新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

サマリー

ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を迅速かつ安価に確認できる蛍光アッセイについて説明します。このアッセイは、化合物が弱鉄キレート蛍光プローブCalceinの鉄結合活性を凌駕する能力を測定し、キレート化が起こると蛍光が定量化可能に増加します。

要約

がん細胞は、増殖を維持するために大量の鉄を必要とします。鉄代謝はがんの特徴と考えられており、鉄は抗がんアプローチの有効な標的となっています。新規化合物の開発とさらなる修飾のためのリードの同定には、メカニズムの証明アッセイを実施する必要があります。増殖への影響を評価するための多くのアッセイがあります。しかし、鉄をキレート化する能力は、機器のコストが高く、キレート化の強度を迅速かつ再現性よく定量化することが課題であるため、重要でありながら見過ごされがちなエンドポイント指標です。ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を確認するための、定量可能で安価な無細胞蛍光法について説明します。当社のアッセイは、市販の安価な蛍光色素であるカルセインに依存しており、その蛍光はほとんどの蛍光マイクロタイタープレートリーダーで定量化できます。カルセインは弱い鉄キレート剤であり、Fe^{2 + / 3 +}に結合するとその蛍光は消光されます。蛍光は、新規のキレート剤が結合したFe^2+/3+でカルセインを凌駕すると回復します。蛍光消光の除去とそれに伴う蛍光の増加により、新規推定キレート剤のキレート化能力を決定することができます。そのため、新規候補キレート化合物の迅速なスクリーニングを可能にする、安価でハイスループットなアッセイを提供しています。

概要

生物学的能力の変化という共通のセットを通じてがんの発生に関連する細胞の表現型の変化は、現在、一般的にがんの特徴と呼ばれています。その中には、エネルギー代謝の再プログラミングに起因する変化があり、これはがん細胞生物学¹で広く見られます。このような代謝のリプログラミングには、急速な増殖と腫瘍の成長をサポートするための鉄の必要性の増加が含まれます²。この鉄への渇望は、鉄代謝の調節不全につながり、それ自体が癌の特徴と考えられており^3,4、すべての段階で調節不全が起こります⁵。転移の特徴は、より最近ウェルチとハーストによって提唱され、鉄が酸化ストレスを誘発し、これがゲノム、エピゲノム、およびプロテオームの変化を媒介し、転移の可能性を高めることができるため、鉄⁶の役割^{が含まれる。}鉄分濃度とがんの発生増加との関連は、疫学研究を通じて実証されています⁸。

がん細胞は大量の鉄を必要とするため、鉄欠乏症になりやすく、したがって鉄キレート化されやすくなります。私たちは最近、NDRG1が発がん性シグナル伝達経路⁹を阻害することにより、がんのいくつかの特徴を逆転させる鉄キレート化の可能性を強調する総説を発表しました。しかし、鉄キレート化を単独のがん治療として使用することは、その毒性、短い半減期、急速な代謝、および新たな耐性メカニズムのために、臨床試験で肯定的な結果をもたらしていません。それにもかかわらず、鉄キレート剤は in vitro および in vivo の研究で有望であることが示されており、がん治療に有効な鉄キレート剤を開発するにはさらなる研究が必要であることを示しています。特異的な鉄キレート化は、抗がん剤の創薬において検証された戦略ですが、これまでに報告されているクラスはごくわずかです¹⁰。

新規の鉄キレート剤の同定と特性評価には、いくつかのエンドポイントに対するその影響を測定する能力が必要です。これらの多くは(増殖、アポトーシス、活性酸素種形成など)日常的に測定されており、がんの特徴を評価する方法として文献で概説され、レビューされています¹¹。新規の鉄キレート剤を評価する際、多くのグループは、鉄の流入または排出への影響だけでなく、抗増殖活性および酸化還元活性への影響も定期的に調査しています。 インシリコ 予測技術¹² は、スクリーニング可能な鉄キレート剤の増大するプールをさらに増やす。

鉄キレート剤のクリーニングには、原理の証明を効果的に示す手段として、鉄レベルへの影響を測定する能力が必要です。現在、最も一般的な方法はフローサイトメト^リー13ですが、これはコストと時間がかかり、定量化が困難です。アッセイの選択は、多くの場合、実験装置の利用可能性、速度、およびアッセイのコストに基づいています。したがって、鉄をキレート化する能力は、機器のコストが高く、キレート化の強度を迅速かつ再現性よく定量化することが課題であるため、見落とされるエンドポイントの尺度になる可能性があります。ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を確認するための、定量可能で安価な無細胞蛍光法について説明します。

プロトコル

1. 原液調製

1. カルセインストック溶液を調製する際は、溶液を暗所に保管することで写真の劣化を防ぎます。マグネシウムまたはカルシウムを含まない、ダルベッコのPBS中のカルセインの1 mM溶液を調製します¹⁴。5 mLの1 mMカルセイン溶液の場合、3.1 mgのカルセイン(622.5 g / M)を5 mLのダルベッコPBSに加えます。.カルセインの1 mMソックスを使用して、 表1に詳述されているように、マイクロチューブ内の二次ストック溶液の1 mLアリコートを調製します。
2. 19 mgのFAS六水和物(392.1 g / M)を5 mLのダルベッコPBSに溶解して、10 mMの硫酸第二鉄アンモニウム(FAS)溶液を得ることにより、硫酸第二鉄アンモニウム六水和物ストックを調製します。FASの二次ストックを希釈して調製します。2 mM FAS(fA)のストックを調製するには、10 mM FASストックの200 μLをPBSで希釈し、800 μLのDulbecco's PBSで希釈します。100 μM FAS(fB)のストックを調製するには、50 μLのストックfAを950 μLのダルベッコPBSで希釈します。
3. 10 mMのデフェリプロンストックを調製するには、2.8 mg(139.15 g / M)を2 mLのダルベッコPBSに溶解します。.10 mMストックの200 μLを800 μLのダルベッコPBSで希釈して、2 mM鉄キレート剤の二次ストックを調製します。
   注:このアッセイでは、選択した鉄キレート剤は、マグネシウムまたはカルシウムを含まないダルベッコPBSに溶解する必要があります。作業の例として、鉄キレート剤のデフェリプローンを使用しました。

2. カルセイン蛍光の線形範囲の決定によるアッセイの検証

1. ストック溶液表( 表1を参照)に記載されているように、1 mMから1 μMの範囲のカルセインストックを調製します。光化学的な劣化を防ぐために、ストック溶液は暗所に保管してください。
2. 90 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を、シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、96 ウェルプレートのウェル A から H および 1 から 12 にピペットで移します。
3. シングルチャンネル手動ピペットを使用して、1 mM Calceinストック10 μLを96ウェルプレートの列12、行AからHに加えます。
4. シングルチャンネルマニュアルピペットを使用して、あらかじめ調製した800 μMカルセインストック(表1)10 μLをカラム11の列AからHの96ウェルプレートに加えます。
5. 表1のストックで添加手順を繰り返し、カラム10に400μMのストックを10μL、カラム9に200μMストックの10μLなどを含めます。カラム 2 に 1 μM ストックが 10 μL 含まれるまで、カラム全体でこの段階的な手順を続けます。
   注:各ウェル中のカルセインの最終濃度は、1:10の希釈により、ストック溶液よりも10倍低くなっています。
6. 10 μL の PBS を列 1 の A 行から E まで加えます。
7. 室温で30分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー上の分析装置を励起490 nm、検出530 nm(またはカルシアン蛍光に適したフィルターセット)に設定します。

3. Fe²⁺ イオンクエンチングによるカルセイン蛍光の低減のためのアッセイバリデーション

1. 10 μM の Calcein (cB) ストックと 2 mM の FAS ストック (fA) を調製します ( 「材料の表」を参照)。カルセインストックは、光劣化を防ぐために暗所に保管してください。
2. シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、50 μL の PBS を列 2 から 10、行 A から E に添加します。PBSを11列目に追加しないでください。
3. シングルチャンネル手動ピペットを使用して、2 mMのFAS(fA)ストック100 μLをカラム11(行AからE)の96ウェルプレートに加えます。
4. マルチチャンネル手動ピペットを使用して、カラム11から50μLのfAを除去し、すでにカラム10にあるPBSにピペットで移し、ピペッティングで十分に混合します。
5. この段階的な二重希釈手順を96ウェルプレートの列9〜2、行A〜Eにわたって続け、ピペッティングで混合します。
6. カラム2からピペッティングして溶液50 μLを取り出し、溶液を廃棄します。
7. 溶液が入ったすべてのウェル(列2〜12、行A〜E)に40μLのPBSを加えます。
8. 90 μL の PBS をウェル列 1 の行 A から E に添加します。これらのウェルは、1 μM カルセインと 0 μM FAS のポジティブコントロールとして機能します。
9. 溶液が入った各ウェル(列1〜12、行A〜E)に10 μLの10 μMカルセインストック(cB)を加えます。この結果、カラム 11 の最高濃度は 1000 μM FAS となり、カラム 10、9、8 からカラム 2 にかけて FAS 濃度は半減します。カラムから得られた各ウェルには、1 μM のカルセインと希釈された FAS が含まれています。
10. PBS単独コントロールについては、列1〜5の行FにPBS100μLを添加します。FAS単独制御のために、列6から10の行Fに2 mMのFASを100 μL加えます。暗所で室温で10分間インキュベートします。
11. 励起490 nm、検出530 nmに設定されたマイクロプレートリーダー(またはカルセイン蛍光に適したフィルターセット)で分析します。

4. 鉄キレート剤がFe 2+イオンについて弱いキレート剤カルセインを凌駕する能力を定量化するためのアッセイ

1. 表1に示すように、カルセインストック(cB)10 μM、FASストック(fB)100 μM、鉄キレート剤ストック2 mMを調製します。カルセインの在庫は、光分解を防ぐために暗闇に保管してください。
2. シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、96ウェルプレートの列2〜10、行A〜Eに50μLのPBSを追加します。PBSを11列目に追加しないでください。
3. 鉄キレート剤の2 mMストック(fA)100 μLを、シングルチャンネル手動ピペットを使用して、列11、行AからEの96ウェルプレートに加えます。
4. マルチチャンネル手動ピペットを使用して、カラム 11 から 50 μL の fA を除去し、カラム 10 の A 行から E の PBS にピペットでピペットで入れ、ピペッティングで完全に混合します。
5. この段階的な二重希釈手順をプレートの残りの列9〜2、行A〜Eにわたって続け、ピペッティングにより各ウェルを混合する。カラム 2 から 50 μL を取り出して廃棄します。これにより、96ウェルプレートの列11〜2、行A〜Eにわたって2mMの鉄キレート剤(デフェリプロン)が2mMで希釈されます。
6. 溶液が入ったすべてのウェル(例:列2〜11行AからE)に30μLのPBSをピペットで入れます。
7. マルチチャンネルピペットを使用して、10 μL の 100 μM FAS ストック (fB) を列 2 から 12 の列 A から E に加えます。これにより、各ウェル中の濃度は 1 μM のカルセインと 10 μM の FAS となり、キレート剤は 2 倍希釈され、プレート (カラム 11-2) 全体で各カラムの濃度が半減し、カラム 11 ウェル A から E の鉄キレート剤の濃度は 1000 μM になります。
8. マルチチャンネルピペットを使用して、10 μL の 10 μM カルセインストック (cB) を列 2 から 12 の列 A から E に加えます。
9. PBS80 μL、カルセインストック(cB)10 μL、FASストック(fB)10 μLをピペットで1列目のA-E列にピペットで移します。ピペッティングでサンプルを混合します。これにより、1 μM カルセインを 10 μM FAS で制御し、キレート剤は使用しません。
10. PBS100μLをF列1から5列にピペットで移します。これにより、PBSネガティブコントロールが提供されます。
11. 2 mMの鉄キレート剤(デフェリプロン)100 μLをF列6〜10列に加えます。これにより、キレート剤のみの制御が可能になります。
12. 暗所で室温で10分間インキュベートします。490 nm で励起、530 nm で検出するように設定されたマルチモーダルマイクロプレートリーダー(またはカルシアン蛍光に適したフィルターセット)で分析します。

5. データ分析

1. カルセイン蛍光の線形範囲の決定によるアッセイバリデーションのための分析。
   1. ステップ 1 の 96 ウェルプレートの列にあるカルセインの各濃度について、行 A-H の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算し、濃度に対してプロットします。X 軸のカルセイン濃度の折れ線グラフと Y 軸の平均 RFU をプロットし、線形回帰を使用して最適な線を提供します。
   2. 各列(2-11)のカルセイン濃度を列1の行AからEのPBSのコントロールと比較することにより、統計的有意性を定量化します分散分析(ANOVA)を実行し、最小有意差(LSD)を使用してp<0.001のしきい値で事後分析を適用し、統計的有意性を決定します( 図1の**で示されます)。
2. Fe²⁺ イオンクエンチングによるアッセイバリデーションのための解析で、カルセインの蛍光を低減します。
   1. 列 2 から 11 の FAS の各濃度について、行 A から E の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算します。各FAS濃度の平均RFUをy軸にプロットします。X軸では、Log2スケールを使用してFASの濃度をプロットし、データをより適切に分散させます。線形回帰を使用して最適な直線をプロットします。
   2. PBS、1 μM カルセイン、0 μM FAS (列 1 行 A から E) のコントロールの各列平均から平均 RFU までを比較することにより、統計的有意性を定量化します。LSDのポストホック分析で分散分析をp <0.001のしきい値で実行し、統計的有意性を判断します。
3. アッセイのための分析:鉄キレート剤がFe²⁺ イオンについて弱いキレート剤カルセインを凌駕する能力を定量化します。
   1. 列 2 から 11 のキレート剤の各濃度について、行 A から E の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算します。各キレート剤濃度の平均RFUをy軸上にプロットします。x軸では、データをよりよく分布させるため、Log2スケールを使用してキレート剤の濃度をプロットします。
   2. PBS 1 μM Calcein と 10 μM FAS のコントロールの各列平均 RFU (列 1 行 A から E) を比較することにより、統計的有意性を定量化します。LSDのポストホック分析で分散分析をp <0.001のしきい値で実行し、統計的有意性を判断します。

結果

ステップ2で示した方法では、この最初の実験(図1)により、カルセイン蛍光発光を検出する際のマイクロタイター蛍光プレートリーダーの線形範囲が確立されました。私たちの代表的な結果は、0〜100μMのカルセイン蛍光の広い線形範囲を示しています。LSDの事後分析によるANOVAは、0μMのカルセインのコントロールと比較した場合、すべてのカルセイン濃度の平均RFUに統計的に有意な差があることを示しています。さらなる実験では、0 μMコントロールと統計的に有意な差を生じ、フローサイトメト^リー13でカルセインAMの形で細胞に一般的に適用される範囲内に収まるため、1 μMカルセインを使用しました(ステップ3および4)。

ステップ3で示した方法では、Fe²⁺ の形態の鉄を0〜1000μM(FASとして)から1μMのカルセインの範囲で添加すると、Fe²⁺ イオンによってカルセイン蛍光(RFU)が直線的に減少することを示しています。これにより、カルセイン蛍光のFe²⁺ ベースの消光を観察することができます。カルセインは弱い鉄キレート剤として鉄を結合し、これにより蛍光出力が減少します。 図2では、8.9 μM FAS以上の濃度では、1 μMのカルセイン単独と比較して、カルセイン蛍光のp<0.001の有意な減少が示されました。8.9 μM の FAS を使用した場合、カルセイン蛍光 (平均 RFU) が 33% 減少しました。さらなる実験(ステップ4)では、10 μM FASがカルセインの蛍光消光範囲内に収まったため、FASを使用しました。

ステップ4で示した方法では、鉄キレート剤によるFe²⁺ イオンに対するカルセインの競合を 図3で観察できます。Fe²⁺ の形態の鉄は、1 μMコントロールからのカルセイン蛍光を減少させ、鉄キレート剤デフェリプロンはこの蛍光をピークまで増加させ、カルセインの鉄消光を放出し、蛍光を増加させます(平均RFU)。0.97〜512μMの範囲の濃度でデフェリプロン(模範として使用)すると、ANOVAおよびLSDの事後分析で観察された蛍光が統計的に有意に増加しました(p<0.001)。最大の倍率変化は、1 μM のカルセイン AM と 10 μM の FAS の対照と比較した場合の、62.5 μM のキレート剤での平均 RFU が 3 倍に変化したことです。512 μMのデフェリプロンを超える場合、キレート剤と1 μMのカルセインおよび10 μMのFASのコントロールとの間に統計的に有意な差はありませんでした。.

図1:蛍光マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定したカルセイン濃度と蛍光(RFU)。 0-100 μMのカルセイン濃度を30分間インキュベートし、測定した蛍光(RFU)をここに示します。データは、実験ごとに8回の反復と3つの独立した実験の平均を示しており、エラーバーは平均の95%信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp<0.001は、ANOVAおよびLSDの事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。各濃度の平均カルセインRFUを、PBSおよび0 μMカルセインのコントロールと比較します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:FASの濃度が増加すると、カルセイン蛍光が直線的に減少します。 FASの濃度は、PBSでの30分間のインキュベーション後に1μMのカルセイン蛍光の線形減少をもたらした0〜1000μMから増加した示されているデータは、実験ごとに5回の繰り返しの平均と3つの独立した実験であり、エラーバーは平均で95%の信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp<0.001は、ANOVAおよびLSDの事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。各濃度のFASおよび1 μMのカルセインの平均RFUを、PBS中の1 μMのカルセイン0 μMのFASの対照と比較します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:デフェリプロンの濃度の増加。 デフェリプロンの濃度は、PBS中の1μMカルセイン、10μMのFASをインキュベートして0〜1000μMに増加させました。 蛍光は、マルチモーダルマイクロプレートリーダーで測定しました。示されているデータは、実験ごとに 5 回の反復と 3 回の独立した実験の平均であり、エラーバーは平均の 95% 信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp<0.001はANOVAおよびLSD事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。平均RFUは、PBS中の1μMカルセインと10μMのFASおよび0μMのデフェリプロンと比較した場合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

濃度(μm)	ボリュームは(1 mMストック)	PBSの量	総ボリューム
800	800 μL	200μL	1 mLの
400	400μL	600μL	1 mLの
200	200μL	800 μL	1 mLの
100	100μL	900μL	1 mLの
50	50 μL	950μL	1 mLの
25	25μL	975μL	1 mLの
10	10 μL	990 μL	1 mLの
6	6 μL	994 μL	1 mLの
2	2 μL	998μL	1 mLの
1	1 μL	999μL	1 mLの

表1:カルセイン二次ストックの調製。

ディスカッション

がんが代謝を促進するために鉄に過度に依存しているため、鉄キレート化は治療体制に追加される可能性があります⁴。しかし、新規の金属イオンキレート剤が鉄イオンに結合する能力を迅速にスクリーニングする能力は限られています。一般的に使用され、広く入手可能な蛍光プローブCalceinは、弱い鉄キレート剤として作用し、鉄イオンによる結合がCalcein蛍光を消光することが知られています。その後、より強力な鉄キレート剤を使用して鉄への結合を競うことにより、蛍光を回復することができます。カルセインが鉄に結合するときに観察される蛍光の減少と、より強力なキレート剤に対抗すると蛍光が回復することは、鉄キレート化の可能性のある新規化合物を迅速かつ簡単にスクリーニングする方法を提供します。カルセインベースの技術¹³ は、キレート剤が細胞内の鉄に結合する能力を視覚化するためにすでに使用されていますが、これらの技術は高価なフローサイトメトリー装置を必要とし、半定量的であり、広範なスタッフのトレーニングと、カルセインのより高価な細胞透過型であるカルシアン-AMの使用を必要とします。さらに、この手法は再現性が低く、統計解析によるデータの重要性の決定を容易には促進しません。そこで、私たちは、新規化合物の鉄キレート能力のファーストパススクリーニングとして作用する、簡便で安価な in vitro 法を創製しました。この無細胞アッセイは、鉄キレート化能力のファーストパスハイスループットスクリーニングとして、高価な細胞培養法の要件を廃止します。

鉄に依存して代謝適応を促進するため、がんを標的とするために使用できる可能性のある新規の鉄キレート剤のスクリーニングまたは開発への関心が高まっています²。この論文では、弱いキレート剤であるカルセインを凌駕することにより、新規化合物が鉄をキレート化する能力を確認するために使用できる in vitro 技術について説明します。これにより、新規化合物の鉄キレート化能力を簡便に、定量的に、安価にスクリーニングすることができます。

このプロトコールの重要なステップの1つは、蛍光マイクロタイタープレートリーダーの線形範囲を確立することです(図1)。カルセインは、501 nmの励起ピークと521 nmの発光ピークを中心とする広い蛍光励起スペクトルと蛍光スペクトルを持っています。しかし、カルセインの線形範囲は、カルセイン蛍光発光を励起および検出するために使用されるフィルターに依存する場合があり、検出に使用される光電子増倍管の線形範囲も部分的に線形範囲を決定します。したがって、まず、カルセイン蛍光が直線性である濃度の範囲を確立し、蛍光プレートリーダー上のカルセインの線形範囲内でアッセイが機能していることを確認することが重要です。0 から 100 mM のカルセインの間で線形性が観察されたことを考えると、これはカルセインが広い線形範囲を持つことを示しています。さらに、蛍光マイクロタイタープレートリーダーには、最も一般的に使用される緑色発光蛍光色素と同様のスペクトルを持つカルセイン蛍光を測定できるフィルターセットが一般的に備わっています。したがって、このアッセイは幅広いユーザーに広く適用できます。

FASは、細胞内の不安定な鉄プールの主要な鉄イオンであるFe²⁺ イオンを提供するため、鉄イオン供与体としてFASを使用することが好ましい。しかし、ここに示すものと同様の結果(図2)は、Fe³⁺ を提供する塩化第二鉄アンモニウム(FAC)でも達成されています(データは示していません)。したがって、このアッセイは、鉄イオンの両方の酸化還元状態に適合し、これらの酸化還元状態のいずれかを優先してキレート剤への適用性を広げます。

この研究では、鉄キレート剤Deferiproneのデータを提示しますが、このアッセイを使用して、ミモシンを含む他の鉄キレート剤が鉄イオン結合でカルセインを凌駕する能力も評価しました(データは示されていません)。このアッセイの限界の1つは、キレート剤デフェリプロンの512 mMを超えると、1 μMのカルセインと10 μMのFASの対照と比較して、蛍光の統計的に有意な増加が見られなかったことです。高濃度のキレート剤が蛍光の増加をもたらさない理由は不明ですが、これは他のキレート剤で観察されています(データは示されていません)。ただし、リード治療用化合物は、リード化合物の有効性に必要な濃度範囲でアッセイが機能するように、<100 μMで作用する必要があります。

したがって、このアッセイにより、潜在的な鉄キレート剤を迅速にスクリーニングして、メカニズムの証明として鉄をキレート化する能力を調べることができます。これは、新規のキレート剤を高価で手間のかかる細胞ベースまたは in vivo アッセイでスクリーニングする前の重要な第一歩です。このアッセイの限界は、水性溶媒を使用して行われるため、キレート剤が水性緩衝液に可溶である必要があることです。しかし、この研究で使用された最高濃度が小さな親油性鉄キレート剤^である10 mMデフェリプロンであったことを考えると、水性溶解度が限られているキレート剤を試験することができます。

結論として、ここで説明するアッセイは、がん治療薬開発の継続的な焦点である新規鉄キレート剤のスクリーニングにおいて価値があることが証明される可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
硫酸アンモニウム鉄(II)、六水和物	シグマ-アルドリッチ	、215406	、その他の賢明なFAS
カルセイン	シグマ-アルドリッチ	、C0875
デフェリプロン	、シグマ-アルドリッチ	、
ダルベッコ&プライムとして知られています。リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	D5652	マグネシウムおよびカルシウムを含まない
Greiner CELLSTAR 96 ウェルプレート	Sigma-Aldrich	M0812	光学的に透明な 96 ウェルプレートが機能します