大腿骨内注射は、少数の造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を骨髄腔に直接配置することにより、生着を可能にします。ここでは、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射の実験プロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
造血幹細胞(HSC)は、生涯にわたってすべての血液細胞タイプを産生する能力によって定義されます。これは、HSCを含む細胞集団を同系マウスまたは免疫不全マウスに移植することにより、運用上テストされます。次に、移植片のサイズと多系統組成を、通常はフローサイトメトリーによって経時的に測定します。古典的には、HSCを含む集団が動物の循環に注入され、その後、HSCは骨髄に住み着き、そこでHSCは留まり、血液産生を開始します。あるいは、造血幹細胞および/または前駆細胞(HSPC)を骨髄腔内に直接配置することもできます。
この論文では、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射のプロトコルについて説明します。要するに、前処理されたマウスに麻酔をかけ、針を使用して膝から大腿骨に小さな穴を開けます。次に、より小さなインスリン針を使用して、最初の針によって作成されたのと同じ導管に細胞を直接注入します。この移植方法は、マウス細胞またはヒト細胞をドナー細胞として使用して、さまざまな実験デザインに適用できます。この文脈では、静脈内注射よりも生着が改善され、統計検出力が向上し、使用するマウスの数が減少すると考えられているため、異種移植に最も広く使用されています。
概要
血液は人体の中で最も高い再生率の1つであり、成人のヒト骨髄1では1日あたり1×1012個の細胞が産生されます。造血幹細胞(HSC)は、造血の過程で生涯にわたって血液産生を保証し、自身を維持しながら(自己再生)すべての血液細胞タイプを生成する能力(多能性)によって定義されます。歴史的に、造血幹細胞の機能をテストするためのゴールドスタンダードは常に移植に依存しており、ドナー集団がマウスのすべての血統を長期間(一般的には最低20週間と定義)再構成する能力をテストしてきました2。数十年にわたる大規模な機能的研究により、HSCコンパートメントは系統出力と長期再構成の両方で不均一であることが実証されています。造血を研究するためのツールキットは、in vitroシングルセル機能アッセイ、シングルセルオミクスアプローチ、系統追跡3など、多くの新しい技術によって、長年にわたって大幅に拡大してきました。後者は、HSCと多能性祖先の寄与が、ネイティブの造血と移植によって課せられるストレスの下で大きく異なることを決定的に示しています。これらの技術はすべて、HSCの長期的な再増殖能力を評価するために依然として重要である移植アッセイを補完します。ヒト造血の研究の文脈では、異種移植は、全生物環境での自己再生を実験....
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プロトコル
ここで紹介するすべての動物研究は、1986年動物(科学的手続き)法、2012年改正規則に準拠しており、ケンブリッジ大学動物福祉倫理審査機関(AWERB)による倫理審査と承認を経て実施されました。女性はうなずく。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウスを 12 週から 16 週齢 (~21-30 g) で飼育し、社内で飼育し、特異的病原体を含まない動物施設で飼育し、大腿内注射に使用しました。匿名化されたCBサンプルは、ケンブリッジシャー地方研究倫理委員会(18/EE/0199)によって承認された規制された手順に従って、ケンブリッジ血液幹細胞バイオバンク(CBSB)によるインフォームドコンセントの後、健康なドナーから収集されました。
1.マウスの準備
- 照射前に、マウスの耳にノッチを付けて識別し、ベースライン体重の体重を量ります。
- 細胞移植の24時間前に、マウスに2.4Gyの放射線を亜致死的に照射します。
2.細胞の調製
注:これらの注入では、新鮮または凍結サンプルから細胞を使用することができます。細胞の特定の亜集....
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結果
大腿骨内に注入された細胞の生着は、実験デザインに応じて、24 時間以降の任意の時点で評価できます。終了時点では、IF、BM、PB、および脾臓を採取することができます。これらは処理でき、生着のレベルはフローサイトメトリーによって評価されます。低レベルでもヒトの生着を頑健に呼び出すために、ヒトCD45に対する2つの異なる抗体(クローンHI30とクローン2D1)で染色しました。両方の抗体(CD45++
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ディスカッション
大腿骨内注射は、利用可能なHSPCの数が少ない異種移植において有用なツールであり、静脈内注射と比較して生着が改善されます。ただし、この技術には器用さとトレーニングが必要です。練習するときは、正しい体重範囲の新鮮な死体(下記参照)を使用し、色付きの染料(トリパンブルーなど)を注入して、解剖時に注射が大腿骨に入ったかどうかが明確になり、それに限定された(筋肉に染料が観察されない)ことをお勧めします。この手順には、2番目の針を導管に正しく挿入することと位置決めするという2つの重要なステップがあります。ポジショニングについては、ここでは方法が推奨されますが、マウスの脚を最も快適かつ再現性よく保持する方法を最適化するのは個人次第です。たとえば、私たちのチームのメンバーは、体全体から脚を固定することを好みます。どのような状況でも重要なのは、脚、したがって大腿骨がしっかりしていることです。2本目の針が大腿骨に正しく挿入されているかどうかを確認するために説明される「引っかき傷」は、ざらざらした表面を打つようなものですが、文章でさらに説明することは困難です。通常、ほとんどのユーザーは、自.......
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
著者らは、この方法に関する以前の研究についてJohn Dick博士のグループを、トレーニングについてMonica Doedensのグループに感謝します。私たちは、ケンブリッジ血液幹細胞バイオバンク(CBSB)、特にジョアンナ・バクスター博士とCBSBの看護師チームが同意し、臍帯血サンプルを収集してくれたことに感謝しています。私たちのサンプルドナー。大学生物医学サービス、特にニコラス・ラムリーとアン・マクラーレン・ビルディングのスタッフは、マウス系統のメンテナンスと in vivo 実験のサポートを担当しています。原稿の編集のためのShaaezmeen Basheer。
E.L.は、ウェルカム・トラストと王立協会(107630/Z/15/A)が共同で資金提供するサー・ヘンリー・デール・フェローシップから資金提供を受けています。L.M.は、Sofinter - HR Welfare Programの支援を受けています。この研究は、ウェルカムトラスト(203151/Z/16/Z、203151/A/16/Z、215116/Z/18/Z)およびUKRI医学研究評議会(MC_PC_17230)によって全体または一部が資金提供されました。オープンアクセスの目的で、著者は、この提出物から生じる著者受理原稿バージョンにCC BY公開著作権ライセンスを適用しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5 mLインスリンシリンジ、29 G x 12.7 mmニードル | BD | 324892 | |
| 1 mLインスリンシリンジ、29 G x 0.5インチニードル | BD | 324827 | |
| 1.5 mLチューブ | フィッシャーブランド | 509-GRD-PFB | |
| 3 mLシリンジ | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 mL 丸底ポリスチレン試験管 セルストレーナーキャップ付き 12 x 75 mm | ファルコン | 352235 | FACS チューブ |
| 5 mL 丸底ポリスチレン試験管 スナップキャップ付き 12 x 75 mm | ファルコン | 352058 | FACS チューブ |
| 27 G 1/2" 針 | BD | ||
| 40 & マイクロ;50 mLチューブ用mセルストレーナー | Greiner Bio-one | 542040 | |
| 50 mLチューブ | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| 96ウェル丸底プレート | ファルコン | 351177 | |
| アルコールスワブ | VITREX MEDICAL A/S | ||
| BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer | BD | フローサイトメーター | |
| Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7 (Clone M5E2) | biolegend | 301814 | 1000分の1で使用 |
| CD19/Alexa 700 (Clone HIB19) | biolegend | 302226 | 300分の1で使用 |
| CD19/FITC (Clone HIB19) | biolegend | 302206 | 200分の1で使用 |
| CD3/APCCy7 (クローンHIT3a) | バイオレジェンド | 300318 | 100分の1で使用 |
| CD33/APC (クローンP67.6) | BD | 345800 | 200分の1で使用 |
| CD45/BV510 (クローンHI30) | バイオレジェンド | 304036 | 500分の1で使用 |
| CD45/PECy5 (クローン 2D1) | バイオレジェンド | 368526 | 300分の1で使用 |
| CompBeads 抗マウス Ig, κ/ネガティブコントロール補償粒子セット | BD | ||
| Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2) | BD | 340947 | 1000 |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| Isoflurane (IsoFlo 100% w/w 吸入蒸気、液体) | ゾエティス | 115095 | |
| マイクロベット 300リチウムヘパリンLH、300µL | Sarstedt Ltd | 20.1309 | マウス採血チューブ |
| NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウス | チャールズ川 | ||
| パンコールヒト、密度:1.077 g / mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco | 14190169 |
参考文献
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B.
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再版と許可
