8. 蛍光比を用いた統計解析を行うには、統計解析ソフトウェアを使用します。

6. pHバイオセンサーの校正

注:測定した蛍光比をpH単位に変換するには、ニゲリシンおよびバリノマイシンを使用してpHL発現細胞をキャリブレーションします。ニゲリシンはK+/H+アンチポーターであり、緩衝液中に十分なK+がある場合に膜を横切ってpHを平衡化できるイオノフォアである15。ニジェリシンは、pHluorinやその他のpHセンサーの校正に一般的に使用されています16,17。ペルオキシソームに局在するpHluorinは、10 μMのnigericin18を使用して以前に較正されていたため、その濃度で処理することを選択しました。バリノマイシンはカリウムイオノフォアであり、ミトコンドリア膜全体のpHを平衡化するために(4 μMで)使用されています19。10 μM のバリノマイシンを使用して、K+ イオンが膜全体で平衡化されるようにすることで、ニゲリシンの pH 平衡化活性を補助しました。ニゲリシンとバリノマイシンの組み合わせを使用しましたが、ニゲリシンはオルガネラのpHを平衡化するのに十分である可能性があります。

  1. それぞれ 5 〜 8.5 の範囲の異なる pH で、ユニバーサルキャリブレーションバッファー(UCB、15 mM MES、15 mM HEPES、および 130 mM KCl)の 8 つの溶液を調製します。
  2. 遠心分離機(RT、10分、800-1,000 × g)を、2 mLのpHL発現BSF培養物(各4~×4~106細胞)の8本の別々のチューブで遠心分離(RT、10分、800-1,000 g)します。
  3. 上清を除去し、各細胞ペレットを異なるpH値でUCBに再懸濁します。
  4. ニゲリシンとバリノマイシンをそれぞれ10 μMに導入します。 PI のスパイクを 1 μg/mL にします。
  5. 各溶液中の細胞を15分間インキュベートします。
  6. 各サンプルをフローサイトメーターで分析し、ステップ4〜5で説明したように蛍光比を測定します。
  7. この実験をさらに 2 回繰り返して、各 pH 値について 3 回の生物学的複製を取得します。データを .fcs 形式でエクスポートします。
  8. 手順 5.1 から 5.8 の説明に従って .fcs ファイルを分析します。各pHで測定された蛍光比を使用して、式(2)を使用する将来の実験でグリコソームのpHを補間します。
    figure-protocol-2(2)
    注: 補足図S3 は、ドットプロットとゲーティングスキームを示しています。その結果を 補足表S2に示す。GraphPad Prismを用いて蛍光比からpHを補間する方法は以下のとおりです。他の統計ソフトウェアを使用している場合は、同じ重要な手順に従ってください。
    1. GraphPad Prismを開き、3つのy-反復をもつXY表を作成します。pH 値を x カラムに貼り付け、関連する蛍光比値を y レプリケートカラムに貼り付けます。
    2. テーブルに関連付けられているグラフをクリックします。グラフを表示しているときに、[分析]リボンの[分析]をクリックします。XY解析で検量線を補間します。
    3. シ グモイド、4PL、Xは対数(濃度) を選択してください。[上] パラメーターと [下限] パラメーターは、推定される上端と下端のプラトーです。[ 外れ値の特別な処理なし] を選択します。
      注: ソフトウェアは、式 (2) およびステップ 6.9.3 で記述されたモデルにデータを適合させようとします。結果の表とグラフの曲線で適合不足の証拠を探します。
    4. 他の実験の蛍光比からpHを補間するには、pHLキャリブレーションデータの表を参照してください。蛍光比の値をキャリブレーションデータの下に y カラムに貼り付けます。各 y 値にタイトルを付けますが、x 値 (pH) は不明であるため空白のままにします。
    5. 結果ギャラリーで、補間分析をクリックし、補間X複製タブに移動します。入力した蛍光比値と一緒にリストされる補間されたpH値を探します。
      注:ソフトウェアは、キャリブレーションデータから見つかったモデルと最適なパラメーター値を使用して、pH が不明な実験の蛍光比から pH を補間します。

7.グルコース飢餓とアドバックのタイムコース

  1. ステップ 1.1 で説明したように、1 μg/mL のドキシサイクリンを 37 °C でインキュベートした状態で、15 mL の BSF pHL 寄生虫を一晩誘導します。
  2. 15 mL の誘導 pHL 培養液を 10 mM グルコースを添加した PBS で洗浄します。この手順を3回繰り返します。
    1. 同時に、ステップ3.2の説明に従って、3 mLのWT培養物をPBS 3xで洗浄します。
    2. pHLサンプルを1 mLのPBSに再懸濁したときの最初の洗浄後、0.1 mLのpHL細胞懸濁液を除去して、飢餓状態のコントロールとして10 mMのグルコースを保持します。
  3. 最終洗浄後、pHL サンプルを 1 μg/mL の PI を添加した PBS に再懸濁します。
  4. フローサイトメトリーデータの取得
    1. 実験とサンプルに応じて、5分、10分、30分、または90分ごとにフローサイトメーターで各サンプルを測定することにより、飢餓サンプルと飢餓していないサンプルの両方のグリコソームpHのモニタリングを開始します。ステップ 4.1 から 4.3 の説明に従ってフローサイトメトリーデータを取得し、電圧とプロットが事前に準備されていることを確認します。
    2. 最初に未染色のWTコントロールを0分で実行します。
    3. 飢餓状態のコントロールサンプルをサイトメーターで、0分から90分ごとに実行します。飢餓時経過アッセイでは、飢餓サンプルを 0 分から 10 分ごとに分析します。グルコース アドバック アッセイでは、飢餓状態のサンプルを 0、5、10、20、30、60、および 90 分で分析します。その後、ブドウ糖を導入した後に繰り返します。
    4. サンプルを室温で、90 分間の飢餓時間コースと 180 分間のグルコース アドバック時間コースでインキュベートします。
  5. 手順 5.1 から 5.8 の説明に従って .fcs ファイルを分析します。
    注: 補足図S4 は、ゲーティングの実行方法とドットプロットがどのように見えるかを示しています。 補足表S3 及び 補足表S4 は、それぞれ、グルコース飢餓時間経過アッセイ及びグルコース加算時間経過アッセイの結果を示す。

8. 薬物スクリーニングのためのアッセイの最適化

  1. 前述したように、約 32 mL の pHL 発現 BSF 寄生虫と 3 mL の WT 細胞を、どちらも約 2 × 106 cells/mL、2 倍の PBS で洗浄します。
    注:測定された蛍光比のばらつきを最小限に抑え、Zファクター統計を正確に測定するには、ウェルごとに10,000を超えるイベントを記録する必要があります。これを達成するために必要な最小培養液は約26 mLですが、取り扱いを容易にするために32 mLを推奨します。
    1. 最初の洗浄後、pHLサンプルを2本の微量遠心チューブに均等に分離します。
  2. 洗浄後、1 つの pHL サンプルを 5 mM グルコース、0.1% DMSO、TR を含む 18 mL の PBS に再懸濁し、もう 1 つの pHL サンプルを 18 mL の PBS と 0.1% DMSO および TR に再懸濁します。
    注:化合物は通常DMSOに溶解するため、DMSOは薬物スクリーニングで緩衝液組成を模倣するために使用されます。
  3. これら 2 つの細胞溶液を 12 ウェルリザーバー(ウェルあたり 9 mL)に移します。
  4. ピペッティングロボットを使用して、細胞溶液を384ウェルプレートの別々の半分(ウェルあたり80 μL)にピペッティングします。
  5. プレートを室温で1.5時間インキュベートし、静かに振とうし、蛍光色素を光から保護するためにアルミホイルで包みます。
  6. 384ウェルプレートを分析できるフローサイトメーターでプレートを流動します。
    注:次のワークフローは、Cytkick Max Auto Samplerを搭載したAttune NxTに適合しています。別のフローサイトメーターを使用する場合は、引き続き重要な手順に従ってください。
    1. プレートについては、最も速い流速(1,000 uL/min)で分析し、 ブーストモードを有効にします。20 μL/ウェルを取得します。各ウェル間に 1 つの混合サイクルと 1 つのすすぎサイクルを含めます。
    2. ステップ4.1.3の説明に従ってプロットを作成します。
    3. 未染色のWTチューブコントロールを実行し、ステップ4.1.3および4.1.4の説明に従って電圧を最適化します。飢餓状態の pHL チューブサンプルを実行し、ステップ 4.1 の説明に従って VL2 および BL1 電圧を最適化します。
    4. フローサイトメーターでプレートの取り込みを開始します。プレートを水平に泳動させて、飢餓状態のサンプルウェルと飢餓状態のサンプルウェルの間に大きな取り込み時間差がないようにします。プレートの取得が~1.5時間で完了することを確認します。
  7. .fcs ファイルをエクスポートし、手順 5.1 から 5.8 の説明に従ってデータを分析します。グルコース(Glc)またはグルコースなし(飢餓)で処理したサンプルの蛍光比の平均(AVG)と標準偏差(SD)を求めます。
    注:Zファクター実験のデータは、 補足表S5に記載されています。
  8. 式 (3) を使用して Z 係数20 の統計量を計算します。
    figure-protocol-3(3)

figure-protocol-4
図1:生BSFトリパノソーマのグリコソームpHをスコアリングする方法の図。 (A)グリコソームに位置するpHluorin2センサーを発現する細胞株の描写。ペルオキシソーム標的配列を含めることで、局在化を制御することができます。注:PTS-1の除去は細胞質の局在化につながり、その細胞内コンパートメントのpHの将来の分析を可能にすると予想されます。(B)センサーバリデーションアッセイの描写。略語:BSF = bloodstream form。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

注:Zファクター統計は、アッセイがHTSにどの程度適しているかを判断するために使用されます。0.5 から 1.0 の間の値は、一般に、アッセイ品質が HTS で許容できることを意味します。

結果

BSF T. bruceiにおけるグリコソームへのpHLuorin2-PTS1局在
pHluorin2-PTS1の細胞内局在を評価するために、寄生虫を免疫蛍光アッセイにかけました。グリコソーム常在タンパク質であるアルドラーゼ(TbAldolase)に対して抗血清と共局在した導入遺伝子からのシグナル(図2A)。抗TbアルドラーゼとpHluorin2-PTS1の共局在のピアソン相関係数の平均は0.895であり、pHluorin2-PTS1は主にグリコソームに局在していることが示されました。pHluorin2-PTS1がグリコソームに局在した状態で、BFグリコソームのpHの調査を進めました。

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図2:BSF Trypanosoma bruceiにおけるpHluorin2-PTS1のグリコソームへの局在 。 (A)pHluorin2-PTS1とグリコソーム常在タンパク質TbAldolaseとの共局在。BF 90-13 寄生虫に pLEWpHluorin2-PTS1 をトランスフェクションし、ドキシサイクリン (1 μg/mL) で発現を誘導しました。TbAldolaseは、抗TbAldolaselaを用いて局在化させ、続いてヤギ抗ウサギAlexa fluor 568でインキュベーションしました。ピアソンの平均相関係数は0.895(30セル)でした。(B)BSF T. bruceiにおけるpHluorin2-PTS1の較正。スケールバー = 4 μm。略語:BSF = bloodstream form。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

pHluorin2-PTS1キャリブレーション
pHの変化は、pHluorin2-PTS1の励起スペクトルを変化させます。中性pH下では、405 nmでのpHluorin2-PTS1励起は488 nmよりも大きくなります。pHが下がると、その逆になります9,21。グリコソームの相対pHをフローサイトメトリーで測定するために、405 nmレーザー(VL2チャンネル)で励起したときの発光と488 nmレーザー(BL1チャンネル)で励起したときの発光を測定し、VL2/BL1の比(蛍光比)を用いてグリコソームの相対pHを測定しました。蛍光比をpHに変換するために、イオノフォアのバリノマイシンとニゲリシン17,18を使用して細胞内およびグリコソームのpHを細胞外のpHと平衡化させ、続いてフローサイトメトリー分析を行い、蛍光比を求めました。予想通り、細胞内KdのpHがpH 6.5になると、細胞外のpHが上昇するにつれて蛍光比が増加しました(図2B)。このKdは、pHluorin29の報告されたin vitro Kdよりもわずかに低かった。興味深いことに、グルコース存在下でのBSFグリコソームのpHは~pH 8.0であり、グルコース22の存在下でのPFグリコソームよりも塩基性でした。この検量線を使用して、その後の実験で蛍光比をpHに変換しました。

グルコース飢餓によるグリコソームの酸性化
T. brucei PF寄生虫はグルコースが欠乏するとグリコソームを酸性化するが22、BSFグリコソームがグルコースにどのように反応するかは不明である。これを探索するために、PBSと10 mMグルコースでpHluorin2-PTS1を発現するBSF寄生虫を洗浄して培地を除去し、グルコースなしで細胞をPBSに再懸濁しました。この摂動に対するセンサーの応答をすぐに測定し、その後10分ごとにフローサイトメトリーで1.5時間測定しました。応答は、PBSと10 mMグルコース(飢餓状態)の細胞を比較しました。

飢餓に反応して、時間の経過とともに緩やかな穏やかな酸性化が観察され、90~90分で横ばいになりました(図3A)。このグリコソームpHの変化は統計的に有意であり(p < 0.0001)、3つの別々の実験で再現性がありました。これは、BSF細胞がグルコースが欠乏するとグリコソームを軽度の酸性化することを示唆しており、PFライフステージ9で観察された応答に類似しています。

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図3:グルコースを奪われた場合のBSF T. brucei のグリコソームの可逆的な酸性化。 (A)グルコースの非存在下(飢餓状態、青)または存在下(飢餓状態、赤)で増殖した細胞のグリコソームpH。飢餓状態の細胞は、Attune NxT フローサイトメーターでの最初の測定の 2 分前~2 分前に、グルコースなしで PBS に再懸濁しました。時間経過の生物学的複製を3回実施した。飢餓状態の寄生虫をPBSと10 mMグルコースでインキュベートしました。対応のない両側スチューデントの t検定が実行され、飢餓状態と飢餓状態の90分時点(***p = 0.0001)を比較しました。(B)グリコソームのpH変化の経時変化:飢餓状態(青)および飢餓状態(赤)のBSF寄生虫と、90分後に10 mMグルコースを再導入したBSF寄生虫(緑の点線)。時間経過の5つの生物学的複製が行われました。NS = 有意ではない (p = 0.25、対応のない両側スチューデントの t 検定)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

グルコースに応答する可逆的グリコソーム酸性化
次に、BSFグリコソームの酸性化が、細胞を飢餓状態にしてからグルコースを再導入することで可逆的かどうかを検証しました。寄生虫はグルコースの非存在下で90分間インキュベートした。次に、グルコース(10 mM)を添加し、さらに90分間、サイトメトリーでセンサー応答を測定しました(図3B)。グルコースを再導入した後、グリコソームのpHは~30分で飢餓前のレベルに戻ることが観察されました。これらの結果は、BSFグリコソームのpHが、PF寄生虫で観察されるpH応答と同様に、グルコースに応答して動的で調節可能であることを示唆しています。

ハイスループット薬物スクリーニングのためのpHluorin2アッセイの適応
グリコソームは、トリパノソーマにとって重要な代謝経路を収容しているため、トリパノソーマに不可欠な細胞小器官です。グリコソームの重要性は、グリコソームのホメオスタシス阻害剤が治療のリードとして有望である可能性を示唆しています。ここでは、グリコソームpHのアッセイをハイスループットフォーマットに適合させ、グリコソームpHの阻害剤を同定するための薬物スクリーニングへの適応を可能にしました。この応答の調節の破綻は、グリコソームに常在するタンパク質の機能に対するpHの影響が知られていることを考えると、寄生虫にとって有害である可能性があると予想しています7。

ハイスループットフォーマットを確立するために、アッセイの頑健性をスコアリングしました。これを完了するために、pHluorin2-PTS1を発現するように誘導された寄生虫を、5 mMグルコース(高コントロール)またはグルコースなし(低コントロール)のいずれかで384ウェルマイクロタイタープレートに播種し、室温で90分間インキュベートしました。その後、プレートをフローサイトメトリーで分析しました。 図4に示すように、反復測定間のばらつきは小さく、高コントロールと低コントロールは十分に分離されており、許容可能なZファクターは0.645でした。0.5>値のアッセイは、一般に、ハイスループットスクリーニングキャンペーンへの適応に十分頑健であると考えられています。ここでの成功を踏まえて、このセンサーとアプローチは、将来のハイスループット薬物スクリーニングに使用されると予想されます。

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図4:pHluorin2-PTS1センサー搭載BSFの将来のHTSキャンペーンへの適合性を評価するためのアッセイ。 細胞をグルコース(高コントロール、赤、5 mMグルコース)またはヘキソースなし(低コントロール、青、追加のグルコースなし)で90分間インキュベートしました。計算された Z 係数は 0.645 でした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図S1:pHluorin2-PTS1遺伝子を誘導可能な T. brucei 発現ベクターpLEW100v5にクローニングする。 (A)両ベクターをHindIIIおよびBamHIで二重制限消化し、精製した。pHluorin2-PTS1遺伝子断片を、T4 DNAリガーゼを用いてpLEW100v5にライゲーションした。(b)pLEW100-pHlourin2-PTS1。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:pLEWpHluorin2-PTS1をトランスフェクションしたTbAldolase BF 90-13寄生虫とのpHLの共局在。 発現はドキシサイクリン(1 μg/mL)で誘導しました。Tbアルドラーゼは、抗Tbアルドラーゼ血清(ブロック中で1:500希釈)を用いて局在化させ、その後、ヤギおよびウサギAlexa fluor 568とインキュベーションしました。ピアソンの平均相関係数は0.895(30セル)でした。スケールバー = 10 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 S3:例として pH 8 キャリブレーションバッファーサンプルを使用した BSF pHL センサー細胞株のキャリブレーションの代表的なゲーティングおよびドットプロット。 サンプルを生存率色素PIで染色し、pHが生存率に及ぼす影響をYL2-Hチャネルを用いて評価しましたが、ゲーティングスキームでは生存率は使用しませんでした。FSC-AとSSC-Aのワイドゲートは、キャリブレーションで生細胞と死細胞の両方を使用したため、細胞のゲートに使用しました。細胞をゲーティングした後、単一細胞(シングレット)をFSC-AとFSC-Hを用いてゲーティングしました。最後に、BL1-HおよびVL2-HチャネルのpHLの蛍光イベントにストリンジェントゲートを使用しました。略語:BSF =血流形態;PI = ヨウ化プロピジウム;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-H = 前方散乱光ピーク高さ このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:グルコース飢餓および加算時間経過アッセイの代表的なゲーティングおよびドットプロット。 例として、飢餓状態の 0 分間のサンプルを使用します。生細胞は、PIを使用したため、YL2-Hチャネルでゲーティングしました。細胞は、FSC-AとSSC-Aを使用してゲーティングし、破片や凝集体を除外しました。シングレットは、FSC-A と FSC-H を使用してゲートしました。チャネルBL1-HおよびVL2-Hは、pHL+イベントのゲートに使用されました。WTコントロールを使用して、このゲートを設定する際に自家蛍光イベントを除外しました。略語:PI =ヨウ化プロピジウム;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱光-ピーク面積。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:フローサイトメトリーに使用されるチャネルおよび一般名。 チャンネル名、共通名、および使用するレーザーと発光フィルターが提供されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:異なるpH緩衝液中のニゲリシンおよびバリノマイシンを使用したpHLキャリブレーションの結果。 この表には、.fcs ファイルの FlowJo 分析からエクスポートされた統計が含まれています。これらの値を使用して、 図 2 に示すように、pHL をキャリブレーションするための蛍光比(VL2-H/BL1-H)を求めました。これらの pH キャリブレーション結果は、グルコース飢餓および加算時間経過実験の pH の補間にも使用されました(図 3)。品質管理には、合計イベント数、pHL+ 数、PI- (%)、PI+ (%)、および pHL+ (%) の統計を使用しました。各生物学的複製のデータは別のタブにあり、「Summarized Results」というラベルの付いたタブには、各 pH 処理および複製の蛍光比が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S3: 図 3A に示す BSF pHL グルコース飢餓時間経過アッセイの分析データ。 この表には、FlowJoソフトウェアで分析された.fcsファイルからエクスポートされた統計が含まれています。蛍光比は、VL2-Hの中央値とBL1-Hの中央値(どちらもpHL+集団)の比を取ることによって計算しました。これらの比率は、「集計結果」というラベルの付いたタブにまとめられました。PI-(%)を使用して、グルコース飢餓が生存率に与える経時的な影響を判断しました。総計数とpHL+計数を品質管理に使用しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S4: 図 3B に示した BSF pHL グルコース アドバック タイムコース アッセイの分析データ。 この表には、FlowJoソフトウェアで分析された.fcsファイルからエクスポートされた統計が含まれています。pHL+ 中央値 VL2/BL1 値は、Excel の pHL+ 中央値 VL2-H および BL1-H から計算されました。その他の統計は品質管理に使用されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S5:pHLを使用したZ-Factor試験のハイスループットスクリーニングアッセイのFlowJo分析から得られた結果データ。 「0 mM グルコース」(低)および「5 mM グルコース」(高)とラベル付けされたタブには、それぞれ 0 mM または 5 mM グルコースで処理した細胞のデータが含まれています。これらの蛍光比を 図4に示します。「Pooled Analysis」タブでは、両方の処理の蛍光比をコンパイルし、それぞれのサンプルの平均と標準偏差(SD)を計算しました。Z 係数の統計量は、式 3 を使用して計算しました。平均高/低の比率を計算して、平均の分離を測定しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

アフリカのトリパノソーマにおける環境認識と応答機構は十分に理解されていない。栄養素の利用可能性の変化は、グリコソームの酸性化など、寄生虫の多様な応答を引き起こすことが知られています。ここでは、遺伝性タンパク質センサーpHluorin2とフローサイトメトリーを用いて、生細胞の環境摂動に対するグリコソームのpH応答を研究する方法について説明しました。

センサーの使用には、いくつかの重要なステップがあります。第一に、導入遺伝子を発現するトランスフェクション寄生虫の特性評価は、発現に細胞間変動がある可能性があるため、重要です。一部の導入遺伝子の発現レベルは、時間の経過とともに低下する可能性があります。これまでのところ、pHluorin2担持細胞では観察されていませんが、センサーの応答性が大きく変動する場合(例えば、誘導後、センサーシグナルが頑健でない場合)、集団の一部のメンバーが他のメンバーよりも高いレベルでタンパク質を発現する可能性があるため、培養物のクローンアウトが必要になる場合があります。あるいは、再形質転換と選択は、より高い(おそらく一過性の)発現を有する新しい細胞株の作製に有用であることが証明されています。再トランスフェクションが必要な場合は、目的の導入遺伝子の発現が微妙な成長の欠点となり、時間の経過とともに集団内の高発現因子が失われる可能性があるため、個々の株をクローニングすることをお勧めします。

さらに、寄生虫の生存率を、アッセイ中および培養物の日常的な維持管理中にモニタリングすることが不可欠です。この目的のためにPIまたはチアゾールレッドのいずれかをアッセイ中に含めており、これらのレポーターは、データが生細胞内の応答のみを反映していることを保証します。特に大規模なアッセイ(HTSタイプのアッセイなど)を開始する前に、通常の培養中の細胞倍加時間を一定にすることで、増殖していない細胞でアッセイを開始することに対する懸念が抑制され、高低のコントロールシグナルが悪影響を及ぼし、スクリーニングの全体的な頑健性に影響を与える可能性があります。

ここで説明したグリコソームpH測定法は、頑健で高感度です。ただし、このアプローチには限界があります。まず、マイクロタイタープレートを受け入れることができるサンプラーなど、適切な機能を備えたサイトメーターへのアクセスが必要です。レシオメトリックデータは蛍光顕微鏡で収集できますが、その方法で分析できるサンプルの数が限られているため、スクリーニング(および経時変化ベースのアッセイ)などのアプローチの有用性が制限されます。

2つ目の潜在的な制限は、アッセイにバイオセーフティー上の懸念のある薬剤が含まれていることです。作業に必要な器具を収容する中核施設では、機器に生きた寄生虫が入居できない可能性があります。これらの制限は、トランスジェニックトリパノソーマの生成と維持に関する技術的な課題とともに、寄生虫生物学と細胞解析の適切な専門知識を持つグループ間の協力によって克服できます。

ここで説明する研究は、アフリカのトリパノソーマにおけるグリコソームpHセンサーの使用に焦点を当てていますが、このツールは他のキネトプラスチド寄生虫での使用にも応用できる可能性があります。細胞小器官の酸性化がリーシュマニア属の生物学にどのような役割を果たしているかは不明ですが。またはトリパノソーマ・クルジ、寄生虫特異的発現ベクターが利用可能であり、グリコソーム輸入機構が生物で類似していることから、pHLuorin2-PTS1が細胞内で導入遺伝子として発現する可能性はあるのでしょうか5,23,24。

センサー担持細胞の応用例としては、グリコソームを酸性化する細胞の能力を変化させる低分子の同定が考えられます。pHの変化は、アフリカのトリパノソーマ7の病原性ライフサイクル段階に不可欠なグリコソーム常在タンパク質であるヘキソキナーゼの調節の可能な手段であることがわかっているため、これらは寄生虫に有害である可能性が高い。ここで説明するアッセイは、ハイスループットになるように調整されており(図 4)、この活性に関する大規模な化学物質コレクションの調査が可能です。

要約すると、このツールは、寄生虫特異的な細胞小器官の動的応答に関与するメカニズムを解剖する機会を提供します。センサーラインを順遺伝学および逆遺伝学と組み合わせて使用することで、固有の寄生虫特異的経路が特定される可能性があります。さらに、センサーラインは、応答の低分子阻害剤を同定する機会を提供し、新しい創薬標的発見への扉を開きます。

開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

pHluorin2-PTS1 は、Twist Bioscience 社によって pLEW100v5 にクローニングされ、高コピークローニングベクターでコンストラクトが提供されました。pLEW100v5はジョージ・クロス博士からの贈り物でした。 T. brucei アルドラーゼに対して提起された抗血清は、要求に応じてクレムソン大学のメレディス T. モリス博士から入手できます。JCMとKACの研究所の研究の一部は、米国国立衛生研究所(R01AI156382)からの助成金によって支援されました。SSP は NIH 3R01AI156382 でサポートされました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 mL 組織培養フラスコ (未処理、滅菌)VWR10861-572
75 cm2 組織培養フラスコ (未処理、滅菌)Corning431464U
80 µL型平底384ウェルプレートBrandTech 781620
AmaxaヒトT細胞核フェクター キットLonzaVPA-1002
Attune NxT Flow Cytometerinvitrogen by Thermo Fisher ScientificA24858FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plateMillipore SigmaBR781662
Coloc 2 plugin of ImageJhttps://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Samplerinvitrogen by Thermo Fisher ScientificA42973
CytoFLEX フローサイトメーターベックマン・コールター
電子顕微鏡 Sciences 16% パラホルムアルデヒド水溶液、EM グレード、10 mL アンプルフィッシャー・サイエンティフィ50-980-487
GraphPad プリズム統計ソフトウェア
ニゲリシン (ナトリウム塩)ケイマン・ケミカル11437
ヌクレオフェクター 2bロンザ生産終了製品
OP2 リキッドハンドラーOP2
ポリ-L-リジン、0.1% (w/v) in H2OSigma Life ScienceCAS:25988-63-0HTSアッセイ用ピペッティングロボット
チアゾールレッド (TO-PRO-3)ビオチウム#40087このブランドのプレートを検出し、CytKick Max Autoで使用できるように、カスタムアクリルプレートスタンドを機械加工しましたサンプラー
valinomycinCayman Chemical10009152HTSアッセイ用ピペッティングロボット
      pH校正用
      pH校正用
ック

参考文献

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