Yeast Two-Hybrid Assayを用いたInteraction-Null/Impaired Mutantsの単離

生体分子間の相互作用は、生命現象の最も基本的な部分です。タンパク質間相互作用は、そのような相互作用の重要な部分を構成します。したがって、目的のタンパク質/遺伝子の機能をさらに解明するためには、目的のタンパク質の相互作用パートナーを特定することが重要です。酵母ツーハイブリッド(Y2H)法は、 in vivo¹でタンパク質間相互作用を同定するための一般的な手法です。このシステムでは、相互作用が試験される2つのタンパク質(XとY)が、それぞれDNA結合(DB)ドメインと転写活性化ドメイン(AD)に融合します。DB-X融合タンパク質は、DBドメインの認識配列に結合します。したがって、タンパク質XとYが相互作用すると、AD-Y融合タンパク質は認識配列の近接性になります。その結果、認識配列の下流にあるレポーター遺伝子の転写が活性化されます。したがって、レポーター遺伝子活性の有無を用いて、タンパク質間相互作用の有無を決定することができる¹。

目的のタンパク質の特定の相互作用パートナーが特定されたら、相互作用の生物学的機能を解明するために、さらなる分析を行う必要があります。この目的のために、特定のタンパク質間相互作用を損なう、または除去するタンパク質の変異体を単離できれば、それらは強力なツールとして機能します。Y2Hシステムは、野生型の「相互作用陽性」クローンから始めて、「相互作用陰性」クローンをスクリーニングすることにより、そのような変異体を単離するために直接使用できます。このプロセスを加速するために、「逆」Y2H(rY2H)システムが開発されました^2,3。rY2Hシステムでは、宿主酵母株はレポーター遺伝子としてカウンター選択可能なマーカー遺伝子を保有しており、AD-Yタンパク質とDB-Xタンパク質が相互作用しない場合にのみ酵母細胞が増殖します。

Y2HシステムとrY2Hシステムの両方で相互作用陰性の変異体の単離が可能ですが、スクリーニングによって得られたすべての候補が目的のタイプの変異(通常はミスセンス変異)を持っているわけではないため、変異体を単離するプロセスは面倒です。最も深刻な問題は、候補のかなりの割合がフレームシフトまたはナンセンス変異を保有しており、望ましくないクローンを除外するためにウェスタンブロッティングを行う必要があることです。この問題を解決するために、新しいプラスミドベクターが開発されました⁴。これらのベクターでは、薬剤耐性マーカーであるKanMXは、DBドメインまたはADの下流にアウトオブフレームに配置されています。マーカー遺伝子は、目的の遺伝子が挿入された場合にのみ、DBドメインまたはADとインフレームになります。目的の遺伝子にランダムな突然変異が導入されると、フレームシフトまたはナンセンス変異を有するものなどの望ましくない突然変異体は、薬剤耐性選択を行うことによって容易に排除することができ、望ましいミスセンス変異を有する候補は、Y2Hスクリーン⁴で容易に同定することができる。この記事では、この戦略を使用して目的のタンパク質の相互作用ゼロ/障害のある変異体を単離するためのプロトコルを紹介します。

1. ミュータントライブラリの構築

1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を設定します(例を以下に示します)。一般的には、5μLの10アリコートに分割された反応液を50μL調製し、PCRマシン⁴で標的遺伝子断片を増幅する。
   注:ユーザーは、変異を効率的に導入するために適切なポリメラーゼを選択する必要があります。増幅するDNA断片が短い場合、校正活性を欠くTaqポリメラーゼなど、エラー率の高いポリメラーゼが必要になります。増幅するDNA断片が長い場合、突然変異の数を減らすために、より忠実度の高いポリメラーゼが必要です。突然変異は、通常のTaqポリメラーゼ⁴による30サイクルの増幅後、数百塩基対ごとに発生します。代表的な結果では、通常のTaqポリメラーゼよりも高い忠実度を持つ異なるTaqポリメラーゼ( 材料表を参照)が使用され、突然変異率は600塩基対に1つでした。PCR混合物の例、プライマーの詳細、および反応条件は、 補足ファイル1に記載されています。
2. PCRが完了したら、反応液を全て組み合わせ、目的のDNA断片がアガロースゲル電気泳動などを用いて増幅されたことを確認し、^DNA5を精製します。
3. ステップ1.2で生成したDNAフラグメントを、「シームレス」クローニング戦略を使用して、適切なY2Hベクターとアセンブルします(図1)。
   注:Gibson assembly⁶などのシームレスクローニングシステムは、セルフライゲーション によって生成された 空のベクターによる構築された変異体ライブラリの汚染を最小限に抑えます。Y2Hベクトルのリストを 表1に示します。組み立て前にBamHI消化法で調製することができます。すべてのプラスミドは、National BioResource Project - 酵母から入手できます( 材料の表を参照)。
4. ステップ1.3で生成した反応混合物を、高効率の大腸菌形質転換プロトコル(例:井上ら⁷)に従って調製した大腸菌コンピテントセルに導入します。適切な抗生物質を含むいくつかのLBプレート(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1%NaCl、および2%寒天)にすべてのコンピテントセルを広げます(材料の表を参照)。この時点で、少量(全反応量の~1/100)を同じ選択プレートに広げて、ライブラリー力価を計算します。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
5. 大 腸菌 のコロニーが大量に出現したら、使い捨てのプラスチックループを使用してプレートの表面からすべての細胞をこすり落とします。これらの細胞からプラスミドDNAを回収するには、アルカリ溶解⁸などの一般的な方法を使用します。同時に、プレート上に形質転換混合物の小さなアリコートを広げた後に現れるコロニーの数を数えます。この数を使用して、ライブラリ内の独立したクローンの総数を見積もります。
   注:この時点で、形質転換反応の小さなアリコートが広がったプレート上に現れるいくつかの独立したコロニー(4-6)をピックアップし、それらを別々に培養し、それらからプラスミドを単離して、事実上すべてのクローンが目的のDNA断片^{5を持っていることを確認します}。 大腸菌からプラスミドを単離するための多くの市販キットが利用可能です。小さなアリコートを広げた後にプレートに現れるコロニーの数は、手動でカウントできます。
6. ライブラリDNAプールの濃度を測定します。通常、次のステップで数千の形質転換体を得るには、数百ナノグラムのライブラリーDNAで十分です。
   注:A₂₆₀ の測定はしばしば不正確であるため、DNAに結合する蛍光色素を使用してDNA濃度を測定することをお勧めします。

2. 変異体ライブラリーとレプリカプレーティングによる酵母の形質転換

1. 宿主酵母株(TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ)に変異ライブラリーを導入し、約100 ngのDNAを用いたY2Hアッセイを行います。宿主細胞を「ベイト」プラスミドで事前に形質転換します。
   1. 形質転換手順の後、酵母細胞を滅菌水に懸濁し、適切なプレート(通常、ロイシンとトリプトファンを欠くSC培地:SC-LW [0.67%酵母窒素ベース、2%グルコース、1.546 g / L SCダブルドロップアウトミックス-Leu-Trp、および2%寒天、 材料の表を参照])に広げます。これらのプレートを30°Cで一晩インキュベートします。
      注:酵母の形質転換には、~5 × 10⁶の対数的に増殖する細胞を用いた酢酸リチウム-PEG法¹¹などの標準プロトコルで十分です。エレクトロポレーションなど、変換効率の高い別の方法も使用できます。
2. 翌日、小さなコロニーが現れたら、適切な細胞数(500〜2000)のプレートを選択し、次のようにそれらから複製を行います。
3. レプリカブロックに濾紙を2枚セットして、複数のレプリカを作成します(媒体はSC-LWとカナマイシンを含むSC-LWです)( 材料表を参照)。30°Cで1〜2日間インキュベートします。
   注:カナマイシン(G418)の濃度は600μg/ mLです。.レプリカメッキにベルベットを使用しないでください。コロニーの解像度が失われます。
4. コロニーが成長したら、プレートを比較して候補を選びます。 lacZ をレポーターとして使用する場合は、Y2Hカラーアッセイ(ステップ3を参照)を実施します。
   注:Y2Hレポーターの場合、 通常、lacZ は HIS3よりも弱い相互作用の検出に優れています。

3. Y2Hカラーアッセイ

1. 手順2で準備したレプリカプレートに、あらかじめ適切なサイズにカットした濾紙を置きます。ろ紙とプレートの間に気泡が入らないように注意してください。
   注意: No.4A濾紙またはグレード50濾紙を使用してください( 材料の表を参照)。レプリカめっきで作られたカナマイシンプレートを含むSC-LWまたはSC-LWは、カラーアッセイに使用できます。
2. プレートのろ紙が完全に湿ったとき(ろ紙の色が完全に変わったとき)は、ペーパータオルを数枚上に置き、濾紙に接触させて余分な水分を取り除きます。ペーパータオルが水を吸収して色が変わったら取り外します。このプロセスを2、3回繰り返します。
3. 濾紙の端をピンセットでつまみ、さっとプレートから剥がし、液体窒素に浸して冷凍します。液体窒素が利用できない場合は、濾紙をコロニー面を上にしてプラスチックトレイに置き、すぐに冷凍庫(-20°C〜-80°C)に置いて完全に凍結します。
4. 凍った濾紙を取り出し、コロニー側を上にして、乾いたペーパータオルの上に置いて解凍します。解凍後すぐに、プラスチックトレイまたは密封可能な容器に置き、X-gal(5-ブロモ-5-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド)と2-メルカプトエタノール⁹を含むZバッファー(60 mM Na₂HPO₄、40 mM NaH₂PO₄、10 mM KCl、および1 mM MgSO₄、pH 7.0)に浸した別の濾紙に、コロニー側を上にして濾紙を置きます(資料表を参照)。).上部と下部の濾紙の間に気泡が入らないように注意してください。
5. 濾紙が入ったプラスチックトレイに蓋をして、密閉容器またはビニール袋に入れます。密閉容器またはビニール袋を閉じ、青色が出るまで37°Cでインキュベートします。
6. 青色が出てきたら、きれいなプラスチックトレイに約500μLの停止液(1 M Na₂CO₃)の上にコロニー面を上にして濾紙を置きます。ストップソリューションはすぐに染み込みます。したがって、すぐにフィルターを取り外し、コロニー側を上にして新しいペーパータオルの上に置き、乾かします。
7. ペーパータオルを交換し、フィルターが十分に乾いたら、スキャナーまたはその他のデバイスを使用してデータをキャプチャします。

4. 候補クローンの回収・確認

1. レプリカのオリジナルプレート(またはカラーアッセイに使用されていない複製プレート)から白色およびKan^R 候補クローンを選択します。例を 図 1C に示します。候補クローンが白色でKan^R であることを確認するには、カナマイシンを含むSC-LW培地に小さなパッチとして再ストリーキングし、30°Cで1〜2日間インキュベートします。少なくとも2セットを作成するか、翌日に複製します。
   注:淡い青色のコロニーが相互作用を保持する可能性があるため、白いコロニーを選択する必要があります。
2. 候補クローンが十分に再増殖したら、ステップ3で説明したように、ステップ4.1で生成した少なくとも1つのプレートでカラーアッセイを繰り返し、それらが白色のままで青色に変わらないことを確認します(図2A)。
   注:候補を再ストリーキングするときは、大量のセルを持ち越さないでください。細胞が多すぎると、Kan^R クローンとKan^S クローンを区別できなくなります。
3. プレートの残骸から、ステップ4.2で生成したKan^R がまだ白色のクローンを取り出し、1 mLの選択培地(ライブラリ構築に使用するベクターに応じてSC-LまたはSC-W)で30°Cで一晩、独立して増殖させます。
4. 培養物をマイクロチューブに移し、遠心分離(~15,000 × g、室温で10〜30秒間)で細胞を回収します。次のようにして、細胞ペレットから全DNAを単離します。
5. 細胞ペレットを、2-メルカプトエタノールと20 mg/mL Zymolyase 100Tをそれぞれ1 μLと20 mg/mL Zymolyase 100T(材料 表を参照)を含む400 μLの溶解バッファー(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl(8.0)、および1 mM EDTA)に懸濁し、37°Cで30分間インキュベートして細胞壁を消化します。このとき、5〜10分ごとにチューブを反転させて穏やかに混合します。
6. 細胞懸濁液が不透明または半透明になったら、等量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールの混合物(25:24:1)を加え、10〜20秒間適度な速度でボルテックスしてよく混合します。
7. マイクロチューブをマイクロ遠心分離機で全速力(室温で~15,000 × g)で5分間遠心分離し、DNAを含む水相を新しいマイクロチューブに回収します。0.8容量のイソプロパノールを加え、チューブを反転させてよく混ぜます。
8. チューブを室温で2〜3分間放置した後、マイクロ遠心分離機で全速力(~15,000 × g、室温)で4〜5分間遠心分離し、DNAを沈殿させます。
9. 上清を取り除き、沈殿物を約500μLの70%エタノールで洗浄します。エタノールを完全に取り除き、沈殿物を短時間乾燥させます。
10. 20 μL の TE バッファー (10 mM Tris-Cl (8.0) および 1 mM EDTA) を沈殿物に加え、短時間混合し、チューブを室温で一晩放置して沈殿物を溶解します。
    注:ユーザーが急いでいる場合は、チューブを37〜50°Cに保ちます。 DNA沈殿物は数時間で溶解します。
11. ペレットが完全に溶解したら、このDNA溶液を少量のこのDNA溶液で 大腸菌 に形質転換します。
    注:形質転換効率の高い 大腸菌 を使用する場合は、約0.5μLのDNA溶液で十分です。
12. 大腸菌のコロニーが出現したら、いくつかの独立したコロニーを選び、それらを培養し、アルカリ溶解などの標準的な方法でプラスミドを回収します。
13. ステップ4.12で得られたプラスミドDNAを、ベイトプラスミドを保有するY2H宿主細胞に導入します。形質転換体が現れたら、カラーアッセイ(白色に見える)とウェスタンブロッティング⁴ (目的のサイズのタンパク質を発現する)で確認します。
    注:ポストアルカリ法¹² は、酵母から全細胞抽出物を調製する簡単で迅速な方法です。
14. 上記の2つの基準が満たされる場合は、ヌクレオチドシーケンシング⁴によりクローンの変異部位を決定する。

最近、Pol2タンパク質(Pol2-C)のC末端半分がMcm10と相互作用することがわかりました。どちらのタンパク質もDNA複製の開始に不可欠であり、したがって、出芽酵母Saccharomyces cerevisiae13,14,15の細胞増殖に不可欠です。この相互作用の生物学的意義を理解するために、Mcm10との相互作用がない/減少しているPol2-C変異体を、ここで説明する方法を使用して単離しました。

ミューテーションライブラリは、ステップ1で説明した方法に従って構築した。Pol2-C DNA断片をGoTaqポリメラーゼで増幅し、In-Fusion酵素を使用してGal4AD(pST2525)ベクターにクローニングしました。ライブラリ内の独立したクローンの数は5000と推定されました。

ステップ2で説明したように、ライブラリプラスミドのDNAをY2H宿主TAT-7株に導入し、LexA-Mcm10プラスミドで事前に形質転換しました。細胞をSC-LWプレート上に広げ、翌日SC-LWおよびSC-LW+G418プレートに複製しました。反復物は、ステップ3に記載したようにカラーアッセイに供した。カラーアッセイの結果の一部を 図1Cに示します。

カラーアッセイで白色でG418耐性であった47のコロニーが、約8500の形質転換体から最初の候補として分離されました。カラーアッセイで再度試験したところ、47個のクローンのうち25個が白色であることが確認されました(図2A)。これらの25のクローンは候補として保持されました。候補プラスミドDNAは、ステップ4で説明したように、25の候補のそれぞれから回収しました。それらをLexA-Mcm10を有するY2H酵母宿主細胞に再導入し、カラーアッセイで試験したところ、色を欠く16クローンが選択されました。これらがPol2-Cミスセンス変異体であることをさらに確認するために、Pol2-Cタンパク質の発現をウェスタンブロッティングで確認しました。12の候補は、ポジティブコントロール(Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX融合タンパク質、計算m.w.:158.8 kDa)とほぼ同じ位置にバンドを示しました(図2B)。カラーアッセイにより、これらの12個のクローンはMcm10と相互作用しないことが示されました(図2C)。これらのクローンの塩基配列を決定した後、それらすべてがミスセンス変異を有することが確認されました。ミスセンス変異の数は1から5までさまざまであった(データは示さず)。平均して、1000塩基ごとに約1つのミスセンス変異が発生しました。

図1:相互作用ヌル/障害のある変異体をスクリーニングするためのY2Hベースのアプローチの概略図。(B)相互作用ヌル/障害のある突然変異体を単離するための戦略。1:新たに構築したY2Hベクターは、Y2Hタグ、DBドメイン、およびADの下流にKanMX遺伝子のコピーを含んでいます。重要なことに、このKanMX遺伝子には開始コドンがなく、Y2Hタグとアウトオブフレームです。したがって、KanMX遺伝子はこのベクターから発現するとは予想されません。PCR増幅したDNA断片をベクターに挿入すると、KanMX遺伝子がY2Hタグでインフレームされ、発現します。その結果、野生型インサートまたはミスセンス変異を有するインサートを有するプラスミドのみがKanMX遺伝子を発現でき、G418に対する耐性が付与されます。ナンセンスまたはフレームシフト変異を持つプラスミドは、KanMX遺伝子を発現できません。2:ステップ1で構築した変異ライブラリーをY2H宿主酵母細胞に導入します。変身者が現れると、レプリカが作成されます。レポーター遺伝子の発現とG418に対する耐性を比較することにより、interaction-null/impaired mutantsの候補を選択することができます。(C)スクリーニングの一例。Gal4-ADとPCR変異誘発Pol2-C DNA断片を保有するプラスミドライブラリーを、LexA-Mcm10プラスミドで事前に形質転換したY2H宿主TAT-7株に導入しました。カラーアッセイ前(左)とカラーアッセイ後(中央)の画像と、SC-LW+G418プレート上で増殖した細胞(右)の画像を示します。interaction-null/impaired mutantsおよびfalse候補の候補の例は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。(D)Y2Hベクター、AD(上)、DB(下)ベクターのクローニング部位周辺のDNA配列。Y2Hタグ(赤)の最後の10個のアミノ酸(aa)からKanMXの最初の10個のaaに対応する部分(緑)までの配列が示されています。また、SmaIとBamHIの認識部位も示しています。PCRプライマーの位置は、BamHI部位をクローニング部位として使用した場合の下部に示されています。同じプライマーを使用して、目的の遺伝子を他のプラスミドにクローニングします(pST2303/2523)。この図は、Tanaka et al.4から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:相互作用ヌル/障害のある変異体のスクリーニングプロセスの一例 (A)候補クローンとして単離された47コロニーを、 図1Cに示すように、G418を含むSC-LW培地上で再度増殖させ、カラーアッセイに供した。+:正制御(Wt Pol2-C)、-:負制御(ベクトル)。1〜25の番号が付けられた候補クローンを培養して、プラスミドを回収しました。(B)プラスミドを(A)の各候補クローンから回収し、Y2H宿主細胞に導入し、再度カラーアッセイを行った。そのうちの16個は白でした(色がありませんでした)。それらから全細胞抽出物を調製し、抗HAモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。パネル上の数字は、(A)の数字に対応しています。分析は、#6を除く各候補から回収されたいくつかの独立したプラスミドクローンについて実施しました。(C)最終12クローンのカラーアッセイの結果。(A)の番号に対応しています。Mcm10との相互作用を保持した#16を、カラーアッセイのポジティブコントロールとして使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: Y2H タグを持つ KanMX アウトオブフレームを含む Y2H ベクトルのリスト。

補足ファイル1:PCR混合物の例、プライマーの詳細、および反応条件。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は、利益相反がないことを宣言します。