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方法論記事

Yeast Two-Hybrid Assayを用いたInteraction-Null/Impaired Mutantsの単離

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DOI:

10.3791/66423

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2023年12月29日

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

この記事について

サマリー

タンパク質間相互作用などの生体分子の相互作用は、生体機能の分子基盤です。特に関連する相互作用を欠く相互作用ヌル/障害のある変異体を分離できれば、この相互作用の機能を理解するのに大いに役立ちます。この記事では、interaction-null/障害のある変異体を効率的に分離する方法を紹介します。

要約

タンパク質間相互作用は、生命現象の根底にある最も基本的なプロセスの1つです。特定のタンパク質間相互作用の役割と機能を理解する最も簡単で最良の方法の1つは、野生型(関連するタンパク質間相互作用を持つ)の表現型と、関連する相互作用を欠く突然変異体の表現型を比較することです。したがって、そのような突然変異体を単離することができれば、関連する生物学的プロセスの解明に役立ちます。酵母ツーハイブリッド(Y2H)法は、タンパク質間相互作用を検出するだけでなく、相互作用ゼロ/障害のある変異体を単離するための強力なアプローチです。この記事では、Y2H技術を使用して相互作用ヌル/障害のある変異体を単離するためのプロトコルを紹介します。まず、ポリメラーゼ連鎖反応と効率的なシームレスクローニング技術を組み合わせてミューテーションライブラリを構築し、空のベクターをライブラリから効率的に排除します。次に、相互作用がゼロ/障害のある変異体をY2Hアッセイによってスクリーニングします。Y2Hベクトルのトリックにより、フレームシフトやナンセンス変異を持つ変異体などの望ましくない変異体は、スクリーニングプロセスから効率的に排除されます。この戦略は単純であるため、2ハイブリッドシステムによって相互作用を検出できるタンパク質の任意の組み合わせに適用できます。

概要

生体分子間の相互作用は、生命現象の最も基本的な部分です。タンパク質間相互作用は、そのような相互作用の重要な部分を構成します。したがって、目的のタンパク質/遺伝子の機能をさらに解明するためには、目的のタンパク質の相互作用パートナーを特定することが重要です。酵母ツーハイブリッド(Y2H)法は、 in vivo1でタンパク質間相互作用を同定するための一般的な手法です。このシステムでは、相互作用が試験される2つのタンパク質(XとY)が、それぞれDNA結合(DB)ドメインと転写活性化ドメイン(AD)に融合します。DB-X融合タンパク質は、DBドメインの認識配列に結合します。したがって、タンパク質XとYが相互作用すると、AD-Y融合タンパク質は認識配列の近接性になります。その結果、認識配列の下流にあるレポーター遺伝子の転写が活性化されます。したがって、レポーター遺伝子活性の有無を用いて、タンパク質間相互作用の有無を決定することができる1。

目的のタンパク質の特定の相互作用パートナーが特定されたら、相互作用の生物学的機能を解明するために、さらなる分析を行う必要があります。この目的のために、特定のタンパク質間相互作用を損なう、または除去するタンパク質の変異体を単離できれば、それらは強力なツールとして機能します。Y2Hシステムは、野生型の「相互作用陽性」クローンから始めて、「相互作用陰性」クローンをスクリーニングすることにより、そのような変異体を単離するために直接使用できます。このプロセスを加速するために、「逆」Y2H(rY2H)システムが開発されました2,3。rY2Hシステムでは、宿主酵母株はレポーター遺伝子としてカウンター選択可能なマーカー遺伝子を保有しており、AD-Yタンパク質とDB-Xタンパク質が相互作用しない場合にのみ酵母細胞が増殖します。

Y2HシステムとrY2Hシステムの両方で相互作用陰性の変異体の単離が可能ですが、スクリーニングによって得られたすべての候補が目的のタイプの変異(通常はミスセンス変異)を持っているわけではないため、変異体を単離するプロセスは面倒です。最も深刻な問題は、候補のかなりの割合がフレームシフトまたはナンセンス変異を保有しており、望ましくないクローンを除外するためにウェスタンブロッティングを行う必要があることです。この問題を解決するために、新しいプラスミドベクターが開発されました4。これらのベクターでは、薬剤耐性マーカーであるKanMXは、DBドメインまたはADの下流にアウトオブフレームに配置されています。マーカー遺伝子は、目的の遺伝子が挿入された場合にのみ、DBドメインまたはADとインフレームになります。目的の遺伝子にランダムな突然変異が導入されると、フレームシフトまたはナンセンス変異を有するものなどの望ましくない突然変異体は、薬剤耐性選択を行うことによって容易に排除することができ、望ましいミスセンス変異を有する候補は、Y2Hスクリーン4で容易に同定することができる。この記事では、この戦略を使用して目的のタンパク質の相互作用ゼロ/障害のある変異体を単離するためのプロトコルを紹介します。

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プロトコル

1. ミュータントライブラリの構築

  1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を設定します(例を以下に示します)。一般的には、5μLの10アリコートに分割された反応液を50μL調製し、PCRマシン4で標的遺伝子断片を増幅する。
    注:ユーザーは、変異を効率的に導入するために適切なポリメラーゼを選択する必要があります。増幅するDNA断片が短い場合、校正活性を欠くTaqポリメラーゼなど、エラー率の高いポリメラーゼが必要になります。増幅するDNA断片が長い場合、突然変異の数を減らすために、より忠実度の高いポリメラーゼが必要です。突然変異は、通常のTaqポリメラーゼ4による30サイクルの増幅後、数百塩基対ごとに発生します。代表的な結果では、通常のTaqポリメラーゼよりも高い忠実度を持つ異なるTaqポリメラーゼ( 材料表を参照)が使用され、突然変異率は600塩基対に1つでした。PCR混合物の例、プライマーの詳細、および反応条件は、 補足ファイル1に記載されています。
  2. PCRが完了したら、反応液を全て組み合わせ、目的のDNA断片がアガロースゲル電気泳動などを用いて増幅されたことを確認し、DNA5を精製します。
  3. ステップ1.2で生成したDNAフラグメントを、「シームレス」クローニング戦略を使用して、適切なY2Hベクターとアセンブルします(図1)。
    注:Gibson assembly6などのシームレスクローニングシステムは、セルフライゲーション によって生成された 空のベクターによる構築された変異体ライブラリの汚染を最小限に抑えます。Y2Hベクトルのリストを 表1に示します。組み立て前にBamHI消化法で調製することができます。すべてのプラスミドは、National BioResource Project - 酵母から入手できます( 材料の表を参照)。
  4. ステップ1.3で生成した反応混合物を、高効率の大腸菌形質転換プロトコル(例:井上ら7)に従って調製した大腸菌コンピテントセルに導入します。適切な抗生物質を含むいくつかのLBプレート(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1%NaCl、および2%寒天)にすべてのコンピテントセルを広げます(材料の表を参照)。この時点で、少量(全反応量の~1/100)を同じ選択プレートに広げて、ライブラリー力価を計算します。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
  5. 大 腸菌 のコロニーが大量に出現したら、使い捨てのプラスチックループを使用してプレートの表面からすべての細胞をこすり落とします。これらの細胞からプラスミドDNAを回収するには、アルカリ溶解8などの一般的な方法を使用します。同時に、プレート上に形質転換混合物の小さなアリコートを広げた後に現れるコロニーの数を数えます。この数を使用して、ライブラリ内の独立したクローンの総数を見積もります。
    注:この時点で、形質転換反応の小さなアリコートが広がったプレート上に現れるいくつかの独立したコロニー(4-6)をピックアップし、それらを別々に培養し、それらからプラスミドを単離して、事実上すべてのクローンが目的のDNA断片5を持っていることを確認します。 大腸菌からプラスミドを単離するための多くの市販キットが利用可能です。小さなアリコートを広げた後にプレートに現れるコロニーの数は、手動でカウントできます。
  6. ライブラリDNAプールの濃度を測定します。通常、次のステップで数千の形質転換体を得るには、数百ナノグラムのライブラリーDNAで十分です。
    注:A260 の測定はしばしば不正確であるため、DNAに結合する蛍光色素を使用してDNA濃度を測定することをお勧めします。

2. 変異体ライブラリーとレプリカプレーティングによる酵母の形質転換

  1. 宿主酵母株(TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ)に変異ライブラリーを導入し、約100 ngのDNAを用いたY2Hアッセイを行います。宿主細胞を「ベイト」プラスミドで事前に形質転換します。
    1. 形質転換手順の後、酵母細胞を滅菌水に懸濁し、適切なプレート(通常、ロイシンとトリプトファンを欠くSC培地:SC-LW [0.67%酵母窒素ベース、2%グルコース、1.546 g / L SCダブルドロップアウトミックス-Leu-Trp、および2%寒天、 材料の表を参照])に広げます。これらのプレートを30°Cで一晩インキュベートします。
      注:酵母の形質転換には、~5 × 106の対数的に増殖する細胞を用いた酢酸リチウム-PEG法11などの標準プロトコルで十分です。エレクトロポレーションなど、変換効率の高い別の方法も使用できます。
  2. 翌日、小さなコロニーが現れたら、適切な細胞数(500〜2000)のプレートを選択し、次のようにそれらから複製を行います。
  3. レプリカブロックに濾紙を2枚セットして、複数のレプリカを作成します(媒体はSC-LWとカナマイシンを含むSC-LWです)( 材料表を参照)。30°Cで1〜2日間インキュベートします。
    注:カナマイシン(G418)の濃度は600μg/ mLです。.レプリカメッキにベルベットを使用しないでください。コロニーの解像度が失われます。
  4. コロニーが成長したら、プレートを比較して候補を選びます。 lacZ をレポーターとして使用する場合は、Y2Hカラーアッセイ(ステップ3を参照)を実施します。
    注:Y2Hレポーターの場合、 通常、lacZ は HIS3よりも弱い相互作用の検出に優れています。

3. Y2Hカラーアッセイ

  1. 手順2で準備したレプリカプレートに、あらかじめ適切なサイズにカットした濾紙を置きます。ろ紙とプレートの間に気泡が入らないように注意してください。
    注意: No.4A濾紙またはグレード50濾紙を使用してください( 材料の表を参照)。レプリカめっきで作られたカナマイシンプレートを含むSC-LWまたはSC-LWは、カラーアッセイに使用できます。
  2. プレートのろ紙が完全に湿ったとき(ろ紙の色が完全に変わったとき)は、ペーパータオルを数枚上に置き、濾紙に接触させて余分な水分を取り除きます。ペーパータオルが水を吸収して色が変わったら取り外します。このプロセスを2、3回繰り返します。
  3. 濾紙の端をピンセットでつまみ、さっとプレートから剥がし、液体窒素に浸して冷凍します。液体窒素が利用できない場合は、濾紙をコロニー面を上にしてプラスチックトレイに置き、すぐに冷凍庫(-20°C〜-80°C)に置いて完全に凍結します。
  4. 凍った濾紙を取り出し、コロニー側を上にして、乾いたペーパータオルの上に置いて解凍します。解凍後すぐに、プラスチックトレイまたは密封可能な容器に置き、X-gal(5-ブロモ-5-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド)と2-メルカプトエタノール9を含むZバッファー(60 mM Na2HPO4、40 mM NaH2PO4、10 mM KCl、および1 mM MgSO4、pH 7.0)に浸した別の濾紙に、コロニー側を上にして濾紙を置きます(資料表を参照)。).上部と下部の濾紙の間に気泡が入らないように注意してください。
  5. 濾紙が入ったプラスチックトレイに蓋をして、密閉容器またはビニール袋に入れます。密閉容器またはビニール袋を閉じ、青色が出るまで37°Cでインキュベートします。
  6. 青色が出てきたら、きれいなプラスチックトレイに約500μLの停止液(1 M Na2CO3)の上にコロニー面を上にして濾紙を置きます。ストップソリューションはすぐに染み込みます。したがって、すぐにフィルターを取り外し、コロニー側を上にして新しいペーパータオルの上に置き、乾かします。
  7. ペーパータオルを交換し、フィルターが十分に乾いたら、スキャナーまたはその他のデバイスを使用してデータをキャプチャします。

4. 候補クローンの回収・確認

  1. レプリカのオリジナルプレート(またはカラーアッセイに使用されていない複製プレート)から白色およびKanR 候補クローンを選択します。例を 図 1C に示します。候補クローンが白色でKanR であることを確認するには、カナマイシンを含むSC-LW培地に小さなパッチとして再ストリーキングし、30°Cで1〜2日間インキュベートします。少なくとも2セットを作成するか、翌日に複製します。
    注:淡い青色のコロニーが相互作用を保持する可能性があるため、白いコロニーを選択する必要があります。
  2. 候補クローンが十分に再増殖したら、ステップ3で説明したように、ステップ4.1で生成した少なくとも1つのプレートでカラーアッセイを繰り返し、それらが白色のままで青色に変わらないことを確認します(図2A)。
    注:候補を再ストリーキングするときは、大量のセルを持ち越さないでください。細胞が多すぎると、KanR クローンとKanS クローンを区別できなくなります。
  3. プレートの残骸から、ステップ4.2で生成したKanR がまだ白色のクローンを取り出し、1 mLの選択培地(ライブラリ構築に使用するベクターに応じてSC-LまたはSC-W)で30°Cで一晩、独立して増殖させます。
  4. 培養物をマイクロチューブに移し、遠心分離(~15,000 × g、室温で10〜30秒間)で細胞を回収します。次のようにして、細胞ペレットから全DNAを単離します。
  5. 細胞ペレットを、2-メルカプトエタノールと20 mg/mL Zymolyase 100Tをそれぞれ1 μLと20 mg/mL Zymolyase 100T(材料 表を参照)を含む400 μLの溶解バッファー(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl(8.0)、および1 mM EDTA)に懸濁し、37°Cで30分間インキュベートして細胞壁を消化します。このとき、5〜10分ごとにチューブを反転させて穏やかに混合します。
  6. 細胞懸濁液が不透明または半透明になったら、等量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールの混合物(25:24:1)を加え、10〜20秒間適度な速度でボルテックスしてよく混合します。
  7. マイクロチューブをマイクロ遠心分離機で全速力(室温で~15,000 × g)で5分間遠心分離し、DNAを含む水相を新しいマイクロチューブに回収します。0.8容量のイソプロパノールを加え、チューブを反転させてよく混ぜます。
  8. チューブを室温で2〜3分間放置した後、マイクロ遠心分離機で全速力(~15,000 × g、室温)で4〜5分間遠心分離し、DNAを沈殿させます。
  9. 上清を取り除き、沈殿物を約500μLの70%エタノールで洗浄します。エタノールを完全に取り除き、沈殿物を短時間乾燥させます。
  10. 20 μL の TE バッファー (10 mM Tris-Cl (8.0) および 1 mM EDTA) を沈殿物に加え、短時間混合し、チューブを室温で一晩放置して沈殿物を溶解します。
    注:ユーザーが急いでいる場合は、チューブを37〜50°Cに保ちます。 DNA沈殿物は数時間で溶解します。
  11. ペレットが完全に溶解したら、このDNA溶液を少量のこのDNA溶液で 大腸菌 に形質転換します。
    注:形質転換効率の高い 大腸菌 を使用する場合は、約0.5μLのDNA溶液で十分です。
  12. 大腸菌のコロニーが出現したら、いくつかの独立したコロニーを選び、それらを培養し、アルカリ溶解などの標準的な方法でプラスミドを回収します。
  13. ステップ4.12で得られたプラスミドDNAを、ベイトプラスミドを保有するY2H宿主細胞に導入します。形質転換体が現れたら、カラーアッセイ(白色に見える)とウェスタンブロッティング4 (目的のサイズのタンパク質を発現する)で確認します。
    注:ポストアルカリ法12 は、酵母から全細胞抽出物を調製する簡単で迅速な方法です。
  14. 上記の2つの基準が満たされる場合は、ヌクレオチドシーケンシング4によりクローンの変異部位を決定する。

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結果

最近、Pol2タンパク質(Pol2-C)のC末端半分がMcm10と相互作用することがわかりました。どちらのタンパク質もDNA複製の開始に不可欠であり、したがって、出芽酵母Saccharomyces cerevisiae13,14,15の細胞増殖に不可欠です。この相互作用の生物学的意義を理解するために、Mcm10との相互作用がない/減少しているPol2-C変異体を、ここで説明する方法を使用して単離しました。

ミューテーションライブラリは、ステップ1で説明した方法に従って構築した。Pol2-C DNA断片をGoTaqポリメラーゼで増幅し、In-Fusion酵素を使用してGal4AD(pST2525)ベクターにクローニングしました。ライブラリ内の独立したクローンの数は5000と推定されました。

ステップ2で説明したように、ライブラ...

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ディスカッション

この記事では、Y2Hアッセイを使用して相互作用欠損/障害のある変異体を単離する方法について説明します。このような変異体は、目的のタンパク質の機能を解析するための強力なツールです。このような変異体を単離するために、Y2H宿主株2,3を改変することにより、rY2Hアッセイが以前に開発されました。しかし、労働量は大きく減っていません。対照的に、変異体は、この方法でかなりの労力を費やさずに単離できます。この方法では、Y2Hベクトルを変更することで、理論的にはすべての候補が野生型またはミスセンス変異体であることが保証されます。さらに、この方法では、候補から空のベクトルを効率的に排除できます。これらの望ましい特性のために、この方法は、相互作用ヌル/障害のある変異体を単離するための標準的な方法になる可能性があります。

これらの方法はシンプルで簡単ですが、良好な結果を得るには、レプリカプレーティング(ステップ2.3)とカラーアッセイのコロニーリフト(ステップ3.2および3.3)など...

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

Y2Hの技術改良を行ったのは田中祐輔です。本研究は、日本学術振興会科研費JP22K06336および大阪発酵研究所の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS溶液富士フイルム和光純薬(株)313-90275
2-メルカプトエタノール富士フイルム和光純薬(株)135-07522
2-プロパノール岸田化学工業(株)110-64785
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)富士フイルム和光純薬(株)021-07852
寒天地AGR60
アンピシリンナトリウム富士フイルム 和光純薬(株)68-52-3
アンチHAタグ mAb-HRP-DirecT  医療&株式会社生物研究所M180-7
DNA サケ精巣Merck KGaA.D1626
エタノールメルクKGaA。9-0770-4-4L-J
コロニーリフト用濾紙(グレード50)Whatman, Cytiva1450-090
コロニーリフト用濾紙(No.4A)アドバンテック 東洋写真株式会社
レプリカめっき用濾紙(No.1)アドバンテック 東洋写真株式会社
G-418 硫酸塩富士フイルム 和光純薬(株)075-05962
塩酸岸田化学工業(株)230-37585
KCl富士フイルム和光純薬(株)163-03545
酢酸リチウム二水和物Nacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4&ブル;7H2O富士フイルム和光純薬(株)131-00405
Na2HPO4&ブル;12H2Oナカライ・テスク株式会社10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4&ブル;2H2ONacalai Tesque Inc. (英語)31717-25
ペーパータオルアズワン7-6200-02
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール 25:24:1ナカライ・テスク25970-56
プラスミドDNA研究National BioResource Project - 酵母 (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
プラスミド単離キット日本ジェネティクスFG-90502
ポリエチレングリコール #4,000ナカライ・テスク11574-15
SC ダブルドロップアウトミックス -Leu -TrpFormediumDSCK172
シームレスクローニングキット (In-Fusion assembly)カラバイオ#639648
脱脂粉乳富士フイルム和光純薬(株)190-12865
ストレプトマイシン硫酸塩富士フイルム 和光純薬(株)3810-74-0
Taqポリメラーゼ(GoTaqグリーンマスターミックス)プロメガ株式会社M7122
TRIS(ヒドロキシメチル)アミノメタンフォーミディアTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
トリプトンサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
酵母エキスサーモフィッシャーサイエンティフィック社212750
酵母窒素塩基 (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55
培0141109000011150 タム 211705

参考文献

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