クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

Summary

このプロトコールでは、高分子のクライオ電子顕微鏡マップで低分子リガンドをモデル化するために利用可能なツールを紹介します。

Abstract

高分子複合体におけるタンパク質-リガンド相互作用の解明は、分子メカニズム、その根底にある生物学的プロセス、および医薬品開発を理解するために重要です。近年、極低温試料電子顕微鏡(クライオEM)は、高分子の構造を決定し、原子に近い分解能でリガンド結合のモードを調査するための強力な技術として浮上しています。クライオ電子顕微鏡マップにおける非タンパク質分子の同定とモデリングは、対象分子全体の異方性分解能とデータ内在のノイズにより、しばしば困難を伴います。この記事では、リガンドの同定、モデル構築、および選択した高分子を使用した原子座標の精緻化に現在使用されているさまざまなソフトウェアと方法を紹介します。エノラーゼ酵素で示されているように、リガンドの存在を特定する最も簡単な方法の1つは、リガンドがある場合とない場合で得られた2つのマップを減算することです。リガンドの余分な密度は、より高いしきい値でも差分マップで目立つ可能性があります。代謝型グルタミン酸受容体mGlu₅の場合に示されているように、このような単純な差分マップを生成できない場合があります。最近導入されたFo-Fcオミットマップを導出する方法は、リガンドの存在を検証および実証するためのツールとして役立ちます。最後に、よく研究されているβ-ガラクトシダーゼを例に、クライオ電子顕微鏡マップのリガンドと溶媒分子のモデリングに対する分解能の影響を解析し、クライオ電子顕微鏡を創薬にどのように使用できるかについての展望を示します。

Introduction

細胞は、無数の化学反応を同時に独立して行うことでその機能を達成し、それぞれが環境の合図に応答して生存と適応性を確保するために細心の注意を払って制御されています。これは分子認識によって達成され、生体分子、特にタンパク質が他の高分子や小分子、またはリガンドと一過性または安定な複合体を形成することを可能にします¹。したがって、タンパク質-リガンド相互作用は、タンパク質の発現と活性の調節、酵素による基質と補因子の認識、細胞がシグナルを知覚して中継する方法など、生物学のすべてのプロセスの基本です^1,2。タンパク質-リガンド複合体の速度論的、熱力学的、および構造的特性をよりよく理解することで、リガンド相互作用の分子基盤が明らかになり、薬物相互作用と特異性を最適化することで合理的な薬物設計が容易になります。タンパク質-リガンド相互作用を研究するための経済的で迅速なアプローチは、多様な低分子を仮想的にスクリーニングし、これらのリガンドの標的タンパク質への結合モードと親和性を予測する計算方法である分子ドッキングを使用することです³。しかし、X線回折(XRD)、核磁気共鳴(NMR)、またはクライオ電子顕微鏡(クライオEM)によって決定された高分解能構造からの実験的証拠は、そのような予測に不可欠な証拠を提供し、特定のターゲットに対するより新しくより効果的な活性化因子または阻害剤の開発に役立ちます。この記事では、この手法が一般的に呼ばれているように、「cryoEM」という略語を使用しています。しかし、正しい命名法の選択については議論が続いており、最近では、サンプルが極低温にあり、電子で画像化されていることを示すために、cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)という用語が提案^{されています4。}同様に、クライオ電子顕微鏡から導出されたマップは、電子ポテンシャル、静電ポテンシャル、またはクーロンポテンシャルと呼ばれてきましたが、ここでは簡単にするために、クライオ電子顕微鏡マップ5,6,7,8,9,10を使用します。

XRDは、タンパク質-リガンド複合体の高分解能構造決定におけるゴールドスタンダード技術でしたが、過去数年間で電子顕微鏡データベース(EMDB)^12,13に蓄積されたクーロン電位マップまたはクライオEMマップが急増したことが示すように、分解能革命後の¹¹クライオEMは勢いを増しています¹⁴。サンプル調製、イメージング、およびデータ処理方法の進歩により、クライオ電子顕微鏡を使用したタンパク質データバンク(PDB)¹⁴の堆積数は、2010年から2020年の間に0.7%から17%に増加し、2020年に報告された構造の約50%が3.5 Å以上の分解能で決定されました^15,16。CryoEMは、柔軟な非結晶性の生体高分子、特に膜タンパク質や多タンパク質複合体を原子に近い分解能で研究し、結晶化のプロセスを克服し、XRDによる高分解能構造決定に必要な十分に回折する結晶を得ることができるため、製薬業界を含む構造生物学コミュニティで急速に採用されています。

クライオ電子顕微鏡マップにおけるリガンドの正確なモデリングは、分子レベルでのタンパク質-リガンド複合体の設計図として機能するため、最も重要です。X線結晶構造解析で使用されるいくつかの自動化された配位子構築ツールは、配位子を電子密度^17,18,19,20に適合または構築するために、配位子密度の形状とトポロジーに依存します。それにもかかわらず、解像度が 3 Å より低い場合、これらのアプローチは、認識と構築のために依存するトポロジカルな特徴が定義されなくなるため、望ましくない結果を生み出す傾向があります。多くの場合、これらの方法は、リガンドをクライオ電子顕微鏡マップに正確にモデル化するのに効果的ではないことが証明されています。これは、これらのマップが低から中程度の分解能の範囲(通常は3.5 Å-5 Ź⁷)で決定されているためです。

クライオ電子顕微鏡によるタンパク質-リガンド複合体の3D構造決定の最初のステップは、リガンドをタンパク質と共精製するか(リガンドがタンパク質に対して高い結合親和性を持つ場合)、またはグリッド調製前にタンパク質溶液をリガンドと特定の期間インキュベートすることです。その後、少量のサンプルをプラズマ洗浄した穴質TEMグリッド上に配置し、続いて液体エタン中で瞬間凍結し、最終的にクライオTEMでイメージングします。数十万から数百万の個々の粒子からの2D投影画像を平均化して、高分子の3次元(3D)クーロン電位マップを再構築します。これらのマップでリガンドと溶媒分子を同定し、モデル化することは、マップ全体の異方性分解能(すなわち、高分子間で分解能が均一ではない)、リガンドが結合している領域の柔軟性、およびデータ内のノイズのために、多くの場合、大きな課題を提起します。XRD用に開発されたモデリング、改良、および視覚化ツールの多くは、現在、同じ目的でクライオEMでの使用に適応されています18,19,20,21。この記事では、リガンドの同定、モデルの構築、クライオEMから得られる座標の改良に現在使用されているさまざまな方法とソフトウェアの概要を示します。特定のタンパク質-リガンド複合体を用いたリガンドのモデリングに関与するプロセスを、さまざまな分解能と複雑さで説明するための段階的なプロトコルが提供されています。

クライオ電子顕微鏡マップでリガンドをモデル化する最初のステップは、マップ内のリガンド密度(非タンパク質)の同定です。リガンド結合がタンパク質の立体配座変化を誘発しない場合、タンパク質-リガンド複合体とアポタンパク質との間の単純な差分マップを計算すると、本質的に余分な密度の領域が強調表示され、リガンドの存在が示唆されます。このような違いは、2つのマップが必要なだけなのですぐに観察でき、3Dリファインメントのプロセス中の中間マップでも、リガンドが存在するかどうかを確認するために使用できます。さらに、分解能が十分に高い(<3.0 Å)場合、差分マップは、水分子の位置や、リガンドおよびタンパク質残基と相互作用するイオンに関する洞察も提供できます。

アポタンパク質マップがない場合、Servalcat²²を使用することが可能になり、これはスタンドアロンツールとして利用可能であり、Refmacリファインメントの一部としてCCP-EMソフトウェアスイート^23,24に統合され、CCP4 8.0リリース^25,26でも統合されています。Servalcatは、シャープ化されていないハーフマップとアポタンパク質モデルを入力として使用して、FSC加重差(Fo-Fc)マップの計算を可能にします。Fo-Fc 省略マップは、実験マップ(Fo)とモデルから導出されたマップ(Fc)との間の不均衡を表します。モデルにリガンドがない場合、Fo-Fcマップの正の密度が実験EMマップと重なると、通常、リガンドの存在を示唆します。ここでの仮定は、タンパク質鎖がマップによく適合しており、残りの正の密度がリガンドの位置を示すことです。ただし、正の密度がモデリングの不正確さ(タンパク質側鎖の回転子が間違っているなど)に起因するかどうかを細心の注意を払って調べることが重要です。

2番目のステップでは、利用可能な化学情報から明確に定義された形状を持つリガンドのデカルト座標ファイルを取得または作成します。CCP4モノマーライブラリにすでに含まれている標準配位子(ATPやNADP⁺など)は、モノマーアクセッションコードを介して座標ファイルとジオメトリファイルを取得することで、リファインに使用できます。ただし、不明または非標準の配位子については、ジオメトリファイルを作成するためのさまざまなツールを使用できます。例としては、Phenix²⁸のeLBOW²⁷(電子リガンドビルダーおよび最適化ワークベンチ)、Coot²⁹の組み込みツールであるLidia、JLigand/ACEDRG^30,31、CCP-EM^23,24、Schrodingerスイート内のGlideのLigprep^32-aモジュールなどがあります。次に、リガンド座標ファイルは、実験的なクライオ電子顕微鏡マップとCootの差分マップの両方によって導かれて、密度に適合します。これに続いて、Phenix²⁸ での実空間の改良、または Refmac³³ での相互改良が行われます。Linuxワークステーション、または優れたグラフィックカードと上記のソフトウェアを搭載したラップトップが必要です。これらのプログラムのほとんどは、さまざまなスイートに含まれています。CCP-EM²⁴ と Phenix²⁸ は、アカデミック ユーザーが無料で利用でき、Coot、Refmac5 ^33,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine など、この記事で使用されているさまざまなツールが含まれています。同様に、Chimera³⁷ と ChimeraX³⁸ は、アカデミック ユーザーに無料ライセンスを提供します。

Protocol

1. 結核菌由来エノラーゼにおけるホスホエノールピルビン酸(PEP)のモデリング

1. PEP-エノラーゼ複合体のクライオEMマップにおけるリガンド密度の同定
   1. EMDBの追加データから、apo-enolaseのシャープ化されていないハーフマップ(emd_30988_additional_1.mapおよびemd_30988_additional_2.map)をダウンロードします( 資料表を参照)。
   2. ChimeraX を開きます ( 材料の表を参照)。apo-enolase のハーフマップを開くには、ツールバーから Open をクリックし、ファイル名を選択します。コマンドラインで vop add #1 #2 と入力して、両方のハーフマップを結合し、apo-enolaseのシャープ化されていないマップを取得します。
      注:#1と#2は、ステップ1.1.1で述べたように、アポエノラーゼ酵素の2つのハーフマップを示しています。
   3. rename #3 Apo-enolase-unsharpened-mapと入力して、結合されたマップの名前(ChimeraXマップID:#3)を変更します。モデルパネルからマップをグレーに色付けします。このマップは、エノラーゼが溶液中で D4 対称性を持つ八量体であることを示しています。
   4. 次のハーフマップemd_30989_additional_1.map(マップID:4)とemd_30989_additional_2.map(マップID:5)を使用して手順1.1.1-1.1.3を繰り返し、PEP-enolase-unsharpened-map(マップID:#6)を取得します。
   5. 差分マップを計算するには、まず、ChimeraXのマップパネル(ツールバー)のFit(マップインマップ)をクリックして、ステップ1.1.3とステップ1.1.4のPEP-エノラーゼとアポエノラーゼの非シャープンマップ)を互いにフィットさせます。
      注: 2 つのマップ間では正規化は行われません。場合によっては、マップを同じ縮尺にするために正規化が必要になることがあります。
   6. コマンドラインで vop subtract #6 #3 と入力して、apo-enolaseマップからPEP-enolaseマップを減算します。
      注:#6 = PEP-エノラーゼの未鮮明なマップ、#3 = Apo-エノラーゼの未鮮明なマップ。
   7. 減算されたマップ(マップID:7)を緑色で着色し、正の密度を示します(X線結晶構造解析の規則による)³⁹。
   8. Protein Data Bank (PDB) から M. tuberculosis 八量体エノラーゼ (PDB: 7e4x) の座標をダウンロードし、ツールバーの open をクリックして 、ファイル名を選択します。
   9. コマンド ラインに 「rename #8 Apo_enolase.pdb 」と入力して、モデルの名前を 7e4x.pdb に変更します。#8 は ChimeraX の Apo_enolase.pdb を示します。
   10. モデルパネルからモデルを選択します。ツールバーの「Right Mouse」をクリックします。Move moleculeをクリックして、PEP-エノラーゼマップ(#6)の近くにモデルを配置し、マップに対してモデルを位置合わせします。このモデルを PEP-enolase-unsharpened-map に当てはめるには、コマンドラインで #6 に fit #8 と入力します。ここでは、マップには 6 の番号が付けられ、モデルには 8 の番号が付けられています。
       注: 場合によっては、ChimeraX のローカル フィットがモデルを整列させるのに十分でない場合があります。このような場合、Phenixでグローバルフィッティングの追加ステップ(DockinMap、 マテリアルの表を参照)を実行できます。
   11. コマンドラインに save Apo-enolase.pdb #8 と入力して、フィットモデルを保存します。
2. PEP-エノラーゼ複合体のB因子シャープ化クライオEMマップにおけるPEPのモデリングと改良
   1. ターミナルから「coot」( 資料の表を参照)を開くには、「 ./Coot &」と入力します。
   2. 「ファイル」>「開いている座標」の「Apo-enolase.pdb」をクリックして、「Apo-enolase.pdb」を表示します。座標ファイルは結合(原子による色)で表示されます。
   3. EMDBからPEP結合エノラーゼシャープマップ、つまりemd_30989.mapをダウンロードします。[ ファイル] > [マップを開く] > emd_30989.map をクリックして同じものを表示します。しきい値を 7.00 σ に設定するには、マウスの中央ボタンをスクロールします。
   4. モデル化されていないブロブを見つけるには 、[Validate > Unmodeled blobs] > [Find Blobs] をクリックします。
   5. エノラーゼモデルの活性部位残基Ser 42、Lys-386、およびArg-364の近くに、モデル化されていないリガンド密度を見つけます。
   6. CootモノマーライブラリからPEPモノマーモデルファイルを取得するには 、File > Get Monomer をクリックし、3文字コードとして PEP を入力します。
   7. サイドバーメニューのRotate/Translate- Zone/Chain/Moleculeオプションを使用して、PEP分子を密度に移動します。Cootの実空間リファインメントを使用して、PEP分子を密度に合わせるには、サイドバーメニューのReal Space Refine Zoneをクリックします。エディットタブのmerge moleculeオプションを使用して、フィットしたリガンドをApo-enolase.pdbとマージします。モデルを PEP-Enolase.pdb として保存します。
      注: リガンドを使用することもできます>ジグルフィットリガンド オプションを使用して、リガンドを適合させることもできます。
   8. 座標ファイル内の残りのモノマーに配位子を追加するには、[ NCS Tools > NCS ligands]>[Calculate]をクリックします。Find NCS-Related Ligandsという名前の別のウィンドウが表示されます。Protein with NCSオプションでは、座標ファイル Apo-enolase.pdb を選択し、NCS Master Chainとして Chain ID A を選択します。
      1. リガンドを含む分子は、座標ファイルとして Apo-enolase.pdb を選択し、 Chain ID、J、Residue Number 1 to 1を選択します。 「Find Candidate Positions」をクリックします。フィットリガンドという名前のウィンドウが表示され、候補ポジションのリストが表示されます。個々の候補リガンドをクリックしてフィッティングを評価し、フィットを視覚的に分析します。
         注:Servalcat/Refmacでは、モノマーモデルのみを提供でき、再構成で使用される対称性を指定して拡張モデルを取得できます。
   9. 溶媒分子の追加の密度も、配位子の近くで観察されました。種々の同族体由来のエノラーゼの高分解能結晶構造は、2つのMg²⁺イオンの存在を示唆している^40,41、これはおそらく反応中間体の負電荷を安定化させる。活性部位密度の2つのMg²⁺イオンをモデル化するには、ポインタの位置にある「place atom」をクリックし、「Pointer Atom type」リストから「MG」を選択します。
      注:ボンドの形状と距離は、金属イオンを選択するためのガイドとして使用できます。タンパク質残基の酸素原子に結合したMg²⁺ の場合、結合距離は2.1 Å -2.4 Åの間で変化し、八面体の形状をしています。ただし、低解像度のマップの場合、座標球体は不完全であることが多く、解像度の制限により距離も異なる場合があります。
   10. ステップ1.2.8を繰り返して、対称性に関連するモノマーにMg²⁺ イオンを添加します。
   11. 「File」>「Save coordinates」をクリックし、「Select Filename >」をクリックし>Enolase+PEP+Mg.pdbと入力して、モデルを保存します。
   12. Phenix GUIを開きます(資料の表を参照)。既定のパラメーターを使用して、Enolase+PEP+Mg.pdb と emd_30989.map をそれぞれ入力モデルとマップとして、実空間のリファインメント ジョブを実行します。この手順は、マップモデルとの良好な適合とジオメトリを実現するために、Coot を使用して繰り返し実行されます。
       注:シャープ化されていない差分マップは、図のようにリガンドの存在を示すために使用されます。モデリングの目的で、Bファクターシャープマップが使用されており、推奨されます。Bファクターシャープマップは、シャープ化されていないマップとは対照的に、デモンストレーション目的で差分マップを計算するためにも使用できます。ただし、リガンドが結合している領域で解像度が低い場合、マップ全体をシャープにするために使用される単一のBファクターでは、リガンド密度が明確に示されない可能性があります。
3. モデル化されたリガンドの可視化とフィギュア生成
   1. PyMOL⁴² (材料の表を参照) で最終的な Phenix リファインメント ジョブからリファインされた Enolase+PEP+Mg モデルを開くには、File > Open をクリックしてファイル名を選択します。
   2. emd-30989.map (PEP バインドのシャープ マップ) を読み込むには、[ファイル] > [開く] をクリックし、ファイル名を選択します。
   3. マップの名前を PEP-sharpened に変更するには、emd_30989 オブジェクトに対して [名前の変更 ] アクションをクリックし>「 PEP-sharpened」と入力します。
      注:ほとんどの場合、エノラーゼなど、pymolでマップを開いたとき、正規化マップオプションがデフォルトでチェックされているため、マップは正規化されます。クライオ電子顕微鏡マップは大きなボックスの中央に配置されるため、正規化にはボックス内のすべてのものが含まれます。したがって、pymolで開く前に正規化をオフにすることができます。
   4. 配列の表示をクリックしてリガンドを選択します>。
   5. コマンドラインに isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0と入力し、 Enterキーを押します。
   6. mesh_ligandオブジェクトの横にある最後のボックスCをクリックして、mesh_ligandを青色にします。
   7. 活性部位残基、Ser-42、Asp-241、Glu-283、Asp-310、Arg-364、Lys-386 は、それぞれスティックと球の表現で PEP と Mg²⁺ と相互作用し、エノラーゼ酵素を漫画の表現で表示します。
   8. レイトレースは 、ray 3600、3600 と入力してパブリケーション品質の画像を生成し、 ファイル>保存 をクリックし、ファイル名として PEP.png を選択してpngファイルとして保存します。

2. 代謝型グルタミン酸受容体mGlu 5におけるリガンドのモデリング

1. アゴニストおよびアンタゴニスト結合mGluのクライオEMマップにおけるリガンド密度の同定とモデリング₅
   1. 2 つのハーフマップを、アゴニスト バウンド (EMD-31536, 7fd8.pdb) とアンタゴニスト バウンド (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu₅ コンプレックスのそれぞれに対応する座標ファイルとともにダウンロードします。
   2. ChimeraXを開く
      1. 座標ファイル 7fd8.pdb を開くには、[ 開く ] をクリックして [7fd8.pdb] を選択します。
      2. コマンドラインに delete ligand と入力し、 Enterキーを押します。
      3. 同様に、 コマンド delete/B を使用してチェーン B を削除します。
         注:配位子と鎖は、上部のドロップダウンメニューを使用して、原子/結合>>選択とアクションを使用して削除できます。
      4. リガンドされていない pdb を保存するには、コマンド ラインに save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1 と入力します。#1 はモデル ID を示します。
      5. 7fd9.pdb に対して手順 2.1.2.1-2.1.2.4 を繰り返します。
   3. CCP-EM を開きます。mGlu₅ という名前の新しいプロジェクトを作成し、プロジェクト ディレクトリとユーザー名を指定します。
      1. 左側のパネルのオプションから Relion を開きます。
         1. [マスクの作成]タブに移動します。
         2. EMD-31536 のハーフマップの 1 つを入力として指定します。
            注:Relionは、接尾辞として.mrcを持つマップを受け入れ、EMDマップには.map接尾辞が付きます。マップファイルは、ChimeraXで開いて調べたり、.mrc形式で保存したりできます。
         3. [マスク] タブで、ピクセル サイズを 0.89 Å に、初期二値化しきい値を 0.007 に指定します。
         4. エイリアス 31536 (またはわかりやすい他の名前) を使用してジョブを実行します。
         5. 同様に、EMD - 31537 ハーフ マップのマスクを作成します。
      2. CCPEMの左パネルのオプションから Refmac Servalcat プログラムを開きます。
         1. 名前を mGlu₅_agonist として指定します。
         2. モデルのセクション 2.1.2.4 の説明に従って、7fd8_noligand_chainA .pdb ファイルをインポートします。2 つのハーフマップの場所と、Relon で作成された対応するマスクを指定します。
         3. 解像度を 3.8 Å に指定します。
         4. [細分化設定] > [厳密対称] に移動し、Relion ポイント グループの対称性として C2 を指定します。
         5. 上部のスタートボタンを押してプログラムを開始します。
   4. ジョブが終了したら、 Coot で結果を開きます(結果セクションの上部にあるオプション)。これにより、デフォルトで Coot に diffmap.mtz が表示され、赤と緑の色はそれぞれ負と正の密度を示します。
      1. DELFWT PHDELWT というラベルの差分マップの [表示マネージャ] > プロパティ に移動し、コンター レベルを 4.0 (絶対値) に変更します。
         注: しきい値の選択は、マップと解像度によって異なります。
      2. FWT PHWT というラベルの付いたマップと refined.pdb というラベルの分子を非表示にします。
      3. マウスを使用してマップを動かし、正の密度 (緑色) を視覚化し、大きい方のブロブを中央に寄せます。
      4. [File] > [Get monomer] に移動し、「QUS」と入力して Enter キーを押します。
      5. Calculate > Modeling > Rigid Body Fit分子に進み、QUSモノマーをダブルクリックして、Fo-Fc密度に収まるように分子を調整します。
      6. 編集タブの merge molecule オプションを使用して、QUS 分子を座標ファイル refined.pdb に追加します。
      7. ステップ2.1.4.3-2.1.4.6を繰り返して、モノマーコードNAGおよびCHSのリガンドを、細胞外および膜貫通ドメインの上部の小さい方のブロブにそれぞれ適合させます。
      8. 座標に refined_ligands.pdb と名前を付けて保存します。
         注:膜貫通(TM)ドメインの分解能は低いため、ここでは説明しません。
2. mGlu₅ 配位子構造の改良
   1. CCPEM を開き、前の絞り込みジョブ (ステップ 2.1.3.2) をクローンし、refined_ligands.pdb とシャープ化されたマップ (emd.31536.mrc) を入力として使用し、デフォルトのパラメータと C2 対称性を使用します。
      注:プログラムがリガンドを認識しない場合は、CIFファイルを提供する必要があります。これらの CIF ファイルは、PDB からダウンロードするか、さまざまなプログラムを使用して生成できます (詳細については、手順 3.1.1 を参照してください)。
3. PyMOLでの視覚化と図の生成
   1. 最新の Refmac リファインメント ジョブの refined_expanded.pdb モデルを PyMOL で開きます。
   2. 「ファイル」>「開く」に移動し、Refmacジョブディレクトリを参照して、diffmap_normalised_fofc.mrc(ステップ2.1.3.2のServalcatジョブとの差分マップ)ファイルをロードします。
      注: 参照中に .mrc 拡張子ファイルが表示されない場合は、ファイルの種類を [すべてのファイル ] に変更して参照します。
   3. ディスプレイ>シーケンスを使用してリガンドを選択します。
   4. アクションボタンに移動し、選択の名前をリガンドに変更します。
   5. コマンドラインに「 isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5」と入力してEnterキーを押します。
      注:メッシュ幅は調整できます。ここでは、0.2 メッシュ幅が使用され、これは次のコマンドを使用して設定します: set mesh_width=0.2。
   6. モノマーの 1 つを右クリックし、[チェーン > カラー] に移動して、各モノマーの色を指定します。リガンドとメッシュに色を付けるには、リガンドとmesh_ligandsオブジェクトの c とラベル付けされた最後のボックスを使用します。mGlu₅受容体ダイマーは漫画で表現されており、モノマーはティールと小麦で着色されています。配位子は棒状に示され、配位子の輪郭を描くメッシュは緑色に着色されています。
   7. オブジェクトに対して 向き>/中心/ズームオプションのアクション を使用し、手動で調整してメッシュをはっきりと視覚化します。リガンドと相互作用する可能性のある近傍残基(例えば、QUSの場合はTyr64、Trp100)を選択し、必要に応じて、それらの側鎖または主鎖、あるいはその両方をスティック表現として表示します。
   8. レイトレーシングにより、高解像度の画像を生成し、pngファイルとして保存します。
      注:上記の手順は、アンタゴニストバウンドマップEMD-31537および対応する座標ファイルPDB-7fd9に対して繰り返されます。

3. 阻害剤、デオキシガラクトノジリマイシン(DGN)、および溶媒分子のβ-ガラクトシダーゼの高分解能シャープマップでのモデリング

1. クライオ電子顕微鏡のハーフマップを用いたリガンドDGNの同定
   1. モデリングのための未知リガンドディクショナリーの作製 [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      注:デオキシガラクト-ノジリマイシン辞書ファイルは、DGJ(3文字のリガンドID)としてCCP4モノマーライブラリに含まれています。それにもかかわらず、ここでは、未知のリガンドの辞書ファイルを生成するプロセスを説明するために、新しい未知のリガンドと見なされ、DGNは3文字のコードとして使用されます。
      1. PubChem の Web ページで deoxygalacto-nojirimycin (DGN) の化合物概要を開き、化合物 deoxygalacto-nojirimycin の smiles 文字列をコピーします。
      2. Phenix > Ligands > eLBOWを開きます。
      3. 入力として smiles 文字列を指定します。
      4. 適切な配位子形成最適化法を指定します。ここでは、単純な最適化が使用されます。
      5. chemical smiles文字列をligand definitionセクションに貼り付けます。
      6. ジョブタイトル、出力ファイルのプレフィックス、およびリガンドIDを適切に指定し、runを押します。
         メモ: ジョブの出力には、座標ファイル DGN.pdb と辞書ファイル DGN.cif ファイルが含まれます。Jligand²⁹ は、cif ファイルの作成にも使用できます。
   2. PDBからβ-ガラクトシダーゼ座標ファイル(6tsh.pdb)をダウンロードし、テキストエディタを使用してタンパク質鎖(B、C、D)、リガンド、DGN、およびその他の溶媒分子の座標を削除するか、Cootの鎖/ゾーンオプションを削除します。座標ファイルに apo-betaGal_chainA.pdb という名前を付けて保存します。
      注:ChimeraXまたはPymolを使用して、リガンド/溶媒分子を除去することもできます。
   3. EMDBのEMD-10563エントリの追加データからハーフマップ(emd_10563_half_map_1.mapおよびemd_10563_half_map_2.map)をダウンロードします。
   4. CCPEM を開き、 Relion を使用して、しきい値 0.01 でマップのマスクを作成します (手順 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 で説明)。
   5. Servalcat を (ステップ 2 で説明した CCPEM スイート内で) 実行し、ステップ 3.1.3 で取得したハーフマップとステップ 3.1.2 の apo-model と D2 対称性を使用します。
      注: モデルは、リガンド密度を特定するために、ハーフマップまたはフルマップのいずれかに位置合わせする必要があります。これを行うには、ChimeraXを使用してモデルをマップにフィットさせ、ハーフマップを基準にして座標を保存します。この例では、ハーフマップとEMDBのプライマリマップのボックスサイズ/グリッドが異なるため、モデルをハーフマップに配置する必要があります。
   6. オオバンを開きます。
      1. 手順 3.1.1 で生成したリガンド ディクショナリの DGN.cif を Phenix eLBOW で開きます。これを行うには、[ File] > [Import CIF dictionary ] に移動し、eLBOW ジョブ ディレクトリを参照します。
      2. タンパク質とリガンドの座標ファイル、ステップ3.1.2のapo-betaGal_chainA.pdbとステップ3.1.6のDGN.pdbをそれぞれ開きます。
      3. Servalcatジョブ(ステップ3.1.5)から diffmap.mtz ファイルを自動的に開き、COOTでDELFWT PHDELWTというラベルの付いたマップを視覚化します。絶対値 ~ 4 のしきい値でマップを等高線化します。
         注: ヘッダー map.mrc を入力するか、Chimera のツールを使用して、マップ統計を確認することが重要です。ピクセルサイズ、ボックスサイズ、最小密度、平均密度、最大密度、および平均密度からのrms偏差に関するすべての必要な情報を取得できます。クライオEMマップのピクセルサイズとボックスサイズを確認することが重要です。3Dマップは、タンパク質-リガンドマップのボリュームを3Dボクセルのグリッドで表します。各ボクセルには、電子ポテンシャル値またはその位置で電子を見つける確率が格納されます。特定のしきい値を選択すると、指定した値よりも低い密度を持つボクセルが 0 に設定されます。これにより、マップ内の実験的なノイズを最小限に抑え、マップの特徴をより適切に視覚化することができます⁴³。したがって、マップは、マップの特徴が見やすく、マップ内のノイズが最小になるしきい値で等高線化する必要があります。
      4. リガンドに移動して>リガンドを見つけます。表示される新しいウィンドウで、リガンド、差分マップ、apo-betaGal_chainA.pdb モデルを選択します。他のオプションはデフォルト設定のままにして、[リガンドの検索]をクリックして検索を開始します。
      5. 潜在的なリガンド密度を示す上位ヒットのリストが、各密度にコピーが配置されて表示されます。リガンドが配置されたすべてのヒットを手動で確認します。最も可能性の高いヒットを保持し、あいまいなヒットを削除します。
         注:高い閾値でのマップ密度の違いは、活性部位にリガンドが存在することを明らかに示唆しています。
2. リガンドDGNおよび溶媒分子のモデリング
   1. Coot で 実空間のリファインを実行して 、リガンド (DGN.pdb) を差分密度マップに合わせ、リガンド座標を apo-betaGal_chainA.pdb と マージ して betaGal_chainA+ligand.pdb として保存します。
      注: 他のチェーンの領域に配置された配位子は、マージされた座標ファイルの保存中に削除でき、マージされません。他のチェーンの配位子は、例1のステップ1.2.8に示すようにNCS配位子によって生成するか、対称展開を使用してRefmac/Servalcatで生成できます。
   2. 上記のように、入力モデルとして betaGal_chainA+ligand.pdb を使用し、D2 対称性を持つハーフマップ (ステップ 3.1.3) を使用して、別の Servalcat ジョブ (ステップ 3.1.5) を実行します。
   3. モデル化された配位子を取り巻く密度の違い(ステップ3.2.2のServalcatジョブから)は、配位子分子と配位する溶媒分子の存在を示唆しています。配位子に近い中心密度は、水分子にとって大きすぎるように見えます。
   4. その位置にMg²⁺が存在することを示す以前の生化学的および構造的データに基づいて、ここではMg²⁺ イオンをモデル化するために、 原子配置 オプションをクリックし、原子を MGとして指定します。
   5. 活性部位の密度差で水分子をモデル化し、ポインタの位置にある原子の位置をクリックして水を選択することにより、溶媒分子の存在を示します。
      注:オオバンには、水分子を自動的に選択するオプションもあります。ここでは、活性部位のみに焦点が当てられているため、水分子は手動で追加されます。
   6. Mg²⁺ と水の座標を betaGal+ligand.pdb ファイルと統合し、betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb として保存します。
   7. betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb を使用して、Servalcat で D2 対称性を持つ Refmac リファインメントを実行します。
      注: このジョブからの出力差分マップは、リガンドが正確にモデル化されているかどうかを検証する手段として役立ちます。差分マップは、最小の残留正または負の密度を示す必要があります。
3. PyMOLによる可視化と図表生成
   注:以下に概説する手順は、リガンドと溶媒の存在を示すために使用できるモデルとマップを使用してフィギュアを作成するいくつかの例を示しています。
   1. 最後のServalcatジョブ(ステップ3.2.6)のrefined_expanded.pdbを開き、リガンドと溶媒をモデル化します。
   2. 例 2 で説明したように、異なるチェーンを別々に選択して、マゼンタ、イエロー、グリーン、ティールに色を付けます。
   3. [Display > Sequence]に移動し、水分子、マグネシウム、DGNを個別に選択し、オブジェクトの名前をそれぞれ水、MG、DGNに変更します。
   4. オブジェクトを選択して右クリックし、MGと水分子を球として表示し、球>表示します。同様に、リガンドをスティック表現で表示し、リガンドと溶媒を適切に色付けします。この場合、配位子はヘテロ原子によって黄色に着色され、マグネシウムイオンは紫色に、水分子は赤色に着色されています。
   5. DGN、MG、および水分子を選択します。右クリックしてオブジェクトにコピーするアクションを選択し>ligandsという名前を付けます。
   6. 手順 3.2.6 で Servalcat ジョブから diffmap_normalised_fo.mrc を開き、名前を ligand_fo.mrc に変更します。 isomesh のmesh_ligands_fo、ligand_fo、3、ligands、carve=2 のコマンドを入力します。
      注:2 Åの彫刻オプションが原子の周囲に適用され、マップの解像度と品質に応じて、3〜5の値を使用できます。また、PyMOLでクライオ電子顕微鏡マップを開くときは、normalize_ccp4_mapsをオフに設定することをお勧めします。
   7. アクション>向き/ズームオプションを使用し、手動で調整して、ステップ2.3.7に示すように、リガンドと近くの相互作用残基(該当する場合)を視覚化します。
   8. これらのシーンをレイトレーシングして、 コマンド ray 3600、3600 を使用して高解像度の画像を保存します。
   9. シーンを.pngファイルとして保存します。
      注:次の手順はオプションであり、(1)モデル化されていない配位子DGNの差密度(Fo-Fc)、(2)モデル化された配位子DGNの密度(Fo)、モデル化されていない溶媒の差密度(Fo-Fc)、最後に(3)モデル化された配位子、DGN、および活性部位の溶媒分子の密度(Fo)を視覚化するプロセスの概要を示します。
   10. 差分マップを使用してリガンド、DGN、および周囲の溶媒分子の存在を示すには、ステップ3.1.5のServalcatジョブから diffmap_normalised_fofc.mrc を開きます。マップ・オブジェクトの横にある 「アクション」>「名前の変更 」をクリックして、マップ・ファイルの名前を「unliganded_fofc.mrc」に変更します。コマンドラインに isomesh mesh_ligands_fofc、unliganded_fofc、ligands、level=6、carve=2と入力します。
   11. モデル化された配位子DGN、および周囲のモデル化されていない溶媒密度の密度を示すには、手順3.2.2でservalcatジョブの diffmap_normalised_fo.mrc と diffmap_normalised_fofc.mrc を開きます。diffmap_normalised_fo.mrcの名前を DGN_fo に、diffmap_normalised_fofc.mrcの名前を DGN_unmodelled_solvents_fofcに変更します。
   12. Display > SequenceからMGと水を選択し、右クリックしてオブジェクトにコピーするアクション>選択し、それらを溶媒として名前を付けます。
   13. コマンド ラインに isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2 と入力します。
       注:mesh_DGN_foはリガンドの密度を示し、mesh_solvent_fofcはMGと水の省略密度を示します。
   14. 最後に、モデル化された配位子と活性部位の周囲の溶媒分子を視覚化するために、ステップ 3.2.6 の Servalcat ジョブから diffmap_normalised_fo.mrc を開き、名前を ligand_fo.mrc に変更します。
   15. コマンドラインに isomesh mesh_ligand_fo、ligand_fo、selection=ligands、level=3、carve=2と入力します。
       注:ここではdiffmap_normalised_fo.mrcを使用しましたが、最終的なシャープマップを使用して、リガンドの密度と周囲の残基を示すことができます。図の凡例で、使用するマップのタイプ、B ファクターシャープニング値について言及することをお勧めします。
   16. メッシュの幅と球のサイズを設定するには、set mesh_width=0.2 と set sphere_scale=0.25 というコマンドを入力して、球のサイズを小さくします。
   17. fo メッシュを青、fofc メッシュを緑に色付けします。
   18. ステップ2.3.7に示すように 、アクション>方向/ズーム オプションを使用し、手動で調整して、リガンドと近くの相互作用する残基(該当する場合)を視覚化します。
   19. これらのシーンをレイトレーシングして、 コマンド ray 3600、3600 を使用して高解像度の画像を保存します。
   20. 個々のシーンを.pngファイルとして保存します。

4. β-ガラクトシダーゼのリガンドモデリングにおける分解能の影響

1. ターミナルを開き、2つのハーフマップを含むディレクトリに移動します。
2. ChimeraXで2つのハーフマップ(ステップ3.1.3)を.map形式で開き、視覚化してemd10563_half1_1_unfil.mrcおよびemd10563_half2_1_unfil.mrcとして保存します。
3. ステップ 3.1.4 で作成したマスクは、入力として使用できます。
4. Relionで、手順4.2〜4.3のハーフマップとマスクを使用して、デフォルトのパラメータを使用して PostProcessing ジョブを実行します。
5. 手順4.4を繰り返して、 スキップFSC計量 を有効にし、アドホックローパスフィルタを 3 Åに指定します。
6. 手順 4.4 を 3.5 Å のアドホックローパスフィルターで繰り返します。
7. 手順4.4-4.6のマップ(postprocess.mrc)を開き、異なる解像度でフィルタリングし、手順3.1.2のモデル座標6tsh.pdb(ChimeraXのハーフマップに位置合わせ)ファイルをPyMOLで開きます。各マップの名前を、解像度の定義に従って 3.0、3.5、2.3 に変更します。
   注:マップのローパスフィルタリングは、ChimeraXまたはCootでマップを視覚化することで確認できます。
8. リガンド分子と溶媒分子の密度に対する分解能の影響を視覚化するには、ステップ 3.3.6 で説明したように、リガンド分子と溶媒分子の周囲に 2 Å のメッシュを作成し、マップを異なる解像度にフィルタリングします。

Results

実施例1
結核菌由来の酵素エノラーゼは、解糖の最後から2番目のステップを触媒し、2-ホスホグリセリン酸をいくつかの代謝経路の必須中間体であるホスホエノールピルビン酸(PEP)に変換する^44,45。アポエノラーゼサンプルとPEP結合エノラーゼサンプルのクライオ電子顕微鏡データを同じピクセルサイズ1.07 Åで収集し、Relion 3.1^46,47で画像処理を行いました。アポエノラーゼおよびPEP-エノラーゼの構造は、それぞれ3.1 Åおよび3.2 Åで決定された⁴⁸。マップとモデルは、EMDBとPDB^49,50(EMD-30988、EMD-30989、PDB-7e4x、およびPDB-7e51)に寄託されました。この酵素のクライオ電子顕微鏡マップは、この酵素が溶液中の八量体であることを示しています(図1A)。PEP-エノラーゼマップのリガンド密度を同定するために、アポエンザイムとPEP結合酵素のシャープ化されていないマップを選択し、アポエンザイムマップからPEP-エノラーゼマップを差し引くことにより、ChimeraXで差分マップを計算しました。高い閾値で明確な密度(緑色)が観察され、これはリガンドの存在を示唆しています(図1B)。シャープ化されていないマップでタンパク質鎖をモデル化すると、タンパク質の活性部位に余分な密度が存在することが明確に示されました(図1C)。次に、配位子であるPEPをCootを使用してB因子シャープマップでモデル化し、タンパク質+リガンドモデルをPhenixを使用して実空間で精製しました。2つのMg²⁺イオンを、リガンドの近傍で観察された密度でモデル化しました(図1D)。配位子であるPEPは、他のエノラーゼ相同体で観察されるのと同様の配向を採用し、Lys-386、Arg-364などのいくつかの活性部位残基は、配位子PEPと水素結合相互作用を形成します。Mg²⁺イオンは、Asp-241、Glu-283、Asp-310、およびPEPのリン酸塩と金属配位結合を形成します(図1D)。

実施例2
利用可能なアポタンパク質構造がない場合、またはタンパク質が大きなコンフォメーション変化を受ける場合、上記のように差分マップを計算することは不可能です。2021年、ケンブリッジ大学分子生物学研究所のGarib Murshudov氏のグループは、Refmacを使用したリファインメントワークフローを実装し、リファイン後にFo-Fc差分マップを計算するServalcat²²を発表しました。Fo-Fcの差密度が正の場合、リファインメント中にモデルに含まれなかった分子/リガンドの存在、つまり基本的にはオミットマップが存在することを示唆しています。ただし、最初にモデルのマップへの適合度を一般的に評価してから、差分密度マップを評価することをお勧めします。

Servalcat/Refmacの使用を説明するために、神経伝達物質であるL-グルタミン酸に結合する二量体Gタンパク質共役受容体であるmGlu₅が選択されました。アゴニストであるL-quisqualateが結合すると、細胞外ドメインが配向し直し、7TMの回転が引き起こされ、7TMが活性化状態を安定させるために近づきます。したがって、アポ/アンタゴニスト との間には大きなコンフォメーションの変化が観察されます。アゴニスト結合状態⁵¹(図2A および 図2E)。アゴニスト(EMD-31536)とアンタゴニスト(EMD-31537)の結合複合体の2つのハーフマップはEMDBから取得し、クライオEMマップは分子全体で異なる解像度を示し、細胞外ドメインの分解能が良好であることを示しています。その後、これらは、各データセットの差またはFo-Fcマップを計算するためのモデルとして、apoタンパク質とともにServalcatの入力として利用されました。このマップは、さまざまなリガンド分子(非タンパク質)の存在を明確に示していました。FSC(フーリエシェル相関)によって推定されたアゴニスト結合錯体とアンタゴニスト結合錯体に対する分解能は、それぞれ3.8 Åと4.0 Åでした。アゴニスト結合型mGlu₅の場合、Servalcat Fo-Fc差マップは、受容体のECD中にアゴニスト(L-quisqualate)(図2B)とN-アセチルグルコサミン(NAG)(図2C)の両方が存在することを示しました(TMDの分解能が低いため、ここではECDとTMDの上部にのみ焦点を合わせます)。Tyr-64、Trp-100、Ser-151、Thr-175などのタンパク質残基は、アゴニストと相互作用することが見られます。Asn-210残基付近の密度は、N-アセチルグルコサミンの存在を示唆していました(図2C)。mGlu 5の精製中に添加されたヘミスコハク酸コレステリルと一致する密度が_、 膜貫通ヘリックス1の上部付近で観察されました(図2D)。分解能は中程度であり、リガンドであるL-quisqualateは異なる配向に配置することができるため、リガンドを含む細胞外ドメイン(PDB-6N50)の以前の構造をリガンドをモデル化するためのガイドとして使用しました。アンタゴニスト結合は、受容体の開放状態または静止状態を安定化させます(図2E)。ECDのビーナスフライトラップドメインのローブIとローブIIのヒンジで、アンタゴニストLY341495と一致する密度が観察されました。アンタゴニストは、アゴニストと同様の残基と相互作用します。ローブIIのTyr-223とアンタゴニストとの間の相互作用を積み重ねると、受容体が開放状態で安定化します(図2F)。アゴニスト構造と同様に、グリコシル化またはN-アセチルグルコサミン部分の存在がAsn-210の近くで観察されました(図2G)。

実施例3
3 番目の例では、フラグメントサイズまたは低サイズのリガンドおよび溶媒分子を高分解能 CryoEM マップでモデル化するためのプロトコールを解明します。フラグメントベースの創薬(FBDD)は、さまざまな疾患領域における標的ベースの新規治療薬の開発において強力で革新的な方法として浮上しており、製薬研究開発^52,53の有望な手段となっています。FBDDは、目的の特定の標的タンパク質または生体分子に結合する、小さく、高溶解性で低分子量の分子フラグメントをスクリーニングし、慎重に選択することから始まります。これらのタンパク質-フラグメント複合体の構造を決定することで、これらのフラグメントの結合モードが明らかになり、標的タンパク質⁵⁴に対する親和性と特異性が増大する、より大きく複雑な薬物様分子を設計するためのガイドとして役立つ。しかし、この方法では、姿勢を正確に決定し、リガンド¹⁵の機能基を正しく配置するために、高解像度のリガンド密度が要求される。

クライオ電子顕微鏡技術の進歩から決定された最初の高分解能構造の1つであるβ-ガラクトシダーゼは、ラクトースからグルコースおよびガラクトース⁵⁵への加水分解を触媒する、よく研究された450kDaホモ四量体酵素です。FBDDにおけるクライオ電子顕微鏡の使用を紹介するために、英国のAstexは、活性部位に結合したフラグメントサイズの阻害剤であるデオキシガラクトノジリマイシン(DGN)を持つβ-ガラクトシダーゼの構造を決定しました（EMDB-10563、PDB:6tsh)⁵⁶。このデータセットは、リガンドと溶媒を高解像度マップで明確にモデル化するためのプロトコルを説明するために使用されます。リガンドのモデリングと可視化に対する解像度の影響を示すために、Relionの後処理ステップでマップを3.0 Åと3.5 Åにフィルタリングしました。これは、さまざまな解像度でのマップ密度の品質を強調し、リガンドと溶媒のモデリングにより高い解像度が必要であることを強調しています。

この酵素は、溶液中でD2対称性を持つ四量体です(図3A)。Servalcatによって計算された差分マップ(マップとモデルの間)は、酵素の活性部位にDGNといくつかの溶媒分子が存在することを示唆しました(図3B)。推定分解能2.3 Åでは、密度は高分解能の特徴を示し、タンパク質活性部位における阻害剤の正確なモデリングに役立ちました。DGNとTyr-503およびHis-540との間の相互作用が観察されました(図3C)。また、密度の違いは、DGNと相互作用する溶媒分子やタンパク質残基の存在も示唆していました。Mg²⁺ といくつかの水分子を密度でモデル化しました(図3D)。Mg²⁺ とGlu-416、Glu-461、およびいくつかの水分子との間の金属配位結合が観察されます(図3D)。Mg²⁺ は、水分子を介してDGNと相互作用することが見られました。

3.5 Å と 3.0 Å の低分解能では、リガンド密度はブロブに似ており、リガンドの正確なモデリングに不可欠な高解像度の特徴が欠けています(図 4A、B)。これらの解像度では、水分子の密度はほとんど存在しませんでした。要約すると、分解能が上がると、特に 3.0 Å を超えると、密度によってより多くの水分子をモデル化できるようになりました(図 4C、D)。配位子のキラル中心の正しい配置は、水分子と Mg²⁺ の配置とモデリングをガイドするマップ内の明確な特徴の存在により、~2.3 Å で達成可能になりました (図 4C,D)。これに対し、Mg²⁺の密度は、分解能範囲全体で識別可能なままでした(図4A-C)。

図1:結核菌エノラーゼにおけるリガンドホスホエノールピルビン酸のモデリング(A)は、PEP結合エノラーゼ酵素のB因子シャープマップを示しています。このマップは、エノラーゼが溶液中で八量体であり、マップ内の各モノマーの色が異なることを示唆しています。(B)は、アポエノラーゼ酵素のシャープ化されていないクライオEMマップを灰色で表示し、差分マップ(PEP結合マップとアポエノラーゼ非シャープマップ)を緑色で重ねて表示しており、リガンドであるPEPの存在を示唆しています。これは、リガンドの存在を示すデモマップです。(C)は、シャープ化されていないクライオEMマップでのエノラーゼモデルの適合を表示し、タンパク質に対する密度の差の位置を強調しています。タンパク質モデルは漫画で表示され、チェーンボウで色付けされています。この図は、各モノマーの活性部位に余分な密度(緑)が存在することを示しています。(D)は、B因子シャープマップに包まれた配位子PEPを青色で示しています。さらに、2つのMg²⁺イオンの密度も観察され、Ser-42、Asp 241、Glu-283、Asp-310、および配位子原子を含むいくつかの活性部位残基と金属配位結合を形成します。配位子は、Lys-386、Lys-335、およびArg-364と水素結合相互作用を起こします。タンパク質残基は棒状に、Mg²⁺イオンは紫色の球体で示しています。パネル(A-D)の数字はPymolで生成しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:mGlu₅ 受容体におけるさまざまなリガンドの同定、モデリング、可視化。 Fo-Fc省略マップはServalcatを使用して取得しました。(A)は、mGlu₅ 受容体ダイマー構造(PDB-7fd8)を漫画で表現し、各モノマーをそれぞれティールとコムギで着色し、アゴニストL-quisqualateに結合させた。細胞外および受容体の膜貫通ドメインの上部で同定されたすべてのリガンドは、Fo-Fcオミットマップに包まれ、緑色で着色され、6σで輪郭が付けられています。(B)はアゴニストのフィット感を強調し、差分マップに包まれたL-quisqualate。L-quisqualateは、Tyr-64、Trp-100、Ser-151、Thr-175、Gly-280などのいくつかのmGlu₅ 残基と相互作用します。H結合相互作用は赤いダッシュで表されます。(C)では、受容体の細胞外ドメインに存在するAsn-210の近くに追加の密度が明らかであり、この密度でN-アセチルグルコサミン分子(NAG)をモデル化しました。明確にするために、現在の図では、NAG は Asn にリンクされていません。(D)は、受容体の脂質曝露表面付近の緑色でヘミスコハク酸コレステロール(CHS)の密度の違いを示しています。スティックで表されるCHS分子は、この密度でモデル化されました。(E)は、アンタゴニストLY341495に結合したmGlu₅ 受容体構造(PDB-7fd9)を漫画で示しています。(F)では、細胞外ドメインのローブIとローブIIの間のヒンジに位置するFo-Fc差分マップの追加の密度は、アンタゴニストの存在を示しています。アンタゴニストの周囲の主要な残基(Tyr-64、Trp-100、Ser-152、Ser-173、Thr-175、Tyr-223)はスティック表現で示され、アンタゴニストとの潜在的な水素結合相互作用は赤いダッシュで示されています。(G)は、アンタゴニスト結合構造におけるAsn-210近傍のNAG分子の存在を示唆する密度の違いを示しています(なお、NAGは明確にするためにAsnと関連していません)。数値はPymolで生成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:β-ガラクトシダーゼ(EMD-10563)の高解像度マップにおける低分子阻害剤および溶媒分子の同定、モデリング、および精製。(A)は、2.3 Å(PDB:6tsh)に分解されたβ-ガラクトシダーゼモデルを漫画表現で示しています。各モノマーは明確に着色されています。灰色のボックスは、リガンド結合部位を強調しています。(B)は、Fo-Fc差密度(Servalcat製)を酵素の活性部位の緑色のメッシュで表示します。密度の違いは、活性部位に阻害剤(DGN)といくつかの溶媒分子が存在することを示唆しています。(C)は、Fo-Fcマップに導かれて、阻害剤デオキシガラクト-ノジリマイシン(DGN)が活性部位でモデル化されることを示しています。このモデル化された配位子はスティック形式で描かれ、Fo密度(Servalcatによる)で包まれ、blue_meshで着色されています。DGNとTyr-503やHis-540などのいくつかのタンパク質残基との間の水素結合相互作用が観察されます。配位子(緑)の周りの追加のFo-Fc差密度は、溶媒分子を示しています。(D)このマップは、水とMg²⁺を含むいくつかの溶媒分子(それぞれ赤と紫の球で表される)が、各溶媒分子がタンパク質(Glu-416、His-418、およびGlu-461)またはリガンド残基のいずれかに結合していることを確認した後、活性部位でモデル化されていることを示しています。水分子とMg²⁺はFo密度(青色メッシュ)に包まれています。Mg²⁺は、水分子を介して配位子であるDGNと相互作用することが見られます。パネル(B,C)のFo-Fcマップ(緑のメッシュ)は6σでコンター化されていますが、CとDのFo密度-ブルーメッシュ(モデリング後のServalcatリファインメントから)は3σでコンターされています。パネル(A-D)の数字はPymolで生成しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:β-ガラクトシダーゼのリガンドモデリングに対する分解能の影響。 EMD-10563 のハーフマップを Relion の後処理ステップの入力として使用し、組み合わせた後処理マップを異なる B 係数で解像度 2.3 Å、3.0 Å、および 3.5 Å にフィルタリングしました。すべてのパネルに表示されるマップは、6σでコンター化されています。明確にするために、パネルA、B、およびCに側鎖、リガンドまたは溶媒分子を含まないタンパク質骨格のみが示されていますβ。この解像度では、配位子DGNに似たブロブが見られ、近くにいくつかの小さなブロブが伴います。リガンドを正しい向きでモデル化することは、マップに明確な特徴がないため、困難であることが証明されています。(B)3.0 Åの解像度にフィルタリングされたマップが表示されます。ここでは、リガンドブロブはわずかに明確になりますが、一般的にはまだ特徴がありません。溶媒分子を示唆する小さな塊もさらにいくつか観察されます。(C)2.3 Å の分解能でフィルタリングしたマップは、明確な特徴を持つ配位子密度を明らかにし、特にイミノシュガーのチェアコンフォメーションを明らかにします。この解像度では、水分子に対応する小さなブロブがかなり多く観察されます。Relionのポストプロセスでの自動Bファクター推定/シャープニングは、3 Åと3.5 Åにフィルタリングされたマップで-18 Ųの値を与えますが、2.3 Åにフィルタリングされたマップでは-52 Ųです。EMマップのさまざまなBファクターシャープニングもCootで実行でき、モデル構築に役立ちます。(D)パネルは、活性部位でモデル化されている配位子DGN(スティック表現)、Mg²⁺、および水分子(球体)と、これらの原子を囲む青いメッシュで示されている2.3 Åのシャープマップを示しています。パネル(A-D)の数字はPymolで生成しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

近年、顕微鏡のハードウェアとソフトウェアの改良により、クライオ電子顕微鏡の構造の数が増加しています。単粒子クライオ電子顕微鏡で現時点で達成されている最高分解能は 1.2 Å ^57,58,59 ですが、構造の大部分は 3-4 Å の分解能で決定されています。中解像度から低解像度のマップでのリガンドのモデリングは、厄介で、多くの場合、あいまいさをはらんでいます。トランスレーショナルリサーチや創薬のために、学界と製薬業界の両方でクライオ電子顕微鏡が広く使用されていることを考えると、リガンドが正しくモデル化され、曖昧さがないことを確認することが不可欠です。したがって、Qスコア⁶⁰を計算することにより、配位子原子の分解可能性を定量化することが賢明であり、これは現在、マップの品質とモデルの適合度を評価するための指標としてEMDBおよびChimeraで利用可能です。

最初の例では、ChimeraXを使用して、結核菌エノラーゼ酵素のアポマップとリガンド結合マップとの間の実空間での差分マップを計算しました。高い閾値での追加密度は、活性部位にリガンドであるホスホエノールピルビン酸が存在すること、およびリガンドに結合したMg²⁺の存在を示唆しています。この場合、マップの解像度は中程度(3.2 Å)であり、水分子は自信を持ってモデル化できないことに注意してください(図1)。この方法に関連する制限は、リガンド結合がタンパク質の有意な立体配座変化を誘導しない場合にのみ適用できることです。この場合、apoとリガンド結合の両方のデータセットが同じピクセルサイズで取得され、Relionで同じパラメータで処理されたため、マップの正規化は実行されませんでした。ただし、Relion^46,47 や CryoSparc⁶¹ などの異なる再構築プログラムによって生成されたマップ、または品質が異なるマップを比較する場合、意味のある比較を行うには、マップの正規化が不可欠になることに注意してください。

次の例はmGlu₅で、クライオ電子顕微鏡の構造^51,62から明らかなように、アゴニストの結合により大きな分子再編成を受けます(図2)。このシナリオでは、非結合(apo)受容体とリガンド結合受容体の間には大きな違いがあるため、単純な差分マップを計算することはできません。ここでは、シャープ化されていない、重み付けされていないハーフマップを逆数空間での改良の入力として使用し、その後、実験マップとモデルから導出されたマップとの間の差分マップを計算するServalcatが利用されました。高いしきい値では、違いを視覚化し、モデルの修正と改善のガイドとして機能できます。mGlu₅の細胞外および膜貫通ドメイン付近にいくつかのモデル化されていないブロブが観察され、モデルリガンドのガイドとして使用されました(図2)。

3 番目の例は、分解能 (2.3 Å) が β-ガラクトシダーゼのフラグメントサイズ阻害剤のマップ解釈とモデリングにおいてどのように重要な役割を果たすかを示しています。ここでの課題は、データに内在するノイズの中で、Servalcat差分マップで非常に小さなリガンド(<200 Da)を特定し、それを正確にモデル化することでした。フーリエシェル相関(FSC)を使用して決定された高いグローバル分解能に加えて、リガンドに特有の局所分解能も十分に高かったため、リガンドのキラル中心を正確に配置することができました(図3)。溶媒分子の密度は、酵素全体、特にリガンドの周囲の差分マップで観察されました。リガンドと溶媒原子のモデリングに対する分解能の影響も実証されました(図4)。水分子や溶媒分子をモデル化する際には、低い閾値でのノイズが水分子や溶媒分子に似ており、誤解を招く可能性があるため、注意が必要です。

もう1つの重要な考慮事項は、クライオ電子顕微鏡マップだけでは金属イオンを正確に同定するには不十分である可能性があることです。金属イオンの存在と同一性を確認するために、拡張X線吸収微細構造(EXAFS)やエネルギー分散型X線分光法(EDX)などの追加の生物物理学的方法がしばしば必要になります。エノラーゼ酵素とβ-ガラクトシダーゼ酵素の両方で、これらのタンパク質に関する豊富な情報がすでに入手可能なため、Mg²⁺ がモデル化され、金属イオンの同一性が確認されました。また、これらの場合の金属イオンの配位は、古典的な八面体形状とMg²⁺のほぼ理想的な配位距離に代表され、それらの同一性の実質的な証拠を提供しました。

一般に、クライオ電子顕微鏡マップでリガンドをモデル化する際には、いくつかの重要な考慮事項を考慮する必要があります。まず、リガンドの同定とモデリングに適したマップを選択することが重要です。いずれの場合も、リガンド密度を視覚化するには、シャープ化および重み付けされていないマップまたはハーフマップを使用することをお勧めします。これは、シャープ化および重み付けされたマップよりも、マップ内のシャープ化が不十分またはシャープ化されすぎた(シリーズ終了によるノイズ)領域が発生する可能性があるためです。これにより、配位子密度が最適ではなくなる可能性があり、Cootでのモデル構築中に密度を評価するために、さまざまなBファクターシャープニングを使用することができます。シャープ化されたマップを使用してクライオEMマップ内のリガンドを特定することにはリスクがありますが、シャープ化されていないマップはリガンド密度の完全な詳細を示していない場合がありますが、 図1B、Cに示すように、デモンストレーションの目的で使用できます。

モデル化されたリガンドの姿勢は、特にデータが弱い場合に検証する必要があります。mGlu₅ で示されているように、局所分解能はクライオ電子顕微鏡マップ全体で異なり、リガンドの偏りのないモデリングは困難な場合があります。Servalcatは、タンパク質およびリガンドモデリングの潜在的な不正確さを検出するための貴重なツールとして使用できます²²。

組成の不均一性は、特定の集団のみがリガンドが存在する可能性のあるタンパク質-リガンド複合体に存在する可能性があります(リガンドが低分子量の場合、分類ステップでは不均一性が除去されない可能性があります)。それにもかかわらず、リガンドモデリングに先立って、画像処理中に3D分類⁶³ ステップを反復的に実行し、リガンドの密度が向上するかどうかを確認することが重要である。タンパク質のコピーが複数存在する場合、初期モデルの生成と改良中にマップ全体に対称性を適用すると、対称性に関連するすべての分子のリガンド密度が平均化される可能性があるため、注意が必要です。対称性は、マップを徹底的に検査して、すべてのタンパク質鎖のリガンド密度の存在を確認した後にのみ行う必要があります。

状態(結晶または溶液)と位置(埋没または表面)に応じて、原子は動的になる可能性があり、モデルの精緻化では、これは原子置換パラメータ(ADP)と呼ばれます。モデル内の不正確さの可能性に対する視覚的な手がかりを提供する差分マップとともに、ADP値を使用して、細分化^{64、65、66、67}後の配位子の精度を評価できます。通常、リガンドは周囲の残基と同様のADP値を持つ必要があります、つまり、リガンドが安定して結合し、正確にモデル化されている場合です。ただし、高分子から遠く離れたリガンドの周辺または原子(脂質など)の配位子は、ADP値が高くなる可能性があります。座標の精緻化に加えて、Refmac ^33,34 と Phenix の両方で ADP 値^28,68 の精緻化が可能です。Refmacでは、マップ計算中にMott-Bethe近似を使用して個々の原子の電子散乱係数を計算します。Phenixの最近のバージョンでは、原子の無秩序を説明するために、結晶学と同様に個々のB因子の改良が導入されました。クライオ電子顕微鏡から導出された精緻なモデルでは、広範囲のADP値(時にはゼロに近い値)が観察されることが非常に多く、モデルとマップの適合度を評価するためにEMDBで使用されるQスコアでさえ、堆積されたプライマリマップとBファクターシャープニング⁶⁰の性質に依存する。クライオ電子顕微鏡モデルの構築では、複数のマップが使用されることが多く、多くの高分子の異方性分解能により、1つのマップですべての詳細を説明するのに十分ではない可能性があるため、モデリングとリファインに使用されるマップをメソッドで明確に言及する必要があります。 

高分子のリガンドのモデリングにおいて、クライオ電子顕微鏡マップ(結晶学など)の主な制限の1つは、リガンド結合部位の分解能が低い場合、または結合したリガンドが動的である場合、正しいコンフォメーションを確認することが困難になる可能性があることです。さらに、ほとんどのクライオ電子顕微鏡構造の分解能は3 Å未満であり、マップ内の水分子の表現は限られているため、リガンドや薬物の結合における水和の役割を評価することは困難です(ここではエノラーゼとmGluRの例で示されています)。これらの制限に対処するために、計算方法をクライオ電子顕微鏡データと組み合わせて使用することができる⁶⁹。結晶学とは対照的に、モデルのみが改良され、マップは改良されません。現在、リガンドの存在を示す、または正確なモデリングを保証する唯一の方法は、(Servalcatなどのツールを使用して)省略マップを生成することです。したがって、研究者がモデルを構築して評価するのに役立つツールは数多くありますが、モデルの改良には、近い将来、新しいアプローチや現在のアプローチの変更が期待できる領域がいくつかあります。

この記事では、リガンド密度の手動検査、リガンドジオメトリファイルの生成、クライオEMマップでのリガンドのモデリングなど、リガンドをモデル化するための現在のアプローチに焦点を当てました。これは、構造生物学と創薬においてエキサイティングな時期であり、より高速なフレームレートの直接電子検出器とより高速なデータ取得⁷⁰ の使用により、比較的短時間で低分子リガンドに結合することが多いいくつかの高分子の高解像度マップ(<2.8 Å)が得られました。SchrodingerスイートのGEMspot⁶⁹ やRosettaスイートのEMERALD¹⁷ などの自動リガンドモデリングツールが最近導入され、実験的なクライオEMデータを考慮しながらリガンドの最も可能性の高い束縛ポーズを見つけようとするため、このプロセスの合理化と自動化が期待されています。X線結晶構造解析と同様に、クライオ電子顕微鏡による低分子リガンドの結合モードを、おそらく1日に2つ以上同定することが現実的な可能性になると考えられています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	いくつかの研究所のコンソーシアム	https://www.ccp4.ac.uk	学術ユーザー向けに無料で、Coot と X 線結晶構造解析用に開発されたツールのリストが含まれています
CCP-EM	いくつかの機関のコンソーシアム	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	学術ユーザー向けに無料で、Coot、Relion、その他多くの
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	モデル構築用の一般的なソフトウェアですが、上記の他のスイートでも利用可能
DockinMap (Phenix)	いくつかの研究所のコンソーシアム	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	モデルをクライオEMマップにドッキングするためのPhenixスイート内のソフトウェア
、電子顕微鏡データバンク	複数の研究所のコンソーシアム	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	電子顕微鏡マップの公開リポジトリ
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial、サーモフィッシャーのカメラ
フェニックス	いくつかの研究所のコンソーシアム	https://phenix-online.org/download	学術ユーザーのために無料で、Coot
データバンク	研究所のコンソーシアム https://rcsb.org		高分子構造の公開データベース
Pymol	Schrodinger		https://pymol.org/2/ 分子ウイルス化ツールが含まれています。教育版は無料ですが、制限があります。フルバージョンは少額の料金で入手できます。
Relion	MRC-LMB、ケンブリッジ	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	クライオ電子顕微鏡画像処理用ソフトウェア、CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientificでも利用可能	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	ディスプレイ、分析、その他のための汎用ソフトウェア
UCSF Chimera X	UCSF, USA		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/表示、分析などのための汎用ソフトウェア