アフリカのトリパノソーマの血流型のグリコソームの環境的手がかりにpHがどのように応答するかを研究する方法について説明します。このアプローチでは、pH感受性遺伝性タンパク質センサーとフローサイトメトリーを組み合わせて、経時アッセイとハイスループットスクリーニングフォーマットの両方でpHダイナミクスを測定します。
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方法論記事
生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
グルコース代謝は、アフリカのトリパノソーマ( Trypanosoma brucei)にとって、寄生虫発生の必須代謝プロセスおよび調節因子として重要です。環境中のグルコースレベルが変化したときに生じる細胞応答については、ほとんど知られていません。血流寄生虫とプロサイクリック型(昆虫期)寄生虫の両方で、グリコソームは解糖の大部分を収容しています。これらの細胞小器官は、グルコース欠乏に応答して急速に酸性化され、その結果、ヘキソキナーゼなどの解糖酵素のアロステリック調節が起こる可能性があります。以前の研究では、pH測定に使用する化学プローブの局所化が困難であり、他のアプリケーションでの有用性が制限されていました。
この論文では、遺伝性タンパク質pHバイオセンサーであるグリコソーム局在性pHorin2を発現する寄生虫の開発と使用について説明します。pHluorin2 はレシオメトリック pH バリアントであり、395 nm で pH(酸)依存的な励起の低下を示すと同時に、475 nm での励起の増加を示します。トランスジェニック寄生虫は、pHluorin2オープンリーディングフレームをトリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングすることによって生成され、どちらのライフサイクルステージでも誘導可能なタンパク質発現を可能にしました。免疫蛍光法を用いて、pHluorin2バイオセンサーのグリコソーム局在を確認し、バイオセンサーの局在をグリコソーム常在タンパク質アルドラーゼと比較しました。センサーの応答性は、以前にフルオレセインベースのpHセンサーのキャリブレーションに使用したアプローチである、pH 4 から 8 の範囲の一連のバッファーで細胞をインキュベートすることにより、異なる pH レベルでキャリブレーションしました。次に、フローサイトメトリーを用いて405 nmおよび488 nmのpHluorin2蛍光を測定し、グリコソームのpHを測定しました。PF寄生虫のグリコソーム酸性化の引き金として知られているグルコース欠乏に反応してpHを経時的にモニタリングし、生きたトランスジェニックpHluorin2発現寄生虫の性能を検証しました。このツールは、ハイスループット薬物スクリーニングに使用される可能性など、さまざまな用途が考えられます。グリコソームのpHだけでなく、このセンサーを他のオルガネラに適合させたり、他のトリパノソーマチドに使用したりして、生細胞環境におけるpHダイナミクスを理解することができます。
概要
寄生キネトプラスチドは、ほとんどの生物と同様に、中枢炭素代謝の基本的な構成要素としてグルコースに依存しています。このグループには、アフリカのトリパノソーマ、トリパノソーマ・ブルーセイなどの医学的に重要な生物が含まれます。アメリカのトリパノソーマ、T. cruzi; リーシュマニア属の寄生虫。グルコース代謝は、病原性ライフサイクル段階における寄生虫の増殖に不可欠です。例えば、グルコースが奪われると、アフリカトリパノソーマの血流型(BSF)は急速に死滅します。特に、解糖系は、感染のこの段階でATPの唯一の供給源として機能します1。リーシュマニア寄生虫も同様に宿主のグルコースに依存しており、宿主マクロファージに存在するアマスティゴートのライフサイクルステージは、成長のためにこの炭素源に依存しています2。
これらの寄生虫は、異なる昆虫媒介者を含む異なるライフスタイルを持っていますが、ブドウ糖への反応と消費方法には多くの共通点があります。例えば、これらの寄生虫は、ほとんどの解糖酵素をグリコソームと呼ばれる修飾ペルオキシソームに局在化させます。このキネトプラスト特異的細胞小器官は、保存された生合成メカニズムと形態に基づいて、哺乳類のペルオキシソームに関連しています3,4,5,6
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プロトコル
単型寄生虫株である T. brucei brucei 90-13 BSFトリパノソーマは、バイオセーフティレベル2の施設で取り扱うべきリスクグループ2の生物とされているため、安全性への配慮が必要です。
1. トリパノソーマの培養とトランスフェクション
- HMI-9培地中の培養T. brucei brucei 90-13 BSFトリパノソーマに、5%CO2、10%、37°Cで10%熱不活化FBSおよび10%Nu-Serumを添加した。
注:培養を健康に保つには、細胞密度を2〜104 〜5〜10×6 細胞/mL×維持してください。 - pHluorin2-PTS1のpLEW100v5へのクローニング
- pHluorin2オープンリーディングフレームを商業的に合成して、2つのグリシンリンカーをコードする3'伸長とそれに続くPTS1局在タグであるトリペプチドAKLを有する遺伝子を産生する。
- 制限酵素消化により、このコンストラクトを誘導性トリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングします。pHluorin2-PTS1 と pLEW100v5 を含むクローニングベクターを、HindIII と BamHI
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結果
BSF T. bruceiにおけるグリコソームへのpHLuorin2-PTS1局在
pHluorin2-PTS1の細胞内局在を評価するために、寄生虫を免疫蛍光アッセイにかけました。グリコソーム常在タンパク質であるアルドラーゼ(TbAldolase)に対して抗血清と共局在した導入遺伝子からのシグナル(図2A)。抗TbアルドラーゼとpHluorin2-PTS1の共局在のピアソン相関係数の平均は0.895であり、pHluorin2-PTS1は主にグリコソームに局在していることが示されました。pHluorin2-PTS1がグリコソームに局在した状態で、BFグリコソームのpHの調査を進めました。
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ディスカッション
アフリカのトリパノソーマにおける環境認識と応答機構は十分に理解されていない。栄養素の利用可能性の変化は、グリコソームの酸性化など、寄生虫の多様な応答を引き起こすことが知られています。ここでは、遺伝性タンパク質センサーpHluorin2とフローサイトメトリーを用いて、生細胞の環境摂動に対するグリコソームのpH応答を研究する方法について説明しました。
センサーの使用には、いくつかの重要なステップがあります。第一に、導入遺伝子を発現するトランスフェクション寄生虫の特性評価は、発現に細胞間変動がある可能性があるため、重要です。一部の導入遺伝子の発現レベルは、時間の経過とともに低下する可能性があります。これまでのところ、pHluorin2担持細胞では観察されていませんが、センサーの応答性が大きく変動する場合(例えば、誘導後、センサーシグナルが頑健でない場合)、集団の一部のメンバーが他のメンバーよりも高いレベルでタンパク質を発現する可能性があるため、培養物のクローンアウトが必要になる場合があります。あるいは、再形質転換と選択は、より高い(おそらく一過性の)発現を有する新しい細胞株の作製に有用で.......
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開示事項
著者は利益相反がないことを宣言します。
謝辞
pHluorin2-PTS1 は、Twist Bioscience 社によって pLEW100v5 にクローニングされ、高コピークローニングベクターでコンストラクトが提供されました。pLEW100v5はジョージ・クロス博士からの贈り物でした。 T. brucei アルドラーゼに対して提起された抗血清は、要求に応じてクレムソン大学のメレディス T. モリス博士から入手できます。JCMとKACの研究所の研究の一部は、米国国立衛生研究所(R01AI156382)からの助成金によって支援されました。SSP は NIH 3R01AI156382 でサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 50 mL 組織培養フラスコ (未処理、滅菌) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 組織培養フラスコ (未処理、滅菌) | Corning | 431464U | |
| 80 µL型平底384ウェルプレート | BrandTech | 781620 | |
| AmaxaヒトT細胞核フェクター キット | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX フローサイトメーター | ベックマン・コールター | ||
| 電子顕微鏡 Sciences 16% パラホルムアルデヒド水溶液、EM グレード、10 mL アンプル | フィッシャー・サイエンティフィ | 50-980-487 | |
| GraphPad プリズム | 統計ソフトウェア | ||
| ニゲリシン (ナトリウム塩) | ケイマン・ケミカル | 11437 | |
| ヌクレオフェクター 2b | ロンザ | 生産終了製品 | |
| OP2 リキッドハンドラー | OP2 | ||
| ポリ-L-リジン、0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | HTSアッセイ用ピペッティングロボット |
| チアゾールレッド (TO-PRO-3) | ビオチウム | #40087 | このブランドのプレートを検出し、CytKick Max Autoで使用できるように、カスタムアクリルプレートスタンドを機械加工しましたサンプラー |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | HTSアッセイ用ピペッティングロボット |
| pH校正用 | |||
| pH校正用 |
参考文献
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
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再版と許可
