この記事では、マウスで心筋虚血再灌流障害(IRI)を誘発するための独自の閉鎖胸部技術を紹介します。提示された方法は、マウスが遠隔で心筋虚血を誘発しながら自発的に呼吸することを可能にする。これにより、虚血と再灌流の動的プロセスを非侵襲的イメージングを介してその場でリアルタイムに研究するための動物へのアクセスが提供されます。
方法論記事
自発呼吸マウスにおけるバルーンカテーテルを用いた遠隔トリガーLAD閉塞
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
急性心筋梗塞 (AMI) は、一般的で死亡率の高い心血管疾患です。AMIの血行再建術戦略が進歩しているにもかかわらず、AMIはしばしば心筋虚血再灌流障害(IRI)を引き起こし、心臓の損傷を増幅します。マウスモデルは、 in vivoでの急性損傷と慢性心筋リモデリングの両方を調査するための重要なツールとして機能します。この研究は、マウスで心筋IRIを遠隔誘導するためのユニークな閉鎖胸部技術を提示し、MRIやPETなどの生体内イメージングを使用して閉塞および再灌流の非常に初期の段階の調査を可能にします。このプロトコルは、遠隔閉塞法を利用しているため、胸部閉鎖後の虚血開始を正確に制御できます。外科的外傷を軽減し、自発呼吸を可能にし、実験の一貫性を高めます。この技術を際立たせているのは、閉塞および再灌流イベント中に、超音波や磁気共鳴画像法(MRI)などの非侵襲的イメージングを同時に行うことができる可能性があることです。これは、ほぼリアルタイムで組織応答を解析するユニークな機会を提供し、虚血および再灌流中のプロセスに関する重要な洞察を提供します。この革新的なアプローチについて、梗塞の心壊死マーカーの測定、造影MRIによるリスク領域の評価、瘢痕成熟期の梗塞の染色など、広範な系統的試験が実施されました。これらの調査を通じて、心筋虚血再灌流障害に対する研究アプローチを前進させ、標的を絞った介入の開発を加速する上で、提案されたツールの価値に重点が置かれました。提案された革新的な実験プロトコルを非侵襲的イメージング技術と組み合わせることの実現可能性を実証する予備的な知見を本明細書に提示する。これらの最初の結果は、専用の動物用クレードルを利用して、MRIスキャンを同時に実施しながら遠隔で心筋虚血を誘発することの利点を強調しています。
概要
急性心筋梗塞(AMI)は、世界的に蔓延している心血管疾患であり、高い死亡率と罹患率と関連しています1。技術の進歩により、AMI患者の早期かつ効果的な血行再建術が可能になりましたが、これらの介入後も患者は依然として心筋虚血再灌流障害(IRI)を経験しています2。したがって、IRIを軽減するための基本的なメカニズムを理解し、アプローチを策定することが重要です。IRIは、多数の複雑な生物学的プロセスが関与する複雑な病態生理学的状態を表しています。これらには、制御された細胞死、酸化ストレス応答、炎症、創傷治癒、線維症、および心室リモデリングが含まれます。マウスなどの動物モデルは、IRI研究にとって非常に重要であり、その費用対効果、迅速な繁殖、およびトランスジェニックモデルからの豊富な機構情報により、広く採用されています3。
このプロトコルは、胸部が閉じた自発呼吸マウスにIRIを遠隔誘導する革新的な技術を提示し、人間の病理をより密接に模倣します。遠隔閉塞は、心筋から離れた位置に配置されたバルーンカテーテルを利用して左前下行動脈(LAD)を閉塞することによって達成されました。このアプローチにより、閉塞と再灌流の正確な瞬間に鼓動する心臓への継続的なアクセスが可能になり、超音波や磁気共鳴画像法(MRI)などの同時イメージングモダリティが容易になります。これらの非侵襲的方法は、閉塞および再灌流イベントの前、最中、および後の組織応答に関する重要な洞察を提供する可能性があります。
マウスモデルでIRIを誘導するためのさまざまな外科的手法が存在します。冠動脈結紮の開胸モデルにおける開胸術に起因する外科的外傷は、虚血と再灌流に関連する多様なメカニズムに影響を与える免疫応答を引き起こします。自然免疫系の活性化は、心筋梗塞の程度に影響を与える可能性を秘めています4。提案された適応技術は、心筋のプレコンディショニングとポストコンディショニングを調査し、オープン胸部の時間枠を最大 5 分に最小化することにより、マウスの IRI 研究における外科的外傷に対する自然免疫応答の影響を軽減するための潜在的なアプローチを提供します。さらに、新たに開発された技術は、人工呼吸器誘発性肺損傷5によって引き起こされる炎症誘発性後遺症の軽減にも貢献する可能性があります。しかし、この新しいクローズドチェスト法の複合的な効果には、さらに詳細な調査が必要です。
提案された技術の徹底的な検証は、外科的胸郭清と結紮糸誘発閉塞を通じて LAD を 30 分間露出させる従来の方法と比較することにより行われました。心筋梗塞のサイズを反映したトロポニン測定、ガドリニウム造影剤を用いたMRIを用いたリスク領域の評価、組織学的トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色、およびシリウスレッド(SR)染色 による 最終的な瘢痕サイズの決定を含む、両方の技術の結果を比較しました。この結果は、マウスモデルにおける虚血再灌流障害を研究するための提案されたアプローチの堅牢性と有効性を示しています。
プロトコル
この動物プロトコルは、ルーヴェン・カトリック大学の動物実験倫理委員会(ECD)によって承認されたガイドラインと規制に準拠しています。現地のECDが策定するすべてのポリシーは、指令2010/63/EUで宣言されている実験動物の福祉に関する欧州連合の規制に準拠しています。以下に説明するすべての試験は、8〜12週齢(体重= 20〜23 g)の雄C57BL / 6マウスで実施されています。.急性実験は、手術直後に犠牲にされた動物を表しています。生存実験は、トロポニン測定、MRI、SR染色を含む4週間の追跡調査であった。
1.麻酔と気管内挿管
- ケタミン(7.5 mg / kg;ニマテック100 mg / mL)、キシラジン(1 mg / kg;ロンプン、20 mg / mL)、およびアセプロマジン(0.1 mg / kg;プラシベット、10 mg / mL)(KXA)( 材料の表を参照)腹腔内に0.9%生理食塩水希釈剤を投与します。.これにより、よりスムーズで侵襲性の低い挿管が可能になります。
- マウスを誘導チャンバー( 材料の表を参照)に置き、2.5%イソフルランを純酸素中で1 L /分の流量で使用して、直立とつま先のつま先つまみ反射が失われるまで麻酔をかけます。
- 動物を加熱パッド(±38°C)に移し、頭を外科医に向けて仰向けに置きます。尻尾と前足をパッドにテープで固定します。前肢が過度に伸びていないことを確認してください、これは呼吸を損なう可能性があるためです。
- 上切歯の周りに2-0シルク縫合糸( 材料の表を参照)を置き、パッドの境界に縫合糸をテープで固定してマウスをぴんと張らせます。必要に応じて、縫合糸の張力を保つためにニードルホルダーを取り付けます。ノーズコーンを使用して、100%酸素中の2%イソフルランを使用して1L / minの流量で動物を麻酔します。
- 光源を胸骨の吻側だけに置き、ノーズコーンを取り外し、イソフルラン供給を人工呼吸器に置きます。鉗子を使用してマウスを挿管するには、舌を上に持ち上げ、自作の喉頭鏡を持って舌の基部をさらに持ち上げ、声帯を視覚化します。
- 声帯の間の鈍い針に18Gカテーテルを使用して自作の気管チューブを留置します。カテーテルを上に移動させ、鈍い針を抜いて、チューブをマウスベンチレーターに接続します( 材料の表を参照)。
- 変更されたY字型コネクタ( 材料の表を参照)を使用して、挿管チューブを人工呼吸器に接続します。気管チューブの正しい位置は、対称的な胸部拡張を判断することで確認できます。
- 一回換気量(mL)を体重(BW)(g)×7、換気量を53.5×(BW(g)-0.26)ストローク/分に設定し、必要に応じて特定のマウスの体重に調整します6 (例えば、25gのマウスの場合、一回換気量は140ストローク/分で175mLです)。
- イソフルランを100%酸素中1%に減らします、動物は前投薬のために麻酔されたままになります。ただし、つま先をつまむことにより、麻酔の深さを定期的に評価してください。麻酔の深さに基づいてイソフルラン濃度を適応させます。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を一滴塗布します。.
2. IRIツールのインストール
注意: すべてのテーピングをはがし、専用のIRIツールのベースプレートに動物を置きます。IRI ツールのプロパティの詳細については、 補足ファイル 1 を参照してください。
- 専用のリモートIRIツールのベースプレートを、外科医の前の横向きの位置に固定します。尻尾と足をテープで固定します。偶発的な動きを防ぐために、上切歯の周りに2-0シルク縫合糸を使用して頭を固定します(図1)。
- 直腸サーマルプローブ( 材料の表を参照)を挿入して体温を監視し、動物の上にある赤外線加熱ランプを使用して温度を約37°Cに保ちます。 動物とlの間に十分な距離に注意してくださいamp 過熱を避けるために。
- ECG針電極を4つの足すべてに配置して、心拍数とECG波形を観察および記録します。直腸プローブとECG電極をテープでプラットフォームに固定します。
- 胸部の左側に脱毛クリームを塗ると脱毛し、術野がすっきりと整えます。
注意: 塗布時間を制限し、化学火傷を防ぐためにクリームの完全な除去に注意を払ってください。
3.開胸術
- Betadine Solutionを使用して皮膚の無菌調製を行い、その後、左胸部に外科用ドレープを配置して無菌環境を確保します。滅菌済みの機器を使用して手順を実行します。胸筋の中央部に、長さ約1cm、左胸骨境界から2mm離れた場所に垂直に皮膚を切開します。
- 胸筋を吐き出して、その下の肋骨を露出させます。船舶への偶発的な怪我を避けてください。出血が発生した場合は、綿のアプリケーターを使用して出血を止めてください。
- 肋骨を視覚化し、薄い半透明の胸壁を通して膨らんだ肺を観察することにより、肋間腔を特定します。手術用ハサミを使用して、3番目の肋間腔に6〜8mmの切開を行い、胸腔を開きます。切開部が、内胸動脈が位置する胸骨境界から2mm以上離れていることを確認してください。
- 小さなラットアイスペキュラム( 材料の表を参照)を肋間腔に挿入します。これは、リブリトラクターとして機能します(図1A)。
- 湾曲した鉗子で心膜をそっと持ち上げ、引き離します。
- 肺の上に小さな綿を置き、そっと下に押します。
4. LADの準備
- LADは真っ赤に見え、左耳介の下の大動脈から頂点に向かって走ります。結紮糸の理想的な位置は、左耳介の先端より約2mm低い位置です。肺幹をマーカーとして使用して、左耳介を特定し、光の流入を使用してLADの視覚化を最適化します(図2)。
- テーパー針を使用して、7-0ポリプロピレン縫合糸をLADの周りに通します。針は左心室に入る可能性があるため、針を深く置きすぎたり、LADを損傷する可能性があるため浅すぎたりしないでください。
- 小さな綿片を取り除き、左肺がまだ換気されているかどうかを確認します。
- リブリトラクターを取り外します。
- 縫合糸の両端が15cm以上の長さであることを確認してください。針を切り落とします。
- 1 mm PE-50 チューブを 15 mm PE-10 チューブの上に置きます ( 材料の表を参照)。縫合糸の両端をPE-10チューブに通し、PEチューブの太い端を心臓に当てて移動します。
5.胸部閉鎖と抜管
- 開いた肋間腔にフシジン酸ジェルを塗布し、人工呼吸器の流出を一時的に遮ることにより、残りの胸腔内空気を静かに逃がします。胸部への空気の侵入を防ぐために、PEチューブの外側部分に追加のフシジン酸ゲルを追加することができます。
- PEチューブのレベル上下に5-0ポリプロピレンXステッチで胸筋を閉じ、PEチューブの肥厚部分が筋肉のレベルの下にあることを確認します。
- PEチューブの上と下に2つの5-0ポリプロピレンXステッチで皮膚を閉じます(図1B および 図3)。
- 胸が閉じていると、動物は再び自発的に呼吸することができます。一回換気量と呼吸数をゆっくりと減らすことにより、動物を人工呼吸器から離乳させます。.動物が呼吸を始めたら、自発的に慎重に換気チューブを外しますが、安定した呼吸パターンが観察されるまで所定の位置に保ちます。
- イソフルラン供給を、動物の鼻の上に置かれ、ベースプレートに固定されているノーズコーンに接続します。
6. リモートIRツールの組み立て
- 縦側の側面部分をベースプレートのスリットに差し込んで配置します。
- 細いフックを使用して2つの縫合糸の端を取り出し、バルーンの後ろの側面部分の中央の穴から引き出します( 材料の表を参照)。
- 縫合糸の端の1つをバルーンの上と周りにガイドします。もう一方の縫合糸の端をバルーンの下と周りでフォロースルーします。縫合糸のガイドをスムーズにするために、フシジン酸ゲルを塗布します。
- 縫合糸の端をサイドパーツ上部のスリットに通します。縫合糸の遠位部分に2.1gの重りをかけて、各縫合糸の端を所定の位置に保ちます(図1C および 図4)。
注意: 適切なウェイトの構成は変更される可能性があり、事前にテストする必要があります。詳細については、 補足図 1 および 補足ファイル 1 を参照してください。リモート IRI ツールの設計は、 補足図 2 で提供されています。
7. 虚血と再灌流の誘発
- 血管バルーンポンプを使用してバルーンを最大2バールまで迅速に膨らませることにより、虚血を誘発します。.ポンプをロックします。バルーンが膨らみ、ウェイトが持ち上げられているかどうかを目視で確認します(図4)。
- ECGトレースの変化を観察して虚血を確認します。
- 特定の研究プロトコルに従って、設定された時間(提示された実験では30分)バルーンを膨らませたままにします。
- ポンプのロックを解除するだけで閉塞を止めます。バルーンを慎重に収縮させます。バルーンが収縮し、ウェイトが下がっているかどうかを目視で確認します。
8.リモートIRツールの分解
- 動物と側面部分の間の縫合糸とチューブを切断し、側面部分を慎重に取り外します。
- 胸部へのチューブの挿入部位にフシジン酸ゲルを塗布します。湾曲した鉗子を使用して皮膚をチューブにそっと押し付け、別の鉗子を使用してチューブを抽出します。皮膚の近くに残っている縫合糸を切断します。
- 5-0ポリプロピレンの予備の縫合糸を配置して、チューブの出口部位を閉じ、胸部への空気の侵入リスクを最小限に抑えます。
9. 麻薬終結と回復
- イソフルランの供給を止め、動物が静かで暖かく、酸素が豊富な環境で目を覚ますようにします。
- マウスが完全に回復するまで観察することにより、マウスが呼吸困難に陥っていないことを確認します。脱水症を防ぐために、腹腔内注射により0.3mLの滅菌生理食塩水(体温)を提供します。.
- 術後鎮痛薬として、オピオイド鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.1 mg / kg)を皮下投与してから、動物が歩行可能になります。.ブプレノルフィンが提供されている場合は、次の24〜48時間について4〜6時間ごとにマウスをチェックし、マウスが鎮痛剤に反応していることを確認し、追加の鎮痛剤が必要かどうかを判断します。.追加のサポートには、術後にケージの床に置かれた標準的な推奨支持療法ダイエットジェルまたはマッシュを含める必要があります。
結果
虚血を誘発する能力の検証は、塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)およびシリウスレッド(SR)染色、心筋トロポニンI測定、および後期ガドリニウム増強(LGE)MRイメージングの4つの試験によって行われています。統計的有意性は、サンプルサイズが限られていることを考慮して、Mann-Whitneyノンパラメトリック検定を使用して評価されました。統計的有意性は p < 0.05に起因した。
急性実験(TTC染色、n = 15)には技術的な失敗はなく、すべての動物が含まれていました。これらの急性実験には、即時追跡実験(心筋トロポニンI、LGE MRI、シリウス赤色染色、n = 12)が含まれ、4週間の期間中の遠隔閉塞技術と標準閉塞技術の生存率はそれぞれ85%と80%でした。
塩化トリフェニルテトラゾリウム染色
TTC(塩化トリフェニルテトラゾリウム)をマウスモデルに残して心臓の虚血再灌流障害を巨視的に染色し、デヒドロゲナーゼ酵素の機能喪失を示すことで心筋生存率の現象を計測します。この染色方法は、心臓のまだ生存している(生きている)領域と虚血のために生存不能になった領域を区別するのに役立ちます。生存可能な心筋はTTCで赤く染まりますが、虚血領域は、酵素デヒドロゲナーゼが機能しなくなったため、青白く、または染色されません。これにより、虚血発症後の早期の組織損傷の程度に関する重要な情報が得られます。染色は、虚血の30分直後に、標準的なIRI(n = 7)およびリモートIRI(n = 8)グループに対して実施しました。 図5 は、1匹の動物の代表的な染色スライスを示しており、組織スライスは基部から頂点に向かって横切っています。TTC染色の結果を 図6 に示しますが、2つのIRI技術間に有意差は見られません。TTC染色は、Fishbeinら7に記載されているように行いました。
後期ガドリニウム増強MRI
虚血領域の範囲を非侵襲的に測定するために、LGE MRIを閉塞後24時間で標準IRI(n = 5)およびリモートIRI(n = 5)グループに採用しました。詳細な取得の詳細は、 補足ファイル1に記載されています。リスクのある領域は、 補足ファイル1に詳述されている閾値基準を超える3つの最も先端スライスの左心室の組織の割合として測定されます。 図7 のグラフ表現は、リスク測定で領域を評価する際に、新たに提案されたリモート閉塞技術と従来の「オープンチェスト」法との間に有意差が観察されなかったことを示しています。
シリウスレッド染色
心筋虚血の結果である心筋梗塞は、虚血を経験している個人にとって深刻な問題を引き起こします それは心臓の収縮質量の減少をもたらし、効率的に血液を送り出す能力を損なうからです。図8は、閉塞から4週間後にSirius Red染色を用いて、LGE MRIで描かれたリスク領域に基づいて瘢痕形成の位置を確認し、瘢痕組織の程度を測定することで、この知見をさらに説明しています。染色は、標準 IRI(n = 5)およびリモート IRI(n = 5)グループに対して行いました。明るい赤色の領域は梗塞の壊死性コアを示し、オレンジ色の部分は生存可能な組織を示します。最後に、図9は、両方の手法でシリウスレッド染色を使用して測定された最終的な瘢痕サイズを示しています。瘢痕のサイズは、染色された梗塞の面積を、厚さ2.4mmの頂端組織切片スラブの左心室自由壁の総面積で割ったものとして計算されます。
心筋トロポニンI
この研究では、イメージングおよび染色技術に加えて、心筋トロポニンIをマーカーとして使用して心臓の損傷も評価しました。血液サンプルは、標準的なIRI(n = 8)および遠隔IRI(n = 8)グループについて、手術後24時間で収集されました。 図10 は、Cardiac troponin Iの値を示しており、新しいリモートオクルージョン技術と標準的なIRI技術を比較しても有意差は見られません。
提案された概念の実現可能性のデモンストレーションとして、遠隔地から虚血を誘発する予備的な結果も提供され、同時に非侵襲的イメージングが行われます。これは、MRI動物用クレードル内に配置され、MRスキャナーの中央に配置された特注のリモートオクルージョンツールを利用することで実現されました。 図11 に示す結果は、梗塞領域と非梗塞領域の間の画像のコントラスト(輝度レベル)の違いを示しています。動物がMRスキャナ内に配置されている間にLADの成功した閉塞を確認するマーカーとして典型的なST上昇を示すECGトレースを 図12Bに示しますが、 図12A は閉塞前のECGトレースを示しています。
この包括的なアプローチにより、新たに提案された遠隔閉塞技術が虚血、壊死、および心臓損傷に及ぼす影響を、従来の「開胸」法と比較して実験モデルで詳細に理解できます。
図1:プロトコルに概説されている動物の調製を示す代表的な画像(A)肋骨リトラクターの挿入を伴う開胸術。(B)胸部から出るPE-10チューブで胸部を閉じ、LADの周りに縫合糸をガイドします。(C)組み立てられたリモートIRIツール内に動物を配置します。縫合糸の両端を固定し、リモートIRIクレードルの側面部分で休んでいる2つの2.1gの重りに注意してください。側面部分は、ツールのベースプレートの切り欠きによって配置され、所定の位置に保持されます。血管バルーンカテーテルが収縮しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Figure 2: Ex vivo visualization: LAD (白矢印) と左耳介 (black arrow) この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:実験セットアップの概略図(トップダウンビュー)で、リモートオクルージョンに使用されたツールの位置を示しています。 BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:遠隔閉塞のためのツールの使用方法を側面から示した概略図(A)手術の開始から、動物は底部に置かれます。チェストを閉じた後、サイドパーツを所定の位置に取り付けます。この時点では、バルーンはまだ収縮しており、ウェイトは底部に載っています。(B) バルーンカテーテルを膨らませると、ウェイト (矢印でマーク) が持ち上げられ、LAD の閉塞を引き起こし、その後、心筋に虚血が生じます。オクルージョンの成功は、ECGトレースの変化に見られます。バルーンを収縮させると、LADを通る血流が回復します。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)で染色したマウスの心臓切片の代表的な画像。 スライスは、一番上の行から左から右に、ベースから頂点まで移動します。(A)標準IRIです。(B)リモートIRI。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:TTC染色結果。 閉塞の24時間後にTTC染色を行い、梗塞のサイズを測定しました。データポイントは、標準IRI(n = 7)およびリモートIRI(n = 8)グループのSEMの平均として提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:後期ガドリニウム増強MRI。 閉塞後 24 時間でリスクのある領域は、LGE MRI で得られた 3 つの最も先端スライス (頂点自体を含まない) で描かれています。データポイントは、標準IRI(n = 5)およびリモートIRI(n = 5)グループのSEMの平均として提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:虚血/再灌流手術後のMRIによる遠隔閉塞装置の検証。閉塞後 1 日目の LGE MR 画像で示されているリスクのある領域と、閉塞後 4 週間で Sirius Red で染色された決定的な瘢痕組織との間の代表的な比較。(A-B)リモートオクルージョンとベンチオクルージョンをそれぞれ備えた動物の短軸スライス。矢印は、リスクのある線引きされた領域を示しています。(C-D)同じそれぞれの動物のシリウスレッドで染色された組織学的スライスは、最終的な瘢痕形成が閉塞後24時間でMRIで描かれたリスクのある領域と一致することを確認しています。LV =左心室。スケールバー = 200 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:シリウスレッド染色結果。 シリウスレッド染色は、瘢痕形成の程度を測定するために、閉塞の4週間後に行われました。データポイントは、標準IRI(n = 5)およびリモートIRI(n = 5)グループのSEMの平均として提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:閉塞後24時間で得られたマウス血清中の心筋トロポニンI濃度の定量化。 cTnIのデータポイントは、標準IRI(n = 8)およびリモートIRI(n = 8)グループのSEMの平均として提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:提案されたリモートオクルージョンツールを同時MRI取得と組み合わせて使用することにより得られた予備的な結果が示されています。 閉塞前、閉塞時、および閉塞直後の1匹の動物の短軸方向における同じ心室中スライスが提示されます。左側の代表的な画像スライスは、実験の開始時 (IRI をトリガーする前) の心筋の境界を示しています。中央には、30分間の遠隔誘発性虚血後に同じ短軸スライスが示されています。塩化マンガン(MnCl)は、梗塞領域(黄色でマーク)を強調するための造影剤として使用されました。明るさは手動で調整され、さまざまな組織領域を強調するために飽和しました。中隔と外側の自由壁(黄色でマーク)の明るさの違いに注意してください。右側では、以前と同じ明るさ設定を使用して、閉塞後20分(再灌流段階)に同じ短軸スライスが表示されています。矢印は、閉塞時に比べて輝度が増した領域を示しており、再灌流段階での造影剤の取り込みと、閉塞時に描かれた初期低信号領域の縮小を規定しています。LV =左心室。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:MRIモニタリングシステムを使用して虚血の発症を確認した心電図トレース (A)遠隔閉塞前に撮影した正常な心電図トレース。(B)同じ動物でバルーンが膨らんだ直後に撮影された心電図の痕跡。矢印は、通常、虚血が成功した発症のマーカーと見なされるSTセグメントの標高を示しています。信号振幅の減少に加えて、心臓数と呼吸数の増加も観察されます。動物は、閉塞期および再灌流期のMRスキャナーの中央に配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:ウェイトの構成。 バルーンリモートシステムを使用したダイナモメータ変位の関数でのすべての重みのプロット(青) 対オリジナルのプーリーシステム(オレンジ)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:リモートIRIツールの設計。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:IRIツールの特性と画像取得および解析技術の詳細。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
この研究で導入された新しい遠隔閉塞技術は、虚血再灌流損傷モデリングの分野で研究を進めるための独自のプラットフォームを提供します 最初の手術中の直接血管操作の必要性を回避し、早期に再灌流された心筋の同時マルチモーダルイメージングを可能にします。トロポニンI測定、LGE造影MRI、TTC、およびSR染色を含む包括的な特性評価は、提案された技術が現在のゴールデンスタンダード(すなわち、 開胸LAD結紮)と同等であることを示しています9。
提案された手法には、従来の「オープン」LADライゲーションアプローチに比べて複数の利点があります。主に、従来のアプローチで必要とされる閉塞時間(30〜60分)と手術時間(15分)とは対照的に、手術中に胸を開く時間をわずか15分に短縮します。この最小限の開心術は、組織の損傷と炎症を軽減する可能性がありますが、さらなる調査が必要です。さらに、早期に開胸を閉鎖することで、人工呼吸器の離脱が可能になり、虚血再灌流実験中にイソフルランの下での自発呼吸が可能になります。これにより、人工呼吸器による肺損傷とそれに伴う炎症を減少させると同時に、心筋虚血と再灌流に対するより生理学的に正確な反応を可能にする可能性があります10。
さらに、リモートオクルージョン技術により、虚血誘発の正確なタイミングをより詳細に制御できます。概念実証として、心筋虚血を遠隔操作で誘導・制御することの実現可能性と予備的な結果を示し、動物をMRスキャナーの中央に配置しました。胸部閉鎖後に虚血を正確に開始する能力により、研究者は治療介入や追加の調査のタイミングを計り、実験対象間で虚血性傷害を同期させることができます。この制御の向上により、IRIのより正確で一貫した誘導が可能となり、これは機構的および治療的研究にとって重要です。それにもかかわらず、心臓 MRI セットアップ中のイソフルラン吸入の限界延長は、この研究に制限をもたらす可能性があります。つまり、イソフルランへの長期曝露は、マウスの研究で示されているように、追加の心臓保護効果がある可能性があり、提案されたモデル11についてはさらに調査する必要があります。
誘発された損傷の程度の変動は、IRIモデルの一般的な課題であり、多くの場合、外科的実行または可変解剖学的構造の違いから生じます12。重要なことに、外科医の適切なトレーニングは、LADの配置、実験期間、マウス系統、遺伝的背景など、他の認識された変数を超えて、このモデルの死亡率に影響を与える13。麻酔薬と鎮痛剤の選択も結果に影響を与える可能性があります。経験上、このモデルは全体の死亡率が15%に近いことを示しています。厳格な疼痛管理と警戒心の強い動物モニタリングを実施することで、死亡率をさらに減らすことができます。
この研究によって示された説得力のある方向性の 1 つは、閉塞または再灌流の初期段階での治療的介入の評価における遠隔閉塞技術の潜在的な適用です。
結論として、遠隔閉塞技術は、IRIモデリングの有望な進歩を表しており、メカニズム研究を洗練し、標的療法を加速させる可能性があります。外科的外傷を減らし、虚血のタイミングの制御を強化し、実験の一貫性を向上させるその能力は、その重要性を強調しています。この技術の適応性をさらに探求することで、研究者はその可能性を最大限に引き出し、虚血誘発、再灌流、およびそれに伴う虚血再灌流障害の初期段階をより正確に理解することに貢献することができます。また、これらの初期段階では、さまざまな治療戦略の効果を観察できるようになりました。
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
実験は、KUルーヴェンの中核施設「分子小動物イメージングセンター」(MoSAIC)で行われました。著者は、技術支援を提供してくれたKatarzyna Błażejczykに感謝の意を表したいと思います。この研究は、KU Leuven(C14/20/095)およびResearch Foundation - Flanders(FWO G0A7722N)からの研究助成金によって支援されました。M. Algoetは、Research Foundation - Flanders Fellowship Grant(FWO 11A2423N)の支援を受けています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-0 シルク縫合糸 | シャーポイント製品 | DC-2515N | |
| 5-0 ポリプロピレン縫合 | エチコン | 8710H | |
| 7-0 ポリプロピレン縫合 | エチコン | 8206H | |
| アクラレント バルーン インフレーション デバイス | ジョンソン&Johnson MedTech | BID30 | |
| アセプロマジン | Kela | ||
| BD Vialon 18 G | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 G | 381334 | BD | |
| Betadine Solution | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Buprenorphine (Buprenex Injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| コイ ズーム スタイリング Knijplood 2.1 g (リード フィッシング ウェイト) | Visdeal.nl | ||
| デュモン #3 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11231-30 | |
| デュモン #5 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11251-30 | |
| ファイン ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 14040-10 | |
| フシジン ジェル | レオ ファーマ | ||
| イソフルラン | アボット | NDC 5260-04-05 | |
| KD マウス/ラット アイ スペキュラム | ワールド プレシジョン | 501897 | |
| KD マウス/ラット アイ スペキュラム | ワールド プレシジョン | 501897 | |
| ケタミン | デクラ | ||
| 光源 | ツァイス | KL 1500 LCD | |
| MRI システム | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride 0.9% | Baxter | ||
| Nocturnal Infrared Heat Lamp | Zoo Med Laboratories, Inc. | RS-75 | |
| ParaVisionソフトウェア | Bruker BioSpin | バージョン 6.0.1 | |
| ポリエチレンチューブ PE-10 | SAI 注入技術 | PE-10 | |
| ポリエチレンチューブ PE-50 | SAI 注入技術 | PE-50 | |
| リモート IRI ツール (PMMA) | 自家製 | ||
| げっ歯類外科モニター | インダス機器 | ||
| セグメント v4.0 | Medviso、segment.heiberg.se | R12067 | |
| セルフゲートグラディエントエコーシーケンス | Bruker BioSpin、エットリンゲン、ドイツ | IntraGate、ParaVision 6.0.1 | |
| スリム細長いニードルホルダー | ファインサイエンスツール | 12005-15 | |
| Sure-Seal マウス/ラット誘導チャンバー | World Precision Instruments | EZ-178 | |
| チューブ コネクタ、ポリ、Y 字型 | Westlab | 072025-0001 | |
| Ultraverse 035 PTA拡張カテーテル:5mm x 40mm、17 ATM RBPバルーン、長さ130 cmカテーテル | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet(脱毛クリーム) | レキットベンカイザーヘルスケア | ||
| ベンチレーター、MiniVentモデル845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH &ロムファーマ | 685313 | |
| キシラジン | バイエル |
参考文献
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
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