ここでは、レーザー誘起衝撃波(LISW)を使用して爆風誘発蝸牛損傷の動物モデルを作成するための実験プロトコルについて説明します。側頭骨をLISWに曝露すると、芽球誘発性蝸牛の病態生理学の再現が可能になります。この動物モデルは、蝸牛の病理を解明し、突風損傷の治療法の可能性を探るためのプラットフォームとなる可能性があります。
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この記事について
サマリー
要約
耳は爆発過圧の影響を最も受けやすい器官であり、爆風曝露後に蝸牛の損傷が頻繁に発生します。爆風への曝露は、生活の質に悪影響を与える不可逆的な難聴である感音難聴(SNHL)につながる可能性があります。有毛細胞の喪失、螺旋神経節ニューロン、蝸牛シナプス、立体繊毛の破壊など、芽球誘発性の蝸牛の病状は、これまでに詳細に報告されています。しかし、爆風の過圧にさらされた動物は通常、鼓膜穿孔(TMP)を経験し、伝音難聴を併発するため、爆風損傷後の蝸牛感音の劣化を判断することは困難です。純粋な感音蝸牛機能障害を評価するために、レーザー誘起衝撃波を用いた爆風誘発蝸牛損傷の実験動物モデルを開発しました。この方法は、TMPとそれに伴う全身性損傷を回避し、LISW曝露後のエネルギー依存的な方法でSNHLコンポーネントの機能低下を再現します。この動物モデルは、芽球誘発性蝸牛機能障害の病理学的メカニズムを解明し、潜在的な治療法を探求するためのプラットフォームとなる可能性があります。
概要
難聴と耳鳴りは最も一般的な障害の1つであり、退役軍人の最大62%で報告されています1。感音難聴(SNHL)や鼓膜穿孔(TMP)など、いくつかの爆風誘発性聴覚合併症が、爆風過圧に曝露された個人で報告されています2。さらに、爆風に曝露した個人を対象とした研究では、爆風への曝露は、聴力の閾値が正常範囲内にある場合でも、聴覚の時間分解能に欠陥をもたらすことが多いことが示唆されており、これは「隠れた難聴(HHL)」として知られています3。芽球関連の蝸牛病理では、内有毛細胞 (IHC) と聴覚ニューロン (AN) の間の蝸牛シナプスが大幅に失われていることは十分に確立されています4。シナプス変性症は聴覚処理の障害をもたらし、HHL5 の発症の主な要因です。したがって、聴覚器官は、複雑で高度に組織化された構造を含む壊れやすいコンポーネントです。しかし、爆風が細胞レベルで内耳に影響を与える正確なメカニズムは不明のままです。これは、実験室で爆風損傷の正確な臨床的および機械的な複雑さを再現することの難しさと、爆風誘発性の蝸牛病理の複雑さによるものです。
爆風傷害の主成分は衝撃波(SW)であり、ピーク圧力の急速かつ高い上昇を特徴とする6。爆風による損傷の複雑さは、数多くのレトロスペクティブ研究で広く調査されてきた7,8,9。爆風発生のための様々な装置があり、圧縮ガス10、ショックチューブ11、小火薬12など、圧力の異なるレベルにある。最近開発された装置で発生するSWの圧力波形は、実際の爆発の圧力波形によく似ていました。爆風誘発性感音難聴の動物モデルを確立する上で重要な概念は、聴覚障害以外の付随する損傷を最小限に抑えて、動物の死亡を減らすことです。そのため、衝撃管を小型化し、出力を正確に制御して、曝露した動物が死亡することが少ない爆風傷害研究が開発されました。しかし、これらの動物モデルは通常、TMPなどの合併症を発症しますが、伝音難聴を併発するため、蝸牛機能の評価は困難です2。以前に耳栓を使用して爆風損傷に関する耳保護動物実験を行ったところ、TMP13の発生率は見つかりませんでした。耳栓は重度の蝸牛の損傷を部分的に軽減する可能性がありますが、中枢性聴覚神経変性や耳鳴りの発生は軽減しません。したがって、耳栓は蝸牛と鼓膜を保護します。ただし、TMPを使用しない爆風誘発性純粋な蝸牛損傷の動物モデルが必要です 爆風損傷によって引き起こされる蝸牛の病態生理学を研究するために。
我々は以前に、レーザー誘起衝撃波(LISW)14,15を使用して、ラットおよびマウスの内耳の局所爆風損傷モデルを開発した。この方法は、標準的な実験室レベルで安全かつ容易に実施することができ、肺および頭部爆風損傷のモデルを生成するために使用されてきた16,17。LISWのエネルギーは、レーザーの種類や出力を変更することで調整でき、蝸牛の損傷の程度を制御することができます。LISW 誘発蝸牛損傷モデルは、爆風損傷によって引き起こされる SNHL のメカニズムを研究し、潜在的な治療法を調査するために価値があります。本研究では、LISWを用いた芽球による蝸牛損傷のマウスモデルを作成するための詳細な実験プロトコルを記述し、LISWばく露後のマウスにおいて、有毛細胞(HC)、蝸牛シナプス、螺旋神経節ニューロン(SGN)のエネルギー依存的な喪失を含む蝸牛変性を実証する。
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プロトコル
すべての実験手順は、防衛医科大学の動物施設管理委員会(承認#18050)によって承認され、国立衛生研究所および文部科学省のガイドラインに従って実施されました。動物の数とその苦しみを最小限に抑えるために、あらゆる努力が払われました。
1. 動物たち
- このプロトコルに従うには、8週齢の雄のCBA/Jマウスを使用してください。実験の前に、マウスに聴力機能検査と鼓膜の内視鏡観察を行い、正常性を確認します。
- 27匹のCBA/Jマウスを3つのグループに分けます:(1)2.0J/cm2 ばく露群(n = 9マウス);(2)2.25J/cm2 ばく露群(n = 9マウス);(3)2.5J/cm2 ばく露群(n = 9マウス)。LISW曝露の1か月後に評価のためにすべての耳を取り外してください。
2. LISW被ばくの実験設定
- レーザーターゲットは、直径10mm、厚さ0.5mmの黒い天然ゴムディスクです。LISWインパルスを増加させるには、アクリル樹脂溶接接着剤を使用して、厚さ1.0mmの透明なポリエチレンテレフタレートシート(PET)をターゲット領域の上部に接着します。532 nmのQスイッチNd:YAGレーザーを照射して、ターゲットの背後にLISWを生成します(図1A)。
- 平凸レンズでレーザーパルスをレーザーターゲットの直径3.0mmのスポットに集束させます。
- LISW照射により、2つの材料の接合面にプラズマを発生させ、ゴムを気化(プラズマ媒介アブレーション)して、気化したゴムをキャビティ内に残します。
- ハイドロフォンを使用して、生体組織内ではなく水中1.0mmでLISWの圧力波を測定します。水面下1.0mmの黒いゴムの下に直径0.25mmの光ファイバーハイドロフォンを配置して、LISW圧力波形を記録し、デジタルオシロスコープを使用して測定します。
注:圧力波形は、 図1Bに示すように、最大圧力とインパルスが同様の安定した特性を示しました。 - 全身麻酔下で、1 mg/kg のメデトミジン塩酸塩と 75 mg/kg のケタミンの腹腔内注射を使用して、すべての動物処置を行います。マウスの両眼に眼科用軟膏を塗布して乾燥を防ぎ、熱サポートを提供します。
- 毛皮に閉じ込められた空気が保持されないように、耳介後領域を慎重に剃ります。マウスをプレートに固定し、耳介後領域をLISWの焦点領域に垂直上方向に配置します。
- マウスの耳の耳介後領域に経皮的に黒いゴム製のターゲットを取り付けます。音響インピーダンスのマッチングを確保するには、レーザーターゲットと皮膚表面の間に超音波導電性ゲルを使用します。
- 側頭骨を介して蝸牛に単一のLISWパルスを印加します。レーザーパルスの出力を3つのエネルギー密度(2.0 J/cm2、2.25 J/cm2、2.5 J/cm2)に設定します。
3. 蝸牛機能検査
注:聴覚脳幹反応(ABR)テストは、以前に報告された14,15と同様に実施されました。
- ABR測定は、LISW曝露の1日前と1日後および1か月後に行ってください。
- ABRは、聴覚刺激に反応して聴覚誘発電位であり、4つの周波数(12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz、および24.0 kHz)での聴力閾値を評価するために一般的に使用されます。
- 小さなイヤホンで刺激音を出し、イヤホンの近くに配置された小さなマイクを使用してマウスの鼓膜近くの音圧レベルを測定します。サウンドジェネレーターからバースト刺激を 37サイクル/秒 で出力し、音圧を 20dBの音圧レベル (SPL)から 80dBのSPL まで 5dB SPLステップで増幅します。
- 脳波記録用のステンレス製針電極を耳道と耳の前部の下に挿入し、尾部の尾部の下に接地電極を挿入します。
- ABRピークI(P1)振幅を測定することにより、蝸牛機能を評価します。以前に報告されたように、ABRピーク分析ソフトウェアを使用して、聴覚閾値とABR P1振幅に対してABR波形を自動的に分析します18。
- ABR閾値シフトは、露光前に得られた閾値を差し引いて計算します。3 つのばく露群の ABR 閾値シフトを、非ばく露された反対側の耳の ABR 閾値シフトと比較します (コントロール)。80dB SPL刺激中のABR波形を使用してABR振幅を測定します。
4. 組織学的評価
注:組織学的評価は、前述の14,15と同様に実施された。
- HCと蝸牛シナプス
- LISW被爆の1ヶ月後に蝸牛の病理学的検査を行う。
- 灌流前につま先をつまんで麻酔の深さを確認します。乳酸リンゲル液による血液灌流後、1 mL/gの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で経心臓灌流を行います。斬首後、蝸牛を取り外し、4% PFAで直接灌流した後、4°Cで一晩固定します。
- 固定後、0.5 mol/Lのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液で2日間振とうして、蝸牛を脱灰します。
- 脱灰した蝸牛を4つに分けます。蝸牛の各片をドライアイスで10分間凍結した後、0.3% Triton Xと単純に結合した5%正常ウマ血清で室温で1時間ブロッキングを行い、透過化します。
- 抗ミオシン7a(Myo7A)、抗C末端結合タンパク質(CtBP2)、および抗ニューロフィラメント(NF)抗体を一次抗体として使用し、37°Cで一晩インキュベートします。Myo7A抗体、CtBP2抗体、NF抗体を使用して、HCs、シナプス前リボン、および蝸牛神経線維をそれぞれ評価します。
- 結合していない一次抗体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5 x 3分間洗い流します。検体を適切な二次抗体と37°Cで2時間インキュベートします。染色後、PBSで試料を3×5分間洗浄し、カバーガラスを用いてスライドガラス上に試料を水溶性封止剤で封入します。
- 評価のためには、蝸牛の全体像 (4 つに分割) を 10 倍の倍率で取得し、参照されている ImageJ ソフトウェア プラグインを使用して蝸牛周波数マップを計算して、12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz、24.0 kHz の周波数で特定の蝸牛領域を正確に位置を特定します。
- HCの生存率と各周波数でのシナプスの数を計算します。
- HCの生存率を計算するには、各周波数で長さ200μmあたりの生存HCと欠損HCの数を数え、以下に示す式(1)を使用してHCの生存率を計算します。
HC生存率(%)=(生存HC数/生存および欠損HC数)×100(1) - シナプスの数を計算するには、3.1倍のデジタルズームと0.25μmのステップサイズを備えた油浸対物レンズ(63×)を使用して、共焦点蛍光顕微鏡下で内側のHC領域の高解像度zスタック画像を取得します。画像スタックをImageJにインポートし、各画像スタックの50μmの範囲内のIHCあたりのCtBP2点を自動的にカウントします。式 (2) を使用してシナプス リボンの生存率を計算します。
シナプスリボンの生存率(%)=(LISW露出耳のシナプスリボンの数/対照耳のシナプスリボンの数)× 100(2)
- HCの生存率を計算するには、各周波数で長さ200μmあたりの生存HCと欠損HCの数を数え、以下に示す式(1)を使用してHCの生存率を計算します。
- 走査型電子顕微鏡(SEM)では、前述のように蝸牛を取り外し、2%PFAと2.5%グルタルアルデヒドで一緒に4°Cで一晩固定します。0.5 mol/L EDTA溶液で4°Cで7日間振とうして蝸牛を脱灰した後、蝸牛を4つに切片にしてホールマウント調製を行います。
- 組織を1%四酸化オスミウムで4°Cで30分間固定し、50%エタノールで室温で10分間脱水し、70%、80%、95%、100%エタノールで繰り返し、オスミウムでスパッタコーティングし、以前に報告した14と同様に、5.0kVの電子顕微鏡で調べます。
- SEM画像14を用いて、各エネルギー群における破壊された立体繊毛の割合(破壊されたOHC立体繊毛の数/OHC立体毛の総数)を計算することにより、外有毛細胞(OHC)における立体繊毛束の破壊の定量的分析を行う。16.0 kHz と 24.0 kHz の領域の中心にある 100 μm あたりの立体繊毛の数を数えます。側面に向かって曲がっている、絡まっている、または基部が欠けているOHCバンドルの1つ以上の列を 、破壊されたものとして指定します。
- SGNの
- LISW 曝露後 1 か月での SGN の数を定量的に評価するには、上記と同じ条件下で 4% PBS による経心臓灌流、斬首、蝸牛の除去、および後方固定を行います。蝸牛を 0.5 M EDTA で 1 週間脱灰します。
- 脱灰後、蝸牛を30%スクロースに一晩浸し、凍結切片化合物に埋め込み、液体窒素で凍結してローゼンタール管の近くに切片を15μmの厚さで調製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡で観察します14。
- SGN密度測定では、ローゼンタール管の中央回転におけるSGNの数をカウントし、コントロールごとにSGN生存率を計算します。
5. 統計分析
- 選択したソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
- 二元配置反復測定 ANOVA [「頻度または蝸牛部分 (頂端/中/底部)」×「動物グループ」]、二元配置分散分析 (ANOVA)、その後の事後テューキーの多重比較検定を使用して、ABR 閾値シフト、HC、SGN、およびシナプス数の統計的差を分析します。
- すべてのデータを平均誤差±標準誤差として表示し、統計的有意水準をp < 0.05に設定します。
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結果
LISW波形
LISW圧力波形の再現性は、以下のように2.0J/cm2 で5倍に測定しました。波形は概ね類似しており安定しており、時間幅、ピーク圧力、インパルスが0.43±0.4 μs、92.1 ± 6.8 MPa、14.1 ± 1.9 Pa・s(SDの中央±値)と急激に増加し、これはSW特性に相当します(図1B)。LISWは、立ち上がり時間が速く、ピーク圧力が高く、持続時間が短く、正圧が優勢であるという特徴があります。生体組織に塗布すると、ゼリーを介して標的を直接生体組織上に配置するため、測定したSWを組織に塗布した場合とほぼ同じ特性を持つと考えられます。LISWへの曝露後、TMPの発生は小型のデジタル内視鏡を用いて評価された。LISWエネルギー群のマウスはいずれも、ばく露後にTMPを示さなかった(図1C)。
聴覚評価
聴覚機能を決定するためにABR検査が行われ...
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ディスカッション
この研究は、LISWを使用して爆風誘発性蝸牛損傷のマウスモデルを検証することを目的としています。私たちの調査結果は、側頭骨を介してLISWを適用した後、ばく露したマウスの耳は、蝸牛の一貫した病理学的および生理学的低下を示し、それに伴うLISW過圧の増加を伴ったことを示しました。これらの結果から、このマウスモデルは、LISW出力を調整することにより、さまざまな蝸牛の病状を再現するのに適していることが示されています。具体的には、このLISW誘発性蝸牛機能障害マウスモデルは、制御され、再現性があり、定量化可能な性質と、制御された条件下で病態生理学的蝸牛の衰退を再現する能力があるため、優れた蝸牛損傷モデルとして役立つ可能性があります。
私たちの以前の研究では、ラットモデルを使用し、聴力閾値の上昇、シナプスリボンの喪失、立体毛束の破壊など、LISW による蝸牛変性を観察しました14。別の研究では、ブラスト損傷後のマウスの蝸牛変性症について、ブラストチューブを用いた低周波ドミナン...
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開示事項
著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
本研究は、日本学術振興会科研費の2件(課題番号:21K09573 (K.M.)および23K15901 (T.K.))の助成を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 532 nm QスイッチNd:YAGレーザー | Quantel | Brilliant b | |
| ABR ピーク解析ソフトウェア | Mass Eye and Ear | N/A | EPL 蝸牛機能試験スイート |
| アクリル樹脂溶接接着剤 | Acrysunday Co., Ltd | N/A | |
| 共焦点蛍光顕微鏡 | Leica | TCS SP8 | |
| 凍結切片化合物 | Sakura | Tissue-Tek O.C.T | |
| CtBP2 antibody | BD Transduction | #612044 | |
| 誘電体多層ミラー | シグマコーキ | TFMHP-50C08-532 | M1-M3 |
| デジタルオシロスコープ | テクトロニクス | DPO4104B | |
| イヤホン | CUI | CDMG15008-03A | |
| ハイドロフォン | RPアコースティックス | ||
| Image J software plug-in | NIH | measurement line | https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD |
| Light microscope | Keyence Corporation | BZ-X700 | |
| Myosin 7A antibody | Proteus Biosciences | #25–6790 | |
| ニューロフィラメント抗体 | Sigma | #AB5539 | |
| 平凸レンズ | シグマコキ (株 | SLSQ-30-200PM | |
| プリズムソフト | GraphPad | N/A | ver.8.2.1 |
| 走査型電子顕微鏡 | 日本電子 | JSM-6340F | |
| 小型デジタル内視鏡 | AVS社 | AE-C1 | |
| 超音波ゼリー | 日立アロカメディカル | N/A | |
| 可変減衰器 | 昭和オプトロニクス(株) | N/A | 現在利用可能な後継機:京セラSOC株式会社 RWH-532HP II |
| 水溶性封止材 | だこ | #S1964 |
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