方法論記事

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

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DOI:

10.3791/66381

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2024年2月16日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

この記事について

サマリー

概日リズムは、ほとんどの生物に存在し、生物学的プロセスの時間的組織を調節しています。3Dオルガノイドは、最近、生理学的に重要な in vitro モデルとして浮上しています。このプロトコルでは、オルガノイドの概日リズムを観察するための生物発光レポーターの使用について説明し、多細胞系の概日リズムの in vitro 調査を可能にします。

要約

ほとんどの生物は概日リズムを持っていますが、これは約24時間以内に発生する生物学的プロセスであり、睡眠覚醒サイクルから代謝に至るまでの細胞および生理学的プロセスの多様なレパートリーを調節しています。この時計のメカニズムは、環境の変化に基づいて生物を同調させ、分子的および生理学的事象の時間的調節を調整します。これまでに、NIH3T3線維芽細胞などの細胞株を用いて、1細胞レベルでも自律的な概日リズムが維持されることが実証され、概日リズムのメカニズムの解明に役立った。しかし、これらの細胞株は、多細胞性や堅牢な細胞間コミュニケーションを欠く均質な培養物です。過去10年間で、in vivoの形態学的構造と機能に類似したin vitro多細胞システムである3Dオルガノイドの開発、特性評価、および応用に関する広範な研究が行われてきました。この論文では、ヒト腸腸エンテロイドの生物発光レポーターを使用して概日リズムを検出するためのプロトコルについて説明し、これにより、in vitroで多細胞系の概日リズムを研究できます。

概要

概日時計
バクテリアから哺乳類まで、すべての生物は環境と複雑でダイナミックな関係を持っています。この関係の中で、環境変化への適応は生物の生存にとって重要です。ほとんどの生物は概日リズムを持っており、これにより約24時間の日周周期に機能を適応させ、最適化することができます。概日時計は、中央時計と周辺時計の階層的なネットワークであり、生理学的恒常性を維持し、生物を日々の変化と同期させるために協力して機能します1,2。哺乳類では、視交叉上核(SCN)に位置する中心時計またはマスタークロックは、光などの外部手がかりを受け取り、神経および体液性シグナル伝達経路の高度な相互作用を介して情報を末梢時計に伝達します3。中央時計に加えて、末梢組織は、組織特異的な時計制御遺伝子(CCG)4,5を調節する転写翻訳負フィードバックループ(TTFL)によって維持される独自の細胞自律的な概日時計メカニズムを持っています。この分子機構は、遺伝子発現、シグナル伝達経路、免疫応答、消化などの細胞および生理学的イベントにおいて、約24時間のリズム性を生み出します。概日時計は、ほとんどすべての哺乳類細胞に存在し、遺伝子の発現パターンの最大50%が概日リズムを示すことが実証されています6。CCGの豊富さを考慮すると、このクロックメカニズムの混乱は重大な生理学的問題を引き起こす可能性があります。したがって、概日リズムの研究は、本質的な生物学的メカニズムを解明し、新しい治療戦略を開発するために必要です。

ルシフェラーゼレポーターシステム
概日研究では、遺伝子発現やタンパク質レベルの時間的変化を追跡できるため、細胞の挙動や応答をより深く理解するためには、リアルタイムのモニタリングが重要であり、概日時計によって制御される分子メカニズムに関する洞察を得ることができます。さらに、リアルタイムモニタリングにより、研究者は環境変化が分子メカニズムに及ぼす影響を研究することができます7,8。遺伝子発現やタンパク質レベルを経時的に追跡するために広く使用されている生物発光アッセイなど、リアルタイムモニタリング研究には数多くの手法があります。生物発光アッセイは、光の生成を読み取り値として生物学的プロセスを検出する方法です。このアッセイでは、生物発光を産生する酸化酵素(ルシフェラーゼなど)を一過性または安定的に目的の細胞にトランスフェクトし、生物発光の読み出しを基質(ルシフェリンなど)の存在下で経時的に測定します。例えば、ルシフェラーゼ酵素は、ATP9の存在下で基質ルシフェリンを酸化することにより生物発光を産生する。その短い半減期、3-4時間10のために、ホタルルシフェラーゼは、最小限のバックグラウンドノイズ11,12,13でリアルタイムの動的モニタリングを提供するという点で概日研究のための強力なツールである。ルシフェラーゼタグ付きプロモーターまたはオープンリーディングフレーム(ORF)によるDNAの挿入には、レンチウイルス遺伝子導入システムが、高い形質導入効果、安定した統合、および低い免疫原性を提供する信頼性の高い方法です。生物発光レポーターの安定的な形質導入は、分裂細胞と非分裂細胞で強力な発現を提供し、概日研究のための一貫したデータを生成します14。

モデルとしてのオルガノイド
従来の不死化二次元細胞株は、概日リズムの基本的な分子メカニズムの解明から薬物スクリーニングまで、生物学的研究に役立ってきました。均質化された細胞株を利用するのは便利であるにもかかわらず、多細胞構造や細胞間相互作用を欠いています。対照的に、オルガノイドは、in vivo組織構造および幹細胞、前駆細胞、分化細胞タイプなどの多細胞性と類似性を示すことにより、皿内の臓器構造を模倣するin vitro 3D多細胞「臓器様」構造である15,16。自己組織化、多細胞性、および機能的特徴を有するオルガノイドは、実際の組織で発生する細胞および生理学的プロセスを表す注目すべきin vitroモデルである17。オルガノイドの異なるタイプは、指向性分化を介して多能性幹細胞から、または小腸、脳、肝臓、肺、腎臓などの様々な器官から採取された成体幹細胞から得ることができる18,19。オルガノイド構造は、多細胞性と動的な細胞間相互作用を伴う実際の組織様構造と機能を備えているため、in vivo組織で発生する細胞イベントを理解するには、均質化された細胞株よりも優れています。オルガノイドはまた、容易に操作でき、制御された条件下で成長させることができるため、概日研究に有用である20。

この研究の主な目的は、多細胞3Dオルガノイドの概日リズムを研究するために特別に調整された生物発光アッセイを利用したリアルタイムモニタリング方法を紹介することです。生物発光アッセイ技術を用いた細胞イベントのリアルタイムモニタリングは、実際の組織に存在する多細胞の複雑さや細胞間コミュニケーションを欠く細胞培養に対して広く行われています。3Dオルガノイドは、 in vitroで多細胞系の概日リズムの機能を調べるユニークな機会を提供します。例えば、細胞組成が変更されたオルガノイドや、患者の疾患組織に由来するオルガノイドの概日リズムを調べることができます。このプロトコルにより、生物発光アッセイを利用して、より生理学的に関連性の高い in vitro モデルであるオルガノイドで概日リズムのさまざまな側面を調査することができ、末梢臓器における概日リズムの役割をよりよく理解するのに役立ちます。

プロトコル

HIEsの生成にヒト組織を用いたすべての実験は、CCHMC(IRB#2014-0427)のIRBによって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

注:このプロトコルで概説されている手順を説明するために、 Bmal1-luc ヒト腸腸エンテロイド(HIE)を利用しました。これらのエンテロイドは、ルシフェラーゼに融合したBmal1プロモーターを含むpABpuro-BluFレポータープラスミドを用いて安定なレンチウイルス形質導入22 を受け、 Bmal1 プロモーター21の活性を示した。

1. レンチウイルス形質導入

  1. HIEsの幹細胞が豊富な条件下でレンチウイルス形質導入22 を実施します。具体的には、腸管増殖培地での通過後3〜4日以内にHIEでのスフェロイドの形成を確実にし、幹細胞が豊富な状態を作り出します。
  2. レンチウイルス形質導入22後、2μg/mLのピューロマイシンを用いて抗生物質の選択を行い、ピューロマイシン耐性HIEを回収し、それらを比較的高い密度(すなわち、1ウェルを2ウェルに)で2〜3倍に代入する。HIEの成長速度が遅い場合は、10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)および10 μM GSK-3阻害剤(CHIR-99021)を腸オルガノイド増殖培地に加えます。

2. 生物発光アッセイ用オルガノイドの調製

  1. 1日目:HIEを35mmの丸い皿に通過します。
    1. 簡単に言うと、HIEを拡大するには、HIEを成長因子低減(GFR)3D培養マトリックスと混合し、ウェルあたり10μLの3D培養マトリックスの液滴を3つ含む24ウェルプレートに播種します。HIE増殖培地350μLを加え、1日おきに交換してください。
      注:3D培養マトリックス中のHIEの密度は、エンテロイドの増殖に重要です。おおよそ、スフェロイドの数は各液滴で50を超える必要があります。数値が小さい場合、HIEの成長率は悪影響を受けます。
    2. HIEが十分に成長したら(継代後約7日後)、4つのウェルからHIEを1.5 mLの微量遠心チューブに回収します。
    3. 卓上型ミニ遠心分離機(2,000 × g)を使用して、40秒間のクイックスピンでHIEを冷たくしたPBSで洗浄し、ピペットで破片や過剰な3D培養マトリックスを除去します。
    4. 0.5 mLの冷たいPBSをペレットに加え、1 mLのインスリン注射器で最大10回シリンジしてHIEを解離することにより、物理的な乱流を適用します。
    5. ステップ2.1.3のように、解離したHIEをベンチトップミニ遠心分離機でスピンダウンし、ピペットで上清を静かに除去します。次に、HIEペレットを入れた微量遠心チューブを氷上に置いて、約3分間冷却します。
    6. GFR 3D培養マトリックスを微量遠心チューブに加え、HIEペレットと混合します。
      注:実験に使用する35 mmの丸皿の数に基づいて、3D培養マトリックスの量を計算します。通常、ラウンドディッシュあたり30 μLの3D培養マトリックス液滴を播種します。
    7. HIEと3D培養マトリックスの混合物を35 mmの丸型ディッシュの中央に播種し、ディッシュを37°Cで20分間インキュベートして、3D培養マトリックスを固めます。
      注: 播種 HIE の密度は、実験的に決定する必要があります。生物発光の強度に基づいて、このプロセス中のHIEの数を決定できます。
    8. 各ディッシュに2 mLの温めた腸オルガノイド増殖培地を加え、次のステップまでディッシュをCO2 インキュベーターでインキュベートします。
  2. 3日目:差別化の開始
    1. HIEの分化を開始するには、増殖培地を取り出し、予熱した分化培地2 mLを追加します。
      注:HIE分化培地23のレシピについては、表1を参照してください。
  3. 4日目:追加のプロセスは必要ありません。
  4. 5日目:エンテロイドの培地を2mLの予熱分化培地と交換します。
  5. 6日目:クロック同期と生物発光の記録
    1. エンテロイドの分子時計を同期させるには、2 μL の 100 μM デキサメタゾン (Dex) を添加して各ディッシュの最終濃度を 100 nM にした後、ディッシュを CO2 インキュベーター (37 °C、5% CO2) で 1 時間24 インキュベートします。
    2. Dexのリセット中に、インキュベーションルミノメーターを準備します。インキュベーションルミノメーターのCO2 と温度を確認し、それぞれ5%と37°Cに設定します。
      注:インキュベーションルミノメーターの内部を70%アルコールで拭くことをお勧めします マシンの使用前と使用後に毎回、無菌状態に保つために。
    3. クロック同期後、200 μM D-ルシフェリンを含む予熱した分化培地 3 mL をエンテロイドに補充します。
      注:ルシフェリンは光に敏感であるため、ルシフェリン含有培地をホイルで包み、皿に塗布する前に37°Cの熱浴で予温する必要があります。
    4. インキュベーションルミノメーターの8ウェルディッシュテーブルにディッシュを置き、サンプルディッシュテーブルを蓋で覆います。湿ったティッシュまたはスポンジを入れた2つの加湿器チャンバーをサンプルディッシュテーブルの上部に置きます。これは 1 回限りのプロセスです。
      注:実験を開始した後、実験が終了するまで、インキュベーションルミノメーターの蓋を閉めておく必要があります。ティッシュ/スポンジを十分に濡らしてください。
    5. 機械の蓋を閉め、希望の日数と分解能で生物発光を測定するプログラムを開始します。
      1. ソフトウェアで、[ 条件 ]タブをクリックして条件設定を選択し、このパネルで設定(皿の数、測定時間、バックグラウンド処理、フィルタータイプ)を調整します。
        注:このデモンストレーションでは、AからHまでのすべてのディッシュを選択しました 。デフォルトの測定時間は、ディッシュの数に基づいてソフトウェアによって決定されます。バックグラウンド処理の待機時間、 およびフィルターの種類 F0。3つのフィルターオプションがあるため、3つの発光色を同時に測定できます。
      2. 実験に基づいて適切な設定をすべて入力した後、[ OK]をクリックして設定を保存します。
      3. 実験の実行を開始するには、[ 実行 ] タブ | スタート ボタン(緑色の三角形のアイコン)。未加工のデータを未加工、ノイズフィルタリング済み、またはトレンド除去したものとして観察するには、実験の実行中にソフトウェアの画面上部で適切な選択を行います。 「Raw」、「Noise Filtered」、 または「 Detrended 」タブをクリックして、選択したデータを観察します。
      4. 最大5日間信号を観察します。
        注:インキュベーションルミノメーターで5日間モニタリングした後、培地の枯渇によりエンテロイドが死滅し始めることがあります。実験中に起こりうる概日リズムの乱れを防ぐため、実験期間中は培地交換は行いません。
      5. 実験の最後に、[停止] ボタン (青い四角いアイコン) をクリックして実行を停止し、[ファイル] タブに移動して [名前を付けて保存] をクリックします。データを Kronos 形式で保存します。[ファイル]セクションでデータをスプレッドシートにエクスポートするには、[ファイル]オプションをクリックし、[ファイル]の下の[Excel形式でエクスポート]を選択して、さらに分析します。

結果

生物発光記録は、腸管オルガノイド増殖培地を用いた幹細胞濃縮条件(図3)と、腸オルガノイド増殖培地を分化培地に置き換えることで達成された分化誘導条件の2つの異なる条件下で、ヒト腸腸内エンテロイド(HIE)の概日リズムを評価するために行われました。実験当日は、100 nMのデキサメタゾンで1時間処理を行い、概日時計を同期させました。その後、培地を3 mLの腸管オルガノイド増殖培地または200 μM D-ルシフェリンを添加した分化培地に交換し、生物発光活性のモニタリングを開始しました。4-5日間の記録期間を経て、観測された概日リズムの周期を決定するために、Fast Fourier Transform(FFT)解析を行いました。 図3 は、前述の条件での Bmal1 プロモーター活性の時間的ダイナミクスを示しています。分化条件下では、 Bmal1-luc 生物発光は平均周期22.92時間という強い概日振動を示しました。対照的に、HIEは幹細胞が豊富な条件下で概日リズムの乱れを示しました(図3)。これらのデータは、幹細胞が豊富な条件のHIEは、強い概日振動を示さないことを示しています。言い換えれば、オルガノイドの概日時計依存的な機能を調べる前に、概日リズムに関する成長条件の影響を評価する必要があります。

figure-results-1
図1:プロトコルの概略図。 HIEを1日目に35 mm皿に継代し、2 mLの増殖培地で3日目まで培養します。通過後3日目に、培地を2mLの予熱分化培地と交換して、エンテロイドの分化を開始します。栄養の枯渇を防ぐために、5日目に2mLの予熱培地で培地の変更を繰り返します。6日目に、エンテロイドを100 nMデキサメタゾンで1時間治療し、概日時計の同期を行います。1時間後、培地を3mLの200μMのD-ルシフェリン含有培地と交換し、皿をインキュベーションルミノメーターに設置します。生物発光発現を4〜5日間記録した後、実験を終了し、生成されたデータをスプレッドシートとしてエクスポートしてさらに分析します。略語:HIE=ヒト腸腸エンテロイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:成長培地下のHIEの代表的な画像。 画像は、25倍の対物レンズを備えた広視野顕微鏡で撮影されました。スケールバー= 1 mm。略語:HIE=ヒト腸腸エンテロイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:幹細胞濃縮および分化条件でのHIEからの生物発光記録。(A)幹細胞濃縮(赤)および分化(黒)条件下でのBmal1-luc HIEの生および(B)トレンド除去生物発光記録データ。(C)分化条件下でのHIEsにおけるBmal1-luc振動の周期。期間はFFT分析で計算されます。幹細胞濃縮条件下でのBmal1-luc HIEsではn = 3、分化条件下でのBmal1-luc HIEsではn = 4です。エラーバーはSDを示します。略語:HIE =ヒト腸内エンテロイド;FFT = 高速フーリエ変換。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

差別化メディアレシピ
試薬名会社カタログ番号最終濃度コメント
アドバンスドDMEM/F12ライフテクノロジー12634-028最後のコンポーネントとして追加します。50 mL 培地を調製する場合は、他のすべての成分を添加した後、残りを 50 mL まで充填し、最後に Advanced DMEM/F12 を充填します。
Aの83から01シグマ・アルドリッチSML0788500 nM
B-27 サプリメント (50x)ギブコ17504-0441倍
ガストリンI人間シグマ・アルドリッチG9020の10 nM
グルタマックスギブコ350500611倍
ヘープスギブコ1563008010 mM
N-2サプリメント(100x)ギブコ17502-0481倍
N-アセチル-L-システインシグマ・アルドリッチA9165の1 mM
NOGGINコンディショニングミディアム5%ラボで作られました
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15140122100 U/mL
組換えマウスEGFペプロテック315-0950 ng/mL
R-SPONDINコンディショニングメディウム10%ラボで作られました

表1:HIE分化媒体の組成23。

ディスカッション

生物発光アッセイは、長期の経時的実験からのデータ収集を必要とする概日リズムの研究にいくつかの利点を提供します。まず、研究者は細胞が移動および増殖する際の遺伝子発現または目的のタンパク質を監視できます。不必要な調整を行ったり、細胞の機能を中断したりすることなく、バイオルミネッセンスリードアウトを使用して関心のある細胞イベントや遺伝子発現を記録でき、信頼性の高いリアルタイムデータが得られます。重要なことに、生物発光アッセイは、一定の暗闇25で行われるため、蛍光アッセイと比較して最小限のバックグラウンドノイズを生成する。さらに、蛍光アッセイのための数日間にわたる連続的な励起は、高い光毒性および光退色を引き起こす可能性があるため、生物発光アッセイは長期モニタリングに好ましい。しかし、光励起がないため、生物発光アッセイは蛍光タンパク質26よりも暗いシグナルを提供する。ルシフェラーゼの半減期が短いため、概日研究に好適であり、さらに不安定化配列を追加することでさらに短縮することができる12。

生細胞モニタリングにはいくつかの利点がありますが、生物発光アッセイにはいくつかの制限があります。生物発光アッセイは、細胞集団からの経時的な遺伝子発現またはタンパク質モニタリングのための堅牢な読み出しを提供しますが、その空間分解能には限界があり、単一細胞からタンパク質局在データを収集する実験には適していません。その長所と短所を考慮すると、生物発光アッセイは、特に概日研究において、他の方法よりも優れています。毒性が少なく、感度が高いため、長期モニタリングに最適です。

実験準備段階では、いくつかの重要な要素を考慮する必要があります。主に、レンチウイルス形質導入のための適切な選択戦略の実施が重要です。私たちの場合、2 μg/mL のピューロマイシン選択を 2 週間行いました。選択の実行が不十分な場合、レポータープラスミドを保有するエンテロイドの数が不足し、ルシフェラーゼの発現レベルが一貫していない可能性があります。最適な播種密度も同様に重要です。密度が高すぎると、生物発光記録の開始後に培地の置換がないため、実験中に栄養分が早期に枯渇する可能性があります。逆に、HIEの密度が低いと、生物発光出力が低下し、読み出しの堅牢性に影響を与える可能性があります。モニタリング中にエンテロイドに適した環境を確保することは、実験結果の信頼性にとって基本です。CO2、温度、湿度レベルなどの最適な条件を維持することは、HIEの維持にとって重要であり、エンテロイド内の細胞プロセスの堅牢性を促進します。最適な温度とCO2 レベルからの逸脱は、細胞代謝とシグナル伝達経路に影響を及ぼし、概日リズムに影響を与える可能性があります。適切な湿度レベルも同様に重要であり、乾燥を防ぎ、エンテロイドの構造的完全性を維持します。したがって、環境条件に細心の注意を払うことは、実験モデルの精度とエンテロイドを含む概日研究にとって重要です。

クロック同期は、個々の細胞の内部概日時計を整列させ、それらが統一された調整された状態にあることを確認するため、概日研究に不可欠です。この同期は、文化全体のレベルでの概日リズムの正確な観察と分析に必要です。このプロトコルでは、100 nM デキサメタゾン (Dex) とのクロック同期を行いました。Dexが細胞の構造や機能に及ぼす影響について、いくつかの懸念があるかもしれません。以前の研究では、コルチコステロイドがエンテロイドの上皮バリア機能を強化することが示唆されています27。ただし、この表現型は、エンテロイドを10μMプレドニゾロンで12時間処理した後に観察されることを強調することが重要です。デキサメタゾンの1時間の短い治療は、エンテロイド内の細胞の構造と機能に関して有意な変化を引き起こさないと予想しています。

オルガノイド培養物の生物発光活性を相同な単一細胞培養物ではなくモニターすることは、独自の強みを持っています。まず、オルガノイド培養ではin vivo 組織と同様に複数の細胞タイプが相互に作用しますが、一般的な2D細胞培養では、単一の細胞タイプからなる一種の単離された環境で関心のある遺伝子発現をモニターします。オルガノイド培養は、多細胞相互作用とシグナル伝達経路により、より現実的な結果を提供します。細胞間相互作用は、特に分化および細胞間経路の研究にとって重要であり、不均一な細胞培養が必要です28。その結果、分化した状態のHIEは、幹細胞が豊富な状態では強い概日振動を示すが、概日リズムが乱れていることが示されています。これらのデータは、概日時計機構が成体幹細胞から分化細胞にリモデリングされる可能性を示唆している。要約すると、概日生物発光レポーターを持つオルガノイドは、多細胞 in vitro システムにおける概日リズムの研究を可能にし、より生理学的に関連性のある方法で概日リズムの機能を明らかにすることができます。

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

ヒト腸腸内エンテロイドは、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)のマイケル・ヘルムラス博士の研究室から入手しました。この研究は、R01 DK11005(CIH)およびシンシナティ大学がんセンターパイロット資金の支援を受けました。University of Cincinnati Live Microscopy Core(NIH S10OD030402)からのイメージングサポートに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021ケイマン ケミカル13122GSK-3 阻害剤
デキサメタゾンシグマ アルドリッチD4902-500MG
D-ルシフェリン (カリウム塩)ケイマン ケミカル14681
ガストリン I ヒトシグマ アルドリッチG9020
グルタMAXギブコ35050061
成長因子還元 (GFR) マトリゲルCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010は、IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL と Organoid Supplement, 50 mL で構成されています。腸内オルガノイド増殖培地として使用するために、両方を1:1の比率で混合
クロノスディオ ルミノメーターマシンATTOコーポレーションAB-2550
N-2 サプリメント (100倍)Gibco17502-048
N-アセチル-L-システインシグマ アルドリッチA9165
pABpuro-BluF レポータープラスミドAddgene46824
PBS カルシウムとマグネシウムなしコーニング21-040-CV
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122
組換えマウスEGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK阻害剤
します

参考文献

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