方法論記事

Populus trichocarpaの樹皮の内生細菌および着生細菌マイクロバイオームの定量的評価のためのワークフロー

DOI：

10.3791/66318

⸱

2025年6月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、 Populus trichocarpaの樹皮に存在する内生細菌および着生細菌のマイクロバイオームをプロファイリングするためのサンプル収集からデータ解析まで、信頼性と効率性に優れたワークフローを提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物の表面や内部組織にコロニーを形成する微生物は、植物の成長と健康を促進する有益な機能を持っている可能性があります。しかし、木本植物の樹皮組織のマイクロバイオームに関する情報は、特に ポプラスの樹皮の内生細菌叢と着生細菌叢に関して、まだ限られています。この制限を克服するために、 私たちは、Populus trichocarpaの樹皮にコロニーを形成する内生細菌叢と着生細菌叢の組成と多様性を定量化するワークフローを確立しました。簡単に説明すると、 P. trichocarpa の茎の表皮を0.1%Tween 20に浸した綿球で繰り返し拭いて着生細菌サンプルを採取した。剥がした表皮を滅菌した後、液体窒素とビーズビーターを使用してそれぞれ凍結と粉砕を繰り返し、エンドファイド細菌サンプルを採取しました。綿付着した着生細菌群集と P. trichocarpaの破砕樹皮からゲノムDNAを抽出し、細菌の16S rRNA遺伝子の超可変V5-V7およびV4領域を標的としたプライマーによるプロイメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を行った。各エンドファイティックまたは着生サンプルから得られたPCR産物の3回の繰り返しを等濃度で混合してアンプリコンライブラリーを構築し、その後、配列決定しました。得られた配列は、配列スプライシング、品質フィルタリング、キメラ除去、および分類学的アノテーションによって分析されました。要約すると、16S rRNA遺伝子プロファイリングを通じて、 P. trichocarpa の樹皮の内生細菌および着生細菌のマイクロバイオームを決定するための、サンプル収集からデータ解析までの信頼性と効率的なワークフローを確立しました。これまでの研究で確立された樹皮にコロニーを形成する微生物叢を探索する方法とともに、私たちの方法論は、他の木本植物種、特に経済的に重要な森林樹木の樹皮マイクロバイオームを調査するためのプロトコルを設計するための青写真として役立つ可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

樹皮は木本植物の茎の最外層であり、師部と周皮1,2を含む維管束形成層の外側のすべての組織を指します。広範な研究により、樹皮は水と炭水化物の移動、火災や機械的損傷からの樹木の保護3、非生物的適応4および生物的ストレス5において極めて重要な役割を果たすことが示されています。さらに重要なことに、樹皮は樹木と周囲の空気との間のインターフェースとして、微生物のユニークな生息地としても機能します6。特に、樹皮関連微生物は、宿主の増殖を促進する機能7、樹木の栄養獲得を助ける機能8、植物ホルモンの合成を促進する機能9、植物病原体の感染から宿主を保護する機能5を持っていることが確認されています。しかし、樹皮にコロニーを形成する微生物群集には、フィロスフェアや根茎の微生物叢10,11に比べて、はるかに注意が払われていません。樹皮のマイクロバイオームの生物学的特徴に関する知識は限られています。本方法論論文の目的は、木本植物の樹皮の内生細菌および着生細菌マイクロバイオームの多様性と組成を説明するための一連のプロトコルを研究者に提供することです。

本研究で発表された樹皮微生物叢12,13の調査方法に基づいて、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング解析に基づく精巧なワークフローを設計し、試験して、木本植物生物学で使用される重要なモデル生物であるPopulus trichocarpaの茎樹皮の内部組織または表面に定着する細菌マイクロバイオームを探索した14。P. trichocarpaは、急速な成長15、実験的操作の比較的容易な16、および容易な遺伝的形質転換という特徴を持ち、また、木材生産17におけるその広範な応用でも知られている。具体的には、この研究で提唱された方法は、P. trichocarpaの茎樹皮の内生微生物叢および着生微生物叢のサンプリングの詳細な説明から始まります。本研究では、樹皮にコロニーを形成する微生物叢を採取した後、アルコールと次亜塩素酸ナトリウムで樹皮を表面殺菌する工程を含めることで、樹皮の内部構造に生息する微生物(エンドファイト)と樹皮の外面に生息する微生物(着生植物)を同時に別々に採取する手順を確立しました。私たちの知る限り、木本植物の樹皮マイクロバイオームに関する発表された研究の中で、樹皮の内部と外部のニッチの間になされた明確な区別に基づいて、同じ樹皮サンプルから収集された内生微生物群集と着生微生物群集に対するアッセイは行われていません18,19,20.このように、本研究で開発された手法により、研究者は樹皮に生息する細菌群集の多様性と組成を正確かつ包括的に調べることが可能となります。さらに、この研究では、ゲノムDNA抽出、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングライブラリーの準備21、およびシーケンシングデータ解析の手順について詳細に説明しています。特に、この研究では、細菌の16S rRNA遺伝子の超可変V5-V7領域を標的とする一対のプライマーを使用して、宿主植物のミトコンドリアおよび葉緑体配列の非特異的増幅を減少させました22、これにより樹皮関連マイクロバイオームの偏りのないプロファイルが得られました。α多様性は、生態学の研究で広く使用されている一般的な多様性指数であるシャノン指数23を使用して評価され、門レベルでの分類学的組成は、微生物生態学への定量的洞察(QIIME)24およびRソフトウェア25で計算および視覚化されました。私たちの方法論は、前の研究1,6で確立された樹皮にコロニーを形成する微生物叢を探索する方法とともに、他の木本植物種、特に経済的に重要な森林樹の樹皮微生物叢を研究するためのプロトコルを設計するための青写真として役立つ可能性があります。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.サンプル採取

  1. 生後3ヶ月のPを育てます。 成長チャンバー内のトリコカルパの苗木(21〜25°C、3バンド線形蛍光灯[T5 28 W 6400 K]、湿度60〜80%の補助光で16時間光/8時間暗サイクル、約300μEm-2 s-1)26。
  2. Pの10 cmの長さの茎の部分を切ります。 滅菌された剪定ばさみを使用して、滅菌された土壌表面(図1A)から2〜12cm 上のトリコカルパ。ステムセグメントを滅菌した正方形のペトリ皿(13 cm x 13 cm)に入れます。
    注:この研究では、同じサイズの6本の木が選択され、そのうち3本が各プライマーセットでのPCR増幅に使用されました。

2. サンプル処理

  1. 0.1% Tween 20に浸した滅菌綿棒を使用して、滅菌した正方形のペトリ皿で茎の表皮を繰り返し拭き、樹皮表面にコロニーを形成する微生物をより効率的に収集します(図1B)。
    注:亜湿潤滅菌綿は、茎の表面に付着した微生物を収集するために使用されます。茎の表面を拭くときは、乾燥しすぎたり濡れすぎたりする綿を使用しないでください。Tween 20は、表面張力を低下させることができる界面活性剤であり、植物表面からより多くの微生物サンプルを得るのに有益な特性である27,28。
  2. 滅菌ブレードを使用して綿棒から綿先を切り取り、着生微生物サンプルを含む各綿先を滅菌済みの1.5mL遠心分離チューブに入れます。サンプルは-80°Cで保存します。
  3. 茎の表面を拭いた後、着生微生物を採取した樹皮を滅菌メスで切り開き、樹皮を剥がして角のシャーレに置きます。
  4. ステップ2.3で茎から剥がした樹皮を滅菌メスで約1cmのセグメント(図1C)に切ります。
  5. セグメントを70%(v / v)アルコールに2分間浸して滅菌します。次に、セグメントを次亜塩素酸ナトリウム(有効塩素含有量2.5%)に0.1%Tween 80を添加したものに5分間浸します。
  6. ステップ2.5で得られたセグメントを70%(v / v)アルコール29中で30秒間滅菌します。次に、すべてのサンプルを滅菌蒸留水で3回洗浄し、清潔なベンチに置いて風乾します。
    注:樹皮サンプルは、滅菌ピンセットを使用して前後に攪拌され、十分な表面滅菌が確保されます。
  7. 表面滅菌した各ステムバークセグメント(エンドファイティックサンプル)を、-80°Cの滅菌2 mL遠心分離チューブに保管します。

3. ゲノムDNA抽出

  1. DNA抽出のためにサンプルを前処理するには、次の手順を実行します。
    1. ステップ2.7で得られた表面滅菌したステムバークセグメントを滅菌した5mL硬質チューブに入れ、滅菌したスチールビーズ(4mm)を3つ各チューブに加えます。
      注意: この手順は、微生物汚染を防ぐために、クリーンベンチで行ってください。ステップ2.2で調製したコットンボール(着生サンプル)は、前処理の必要がなく、ゲノムDNA抽出に直接使用されます。
    2. サンプルを含む硬質チューブを液体窒素で10分間凍結します。
    3. 樹皮サンプルをビーズビーターで5分間粉砕します。次に、硬質チューブを液体窒素で1分間凍結し、ビーズを叩くステップを5分間繰り返します。
  2. ゲノムDNAを抽出します。
    注:市販のDNA抽出キットを使用して、エンドファイティックおよび着生サンプルからゲノムDNAを単離します。
    1. Pの砕いた茎の樹皮を追加します 。 トリコカルパ と綿に付着した着生細菌群集(各0.25g)を各ビーズチューブに付着させた。次に、市販のキットから提供された溶液C1 60 μLを加え、反転して穏やかに混合します。
    2. 次に、ビーズビーターを使用して、1分間のランを4回行うことで、エンドファイティックサンプルと着生サンプルをホモジナイズします。各分析の後、サンプルを氷上に30秒間置きます。
    3. チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。
    4. 製造元の指示に従って、キット( 材料の表を参照)を使用して内生体および着生体サンプルを抽出します。
    5. 白色フィルターメンブレンの中心に30 μLの溶液C6を加え、25°Cで5分間インキュベートします。
    6. 10,000 x g 、室温で1分間遠心分離します。

4. PCR増幅

  1. 抽出したDNA濃度を標準化します。
    1. 着生サンプルおよびエンドファイティックサンプルから抽出したゲノムDNAの濃度を、微量分光光度計で測定します。
    2. 各DNAサンプルを滅菌ddH2Oで2 ng/μLに希釈して、PCR増幅用のDNAテンプレートを取得します。
  2. これらのDNAサンプルを増幅します。
    1. フォワードプライマー799F(5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3')およびリバースプライマー1193R(5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3')を用いて、細菌16S rRNA遺伝子のV5-V7領域を増幅する 10。フォワードプライマー515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')およびリバースプライマー806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')を用いて、細菌の16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅する 30。
      注:各サンプルから抽出されたゲノムDNAは、各トリプライテッドPCR増幅反応のテンプレートとして利用され、DNAを含まない追加の反応はネガティブコントロールとして設定されます。各サンプルについて、PCR反応混合物の容量は25μLです。プライマーペア799F/1193Rの場合、各反応には12 μLのPCR水、各F/Rプライマー1 μL(10 μM)、1 μLのDNAテンプレート、および10 μLの混合溶液が含まれています。プライマーペア515F/806Rの場合、各反応には12 μLのPCR水、各F/Rプライマー1 μL(10 μM)、1 μLのDNAテンプレート、および10 μLの混合溶液が含まれています。プライマーペア799F/1193Rを用いたPCR反応は、98°Cで5分間の初期変性、98°Cで30秒間、53°Cで30秒間、72°Cで45秒間の25サイクル、および72°Cで5分間の最終伸長のサイクル条件で実施します。プライマーペア515F/806Rを用いたPCR反応は、94°Cで3分間の初期変性、94°Cで45秒間、50°Cで60秒間、72°Cで90秒間の35サイクル、および72°Cで72°Cで10分間の最終延長というサイクル条件で実施されます。
    2. すべてのサンプルを完全に混合し、遠心分離して気泡を排除します。
    3. サーマルサイクラーで細菌の16S rRNA遺伝子のV5–V7またはV4領域の増幅を行います。
  3. 増幅された製品を検出します。
    1. 各アンプリコン5 μLを1%アガロースゲルにロードし、120 Vで30分間電気泳動を行います。
    2. UV光の下でゲルを観察し、PCR増幅の成功を検証します。プライマーペア799F/1193Rおよび515F/806Rで得られるPCR産物のサイズは、それぞれ約430 bpおよび400 bpである必要があります。

5. アンプリコンシーケンシングライブラリーの調製

  1. 増幅された製品を混合し、その濃度を決定します。
    1. PCRチューブ内の各サンプルについて、PCR増幅の3回の繰り返しから生成された製品を混合します。
    2. キットの製造元の指示に従って、5 μL の PCR 産物と 195 μL のワーキング溶液を 96 ウェルマイクロプレートのウェルに加えます ( 材料の表を参照)。次に、標準DNA(キットの濃度が0、5、10、20、40、60、80、100 ng/μLのDNA試薬)10 μLと190 μLのワーキング溶液を同じマイクロプレートのウェルに加えます。このステップに続いて、PCR産物と標準DNAの蛍光強度を決定します。
    3. マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。
      注:標準フルオレセイン波長の励起/発光は、各サンプル中の二本鎖DNAの量を測定するために480/530nmに設定されています。
    4. 標準DNA溶液の標準DNA濃度(0、5、10、20、40、60、80、100 ng/μL)と各標準DNA溶液の蛍光強度を使用して、DNA濃度と蛍光強度の標準曲線を確立します。各PCR産物の蛍光強度値を標準曲線に代入して、PCR産物のDNA濃度を計算します。
  2. アンプリコンシーケンシングライブラリを構築します。
    1. ステップ5.1.4で検出した濃度に従って、同じプライマーペアで増幅した残りのPCR産物を等濃度で混合し、アンプリコンシーケンシングライブラリーを構築します。
      注:蛍光強度を測定することにより二本鎖DNAの濃度を定量するために使用される各サンプルのPCR産物の画分は、同じサンプルの残りのPCR産物から構築されるアンプリコンシーケンシングライブラリに含まれていません。
  3. ゲル抽出を行います。
    1. 電気泳動装置を用いてアガロースゲル電気泳動を行います。簡単に説明すると、1.3%アガロースゲル(すなわち、1 x TAEバッファー100 mLに1.3 gのアガロース粉末)を調製します。
      注:ゲル内のウェルの量が各PCR産物とDNAラダーを保持するのに十分であることを確認するように注意する必要があります。この研究では、1.3 gのアガロース粉末を1 x TAEバッファー100 mLに溶解することにより、1.3%アガロースゲルを調製します。
    2. ゲル固化後にコームを取り外し、1 x TAEバッファーを入れた電気泳動タンクにゲルを置きます。次に、6 x オレンジ色のローディングバッファー 1 容量単位を各 PCR 産物の 5 容量単位に加え、後者 100 μL を各ウェルにロードします。30 μLのDNAラダーを1つのウェルに加えます。プラス線とマイナス線を接続した後、80Vで50分間電気泳動を行います。
      注:この研究では、プライマーペア515F / 806Rまたは799F / 1193Rでそれぞれ増幅された400 bpまたは430 bpのバンドで表されるアンプリコンシーケンシングライブラリを精製するためにゲル抽出が使用されます。
    3. アガロースゲルからDNA断片を、清潔で鋭利なメスを用いて切除します。
    4. ゲルスライスを秤量し、無色のチューブに移します。緩衝液を添加してゲルスライスを浸します。
      注:スピンカラムあたりのゲルの最大量は400 mgです。所与のゲルスライスの1容量単位に3容量単位のバッファーを添加します。
    5. 製造元の指示に従って、ゲル抽出キット( 材料表を参照)を使用してゲル抽出を行います。
      注:エンドファイティックおよび着生細菌群集のシーケンシングに使用される細菌16S rRNA遺伝子を標的とするPCRの産物から構築されたアンプリコンライブラリーは、この方法を使用して得られます。
  4. 精製したアンプリコンシーケンシングライブラリーの品質を確認します。
    1. ステップ5.3.5で得られた精製アンプリコンシーケンシングライブラリー中の二本鎖DNAの濃度を、市販のキット( 材料表を参照)を使用して蛍光光度計で測定します(図2)。
    2. ステップ 5.3.5 で得られたアンプリコンシーケンシングライブラリーの標的 DNA フラグメントサイズを決定するには、市販のチップおよびキット ( 材料表を参照) を備えた核酸品質管理分析システムを使用して、メーカーのプロトコルに従います。
      注:フラグメントサイズが予想範囲内にあり、アンプリコンシーケンシングライブラリにプライマーダイマーがないことを確認してください。
    3. ステップ 5.3.5 で得られたシーケンシングライブラリーの有効濃度は、メーカーのプロトコールに従って市販のキット( 材料表を参照)と定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用して決定します。
    4. アンプリコンシーケンシングライブラリーを希釈して、シーケンシングプラットフォームに推奨されるローディング濃度を満たします。

6. シーケンス処理と統計解析

  1. ステップ5.4.4で得られたアンプリコンライブラリーのシーケンシング後、シーケンシングプラットフォーム( 材料表参照)31。作業ディレクトリに emp-paired-end-sequences という名前のフォルダを作成し、このフォルダに圧縮されたシーケンシング ファイルを fastq 形式で保存します。次に、Ubuntuを開き、conda環境とQuantitative Insights into Microbial Ecology 2(QIIME2)(v2021.2)32をアクティブにします。
  2. マッピングファイルを作成し、テキストファイルとして保存します。ファイルの内容を 表 2 に示します。
  3. amplicon シーケンシングライブラリで取得したシーケンシングデータを分割し、マッピングファイルを使用してシーケンシングデータからプライマーを除去します。
    1. 次のコマンドを使用して、シーケンスデータを分割します: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. 次のコマンドを使用してプライマーを削除します: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F or 515F --p-front-r 1193R or 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. DADA2パイプライン33を使用して、キメラをスクリーニングして除去します。フィルタリングされた配列を 99% の類似性でアンプリコン配列バリアント(ASV)にクラスター化します。
    1. 次のコマンドを使用して、キメラとクラスター シーケンスを ASV にスクリーニングして削除します: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. 参照配列34に基づいて、SILVAデータベース(v138)を使用して分類学的アノテーションを作成する。
    1. 次のコマンドを使用して、ステップ 6.4 で取得した ASV に注釈を付けます: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. 次のコマンドを使用して、QIIME2 (v2021.2) で ASV テーブルを作成します。
    qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomy --sc-separated taxonomy
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key 分類法
    注 : これらのコマンドは、各サンプルのすべての ASV の読み取り数を含むテーブルを生成します。
  7. ASVの数を計算し、プライマーペア799F/1193Rと515F/806Rで生成された内生細菌群集と着生細菌群集を読み取ります。
    1. ステップ6.6で取得したASVテーブルの各サンプルで、それぞれ門、クラス、順序、科、属のレベルで≥1の読み取りを持つASVの総数をカウントして計算します。
    2. ステップ6.6で求めたASVテーブル内のすべてのASVのリード数の合計をカウントして、各サンプルの合計リード数を算出します。
    3. ステップ6.6で取得したASVテーブルで葉緑体またはミトコンドリアとして注釈が付けられたASVのリード数を使用して、各サンプルの植物リード数をカウントして計算します。
    4. 次の式を使用して、各サンプルの細菌読み取り数を計算します。
      バクテリアリードの数 = 総リード数 − 植物リードの数。
    5. Excel(2019)およびPrism(v8.0)ソフトウェアを使用して、プライマーペア799F/1193Rおよび515F/806Rによって生成されたエンドファイティックおよび着生細菌群集の平均ASV(それぞれ門、クラス、目、科、属のレベル)または読み取り(それぞれ植物と細菌の合計)を計算して視覚化します。
    6. Prism(v8.0)ソフトウェアのスチューデントt検定を使用して、プライマーペア799F/1193Rおよび515F/806Rで生成されたASV(それぞれ門、クラス、順序、科、属のレベル)またはリード(それぞれ植物と細菌の合計)の数の違いの有意性を評価します。
  8. 次のコマンドを使用して、葉緑体とミトコンドリアとして注釈が付けられたリードをフィルタリングします: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. 次のコマンドを使用して系統樹を作成します: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. R(v4.0.5)35のQIIME2(v2021.2)および「ggplot2」パッケージを使用して、内生細菌群集および着生細菌群集のシャノン指数で表されるアルファ多様性を計算して視覚化します。
    1. 次のコマンドを使用して、アルファの多様性を計算します: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth すべてのサンプルの中で最も低い読み取り値 --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. 内生細菌群集と着生細菌群集の門レベルでの集団の相対的な存在量を計算します。QIIME2 (v2021.2) の次のコマンドを使用して、「taxa-bar-plots」という名前の qzv 形式のファイルを生成します: time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. taxa-bar-plots.qzvファイルをオンラインで開きます https://view.qiime2.org/。新しく生成されたファイルを level2 からダウンロードして保存します。相対存在量は、R(v4.0.5)を使用して次の式で計算します。
      各細菌門の相対存在量 (%) = (各サンプル中の各細菌門の読み取り数 / 各サンプルの合計読み取り数) x 100 %
      R (v4.0.5) の ggplot2、RColorBrewer、reshape、ggalluvial パッケージを使用してデータを視覚化します。
  12. プライマーペア799F / 1193Rで配列決定された内生細菌群集および着生細菌群集における優性門(相対存在量が> 0.5%の門として定義される)のそれぞれの相対存在量との間の差の有意性を分析する STAMPソフトウェア36のテューキーの事後検定による一元配置分散分析(ANOVA)を使用して。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pの樹皮の内生細菌および着生細菌マイクロバイオームの高品質ゲノムDNA。 トリコカルパは、最適化されたプロトコルを使用して取得しました(表1)。12 個のサンプルすべての PCR 増幅により、正しいサイズの 1 つの強いバンドが得られました(図 3)。799F/1193Rおよび515F/806Rの両プライマーペアは、エンドファイドまたは着生の樹皮組織サンプルからそれぞれ約400 bpおよび430 bpで標的産物を増幅することに成功しました。アンプリコンライブラリーは、シングルピーク、適格なDNAフラグメントサイズ、プライマーダイマーなし、濃度22.16 nM、容量100 μLでさらに構築され、プレシーケンシングの要件を満たしました(図4)。

シーケンシングプロファイリングにより、P. ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

樹皮微生物叢を調査するための公開された方法論から開発された7,18、私たちが提案したワークフローは、木本植物の樹皮の内生微生物叢と着生微生物叢を特定および特徴付けるための一般的なガイダンスを提供します。この方法は、サンプルの収集と処理、ゲノムDNA抽出、PCR増幅、アンプリコンシーケンシングライブラリの調製、およびシーケンシングデータ解析のプロトコルで構成されており、木本植物種の樹皮マイクロバイオームを研究するためのプロトコルを設計するための潜在的な青写真として機能します。

樹皮マイクロバイオーム研究における共通の問題は、樹皮の着生微生物サンプルと内生微生物サンプルの区別が見落とされがちであるという点で、収集アプローチです1。これにより、木本植物の樹皮における着生微生物叢と内生微生物叢の組成と機能についての理解が制限されています。提案されたプロトコルで...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ビデオナレーションを提供してくださったDavid Anthony Atherton氏と、貴重なアドバイスを提供してくださったB.N.ラボのメンバーに感謝します。本研究は、中国国家科学基金会(グラント番号32071741[BNへ])、新疆ウイグル自治区におけるKey R&D Plan Projects(グラント番号2022B02014)、"Tianchi Talents" Introduction Plan(BNへ)、National Key R&D Program of China(グラント番号2021YFD2200203[gqへ])、およびNational Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University)(グランパレント番号2019A01[BNへ])の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器:
ビーズビーターDHS ライフサイエンス401265
1.5 mLチューブ用遠心分離機Thermo Scientific75002440
PCRチューブ
マイクロプレートリーダーBioTek8040528
NanodropDHS Life Science &テクノロジー株式会社2010/2020 マイクロボリューム分光光度計
Qubit 3.0蛍光光度計 invitrogenQ33216光光度計 
冷蔵庫(-80)パナソニックヘルスケア株式会社17060107
T100 サーマルサイクラーBio-Rad1861096マルサイクラー
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313電気泳動用
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625ライブラリ DNA フラグメント分布検出、核酸品質管理分析
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694定量ライブラリ
Illumina Novaseq6000Illumina ライブラリシーケンシング
材料:
手袋任意のNA
エアロゾルバリアチップ10μLAxygenTF-300-R-S
エアロゾル バリア チップ 20μLAxygenTF-20-R-S
エアロゾル バリア チップ 200μLAxygenTF-200-R-S
エアロゾル バリア tipr 1000μLAxygenTF-1000-R-S
遠心分離管 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96 ウェル ブラック/クリア フラットボトム マイクロプレートCorning3631
コットンスティックZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil キットQIAGEN 12888-100DNA 抽出酵
素フリー遠心分離管用 1.5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
エタノール永達化学試薬株式会社64-17-5
ハードチューブ (5 ml)DHS ライフサイエン0401261-17
ホットマスターミックス Quanta Bio2200400
微量遠心分離管 2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR 水QIAGEN 17000-10
QIAquickゲル抽出キット QIAGEN28704ゲル抽出用
Quant-iT dsDNA アッセイキット、広範囲InvitrogenQ33130増幅生成物および精製アンプリコンライブラリーの濃度測定用
正方形のシャーレChangde Bkman Biotechnology Co.,Ltd110301014
スチールビーズShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.YXB36985
亜塩素酸ナトリウム溶液天津北連ファインケミカル開発有限公司 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
デュアルプロトコル DNA ハイセンス試薬キットPerkinElmerCLS760672DNA ライブラリ検出
VAHTS ライブラリ定量キット イルミナ用Vazyme Biotech Co., LtdNQ104定量ライブラリ
用遠心分離機蛍サー天津ス 次

参考文献

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