バイオエンジニアリング材料の研究のための咬筋体積筋損失のげっ歯類モデル

サマリー

ここでは、ラット咬筋の体積筋損失(VML)損傷を外科的に作成するためのプロトコルについて説明し、頭蓋顔面筋損傷の研究と新規ヒドロゲルなどの生体材料を使用したその治療のための再現性とアクセス可能なモデルを提供します。

要約

頭蓋顔面容積筋喪失(VML)損傷は、重度の外傷、外科的切除、炎症、および先天性またはその他の後天性の状態の結果として発生する可能性があります。頭蓋顔面VMLの治療には、外科的で機能的な筋肉移植が含まれます。しかし、これらの処置では正常な機能、感覚、表現を回復することはできず、より一般的には、これらの状態は治療されないままです。頭蓋顔面VMLの動物モデルにおける骨格筋の再生に関する研究はほとんど行われていません。この原稿では、頭蓋顔面VML損傷の研究のためのラットモデルと、これらの損傷の治療における生体材料の組織学的評価のためのプロトコルについて説明します。外科的VMLの作成時には液体ハイドロゲルと凍結乾燥足場が適用され、咬筋は12週間までの終末時点で切除され、保持率が高く、合併症はごくわずかです。ヘマトキシリンとエオシン(HE)、マッソントリクローム、および免疫組織化学分析を使用して、骨格筋の再生、生体適合性、免疫調節のパラメーターを評価します。ヒアルロン酸ベースのハイドロゲルの研究を示していますが、このモデルは、VML損傷における材料のその後の反復を評価する手段を提供します。

概要

重度の外傷、外科的切除、炎症、およびその他の後天的な状態は、内因性骨格筋修復メカニズムを圧倒する程度の組織喪失を引き起こす可能性があります。一次再生プロセスを促進する常在細胞と構造の喪失は、病理学的リモデリングと組織線維化を引き起こし、機能と感覚の長期的な欠損をもたらす可能性があり、体積筋喪失(VML)^{と呼ばれます1,2,3}。VML損傷に対する炎症反応には、マクロファージ、サイトカイン、および筋原性細胞が関与する十分に文書化された複雑なメカニズムが関与しており、^{再生医療4}において多くの理論的標的を提示します。多くの in vitro 研究では、四肢 VML 治療の動物モデルでこれらのターゲットが利用されていますが、頭蓋顔面 VML ^5,6,7 の動物モデルにおける骨格筋の再生に関する研究は不足しています。

頭蓋顔面組織の喪失は、前述したような状態から生じる可能性があり、頭蓋顔面組織の欠損は、裂け目などの先天性疾患でも発生する可能性があり、場合によっては筋肉組織の真の体積欠損が関与します^8,9。頭蓋顔面領域の筋肉は機能だけでなく審美的な外観にとっても重要であるため、VML の長期的な影響は重大な心理的苦痛をもたらす可能性があります。頭蓋顔面骨格筋のいくつかの側面は、遺伝子発現、胚起源、衛星細胞表現型、衛星細胞量、線維組成、および構造10,11,12,13のバリエーションを含む、四肢に見られる体節由来の骨格筋とは異なる。これらの変動により、VML損傷が頭蓋顔面筋に異なる影響を与える可能性があります 体節由来の筋肉^14,15。今日まで、四肢VMLの動物モデルで再生を増加させることが示された組織工学的アプローチは、頭蓋顔面VML動物モデル¹⁶と同等に変換されていません。このことは、動物の頭蓋顔面VMLモデルに対するin vivoアプローチを最適化する必要性を強調しています。

頭蓋顔面VMLのいくつかのin vivo研究が実施されていますが、研究は小規模であり、動物モデルで堅牢な頭蓋顔面筋の欠陥を作成することは困難です^8,13。Kimらは、マウス咬筋VMLモデルの開発を報告しました。しかし、この研究では、損傷後28日までの組織型のみを評価し、時点間の組織学的転帰の違いを検出する力が不明でした¹⁷。Rodriguezらは、ヒツジの頭蓋顔面VMLモデルの開発を報告しました。しかし、彼らは実験群内で高いばらつきを報告し、最初の外科的損傷の重症度に不均一性があることを示唆している¹⁶。ここでは、ラット咬筋VMLモデルのプロトコルを報告し、組織工学的アプローチの評価におけるその有用性を実証します。

プロトコル

この研究は、『The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals』に概説されている推奨事項の遵守を含む、適用されるすべての規制に従って実施されました。UCSFのInstitutional Animal Care and Use Programは、すべての動物処置と術後ケア(IACUCプロトコル #AN195944-01)を承認しました。

1. VML手術

1. 12週齢の雄Sprague-Dawleyラットを、密閉容器内で276〜300 gの体重で、イソフルオラン全身麻酔を使用して1%〜5%の割合で麻酔してから、滅菌手術野に移します。
   1. げっ歯類を左側に配置して、首をニュートラル位置に伸ばし、鼻を麻酔薬の鼻円錐に収まるようにして、顔の右側に露出できるようにします。
   2. 誘導から保守までのイソフルオラン流量(約2%)をテーパーします。
2. げっ歯類の目に眼科用軟膏を塗ります。
3. 脱毛クリームを使用して、口の右隅、右耳の付け根、および下顎骨の角度と下との間に線で囲まれた手術部位をクリアにします。
   1. エタノールとベタジンスクラブの両方を使用して、手術部位を円を描くように数回消毒します。.
      注:このプロトコルでは、アクセスのサイズと位置を考慮して、滅菌ドレープは使用されません。この手順は、動物管理ガイドラインに従った無菌技術を使用して行われます。
4. 下右ひげパッドから右耳までの長さ3〜4cmの縦切開を作成します。
   1. 皮膚フラップを持ち上げ、右咬筋と顔面神経の頬側および下顎側の枝を視覚化できるようにします(図1A)。
   2. 鈍い分離を使用して下にある筋膜から皮膚を取り除き、外科的クランプを使用して皮膚の端を収縮位置に保持して、下にある筋肉を最適に視覚化します。
5. 咬筋の前部を覆う筋膜に長さ1〜2cmの横切開を行います。鈍器分離を使用して、筋膜と咬筋の間のスペースを慎重に拡張し、残りの筋膜の全体的な完全性を維持します。
6. 筋膜切開を表在性咬筋への窓として使用し、滅菌された使い捨てパンチ生検を使用して、幅 5 mm、深さ 5 mm の筋肉に円形の損傷を作成します。神経への外傷を避けるように注意しながら、欠損が顔面神経の頬側と下顎側の枝の間の中心にあることを確認します(図1B)。
7. 円形咬筋損傷に生体材料を追加します(図1C)。
8. 薬剤が適切に配置されたら、移動を避けるために、単一の5-0モノフィラメント縫合糸を使用して筋肉を投入する筋膜窓を縫合します。
   注:固形剤は傷口に直接配置され、組織を攪乱して血液の飽和を促進することができますが、液体剤は添加され、必要に応じてゲル化させるか、不要な動きを避けるために筋膜を使用してすぐに所定の位置に閉じます。今回紹介する実験では、アクリル化ヒアルロン酸をベースとしたクライオゲルを投与します。
9. 単純な中断または5-0モノフィラメントを使用したランニング皮下技術を使用して皮膚を閉じます。
   1. 縫合糸に皮膚接着剤を塗布して、術後の切開裂開を防ぎます。
10. ラットを外部熱源(ケージの下の加熱パッドまたはケージ内の滅菌ハンドウォーマー)を備えたケージで回復させ、術後30分間観察します。
11. トリメトプリム-スルファメトキサゾール抗生物質(トリメトプリム200mgとスルファメトキサゾール40mgを5mL)で飲料水(5mL / 200mL水)で希釈し、術後7日間げっ歯類の飲料水に投与します。.周術期鎮痛が施設のプロトコルに従って実施されていることを確認してください。
    注:この研究では、外科的切開の前に0.25%SCブピバカインが投与され、麻酔からの回復前に0.05mg / kgSCブプレノルフィンが投与され、麻酔からの回復前に2mg / kgIPメロキシカムが投与されました。

2. 咬筋の採取・凍結・分析

1. 所定の時点で、麻酔薬誘導チャンバー内で化学物質(_CO2 または麻酔薬など)の過剰投与を誘発することにより、ラットを犠牲にします。
2. げっ歯類の犠牲を確認するために、腹側 4^番目の 肋骨から 1 つのメス切開を使用して両側開胸術を行い、肺を穿刺します (両側開胸術)。
3. 咬筋が視覚化できるように外科的切開を再度開き、アクセスを容易にするために咬筋の上にある皮膚を取り除きます。
4. 下顎骨の角度での分離から始めて、下顎骨から咬筋を解剖して取り外します。咬筋の厚さ全体を捉えるために、解剖が骨表面に沿って行われることを確認します。
   1. 下顎骨に沿って前方に解剖し、腱の付着点を切断します。次に、頬骨弓に沿って後方に解剖します(図1D)。最後に、出血のリスクが高まるため、後部の付着部を解剖します。
5. 切除した咬筋を室温(RT)で1x PBSですすぎ、ペーパータオルで試料を完全に吸い取って余分な水分を取り除きます。
6. 筋肉をクライオモールドに入れ、前端を下向き、後端を上に向けて、最適な切断温度(OCT)埋め込み媒体に沈めます。
7. 金属製のカップにイソペンタンを加え、液体窒素が入らないように注意して液体窒素に浸して冷まします。
   1. イソペンタンが最適温度(-140〜-149°C)に達し、わずかに増粘したら、OCTを含むクライオモールドと咬筋を部分的にイソペンタンに沈め、OCTが凍結するまで保持します。凍結したクライオモールドをドライアイスの上に置いて、-80°Cの冷凍庫に移します。
8. 凍結した咬筋サンプルを、前極が最初に切片化され、サンプルを後方に移動するような向きで凍結します。ティッシュブロックの温度を-20°Cに、クライオ切片ブレードの温度を-15°Cに設定します。 200 μmごとに、4枚のスライド(10 μm切片で2枚、6 μm切片で2枚)をカットしてから、さらに200 μm移動し、さらに4枚のスライドをカットしてサンプル全体で繰り返します。
9. 組織学分析には10 μm切片(Masson's Trichrome、Hematoxylin and Eosin、Picrosirius Redなど)を、免疫組織化学には6 μm切片を使用します。
   注:組織学には、6μm切片も使用できます。
10. 光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。
11. Image Jソフトウェアを使用して、咬筋の~200筋線維の断面積を測定します。

3. 免疫組織化学解析

1. 胚性ミオシン重鎖の免疫組織化学的分析では、スライドを4% PFAに室温で1時間固定します。
2. スライドをPBSでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
3. スライドを0.5% Triton X-100と室温で15分間インキュベートすることにより、組織を透過化します。
4. スライドをPBSでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
5. 宿主マウス由来の一次モノクローナル抗体(1:200)と2%正常ヤギ血清(NGS)に4°Cで一晩インキュベートします。
6. スライドをPBS-TweenでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
7. ウサギ宿主(1:500)由来の蛍光色素標識抗マウス二次抗体と、2% NGS中でRTで2時間インキュベートします。
8. スライドをPBS-TweenでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
9. カバースリップを配置する前に、DAPI蛍光マウントを3滴使用してスライドをマウントします。

結果

生体材料を用いた頭蓋顔面VMLの評価と組織再生の結果には、定量的および定性的な結果の両方が含まれます。

図2 は、前述のモデルを用いた定性的評価の一例を示しています。当社のハイドロゲル内で のde novo 筋線維の成長の観察は、定性的な肯定的な結果であり(図2A)、生体材料が十分な建築的サポートと成長因子または栄養素の送達を提供できることを示唆しています。創傷床内のハイドロゲルの保持(図2B)は、HE染色で見ることができます。HE(図2C)およびマッソントリクローム(図2D)を使用した血管の同定など、生体材料内の他の組織の定性的評価が行われる場合があります。顔面神経の下顎枝と頬側枝は、 図 2B の画像の左上隅と右上隅に見え、VML 損傷床のハイドロゲルの正しい配置を確認し、向きを提供します。ハイドロゲルの上に筋膜の層が見られ、筋膜の閉鎖が成功し、術後期間中に無傷のままであったことが確認されています。この段階で見られる否定的な結果には、ヒドロゲルの完全な喪失 (図 2E) または筋膜閉鎖の喪失と創傷床からの押し出し (図 2F) が含まれ、HE は術後の経過時間に応じて創傷床または線維性瘢痕の証拠を示しています。

免疫組織化学分析は、頭蓋顔面VMLの治療のための生体材料の評価において、細胞レベルでの細胞タイプと分子相互作用を特定するために重要です。VMLは、骨格筋を再生できる常在細胞と構造を失うため、損傷部位でのde novo筋肉再生は、治療⁴およびVMLの生体材料ベースの治療における有効性の評価において重要な結果です。胚性(MYH3)および新生児ミオシン(MYH8)を含むミオシンの発生アイソフォームは、再生する骨格筋線維で再発現し、再生線維の特異的マーカーを提供する^18,19。図3は、免疫組織化学を使用して目的の細胞タイプ(この場合は胚性ミオシン重鎖)を同定する方法の例を示しています。

最後に、ImageJを使用して、免疫組織化学やMassonのトリクロームなどの特殊な染色を含む組織学スライドの特徴を定量化し、線維化反応を測定できます(図4)。VML損傷で筋肉の一部を切除すると、筋肉の構造と組成が変化し、コラーゲンI沈着と肉眼的コンパートメント組織線維症が増加します^2,3。VMLの生体材料ベースの治療を評価する多くの研究では、介入群と対照群の間で線維化が比較されています⁴。ここで説明する方法を使用すると、VML損傷を受けた動物の創傷床をMassonのトリクロームで線維性瘢痕として識別できます(図4A)。ImageJによるカラーデコンボリューションは、結合組織に対応する青色チャネルを分離して定量化し(図4B)、その後、測定のためにグレースケールに設定できます(図4C)。瘢痕の領域は、画像J(図4D)を使用して分離および測定し、正確なサイズと再現性のある領域のために画像上のスケールバーに較正できます。このアプローチを使用すると、結合組織の沈着を測定できます(図4E)。

図1:手順を示す外科用概略図(A、B)外科用咬筋VML損傷。(C)生体材料の適用。(D)咬筋の収穫。(E)収穫後の筋肉の形態。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:HEとMassonのトリクローム染色(A)ヒドロゲル-筋界面からのHE染色ラット咬筋切片と、骨格筋線維として形態学的に同定された構造を示す矢印。(B)HE染色ラット咬筋切片は、ハイドロゲル全体に骨格筋線維が豊富に存在することを実証しています。(C)HE染色された組織、および(D)血管として形態学的に識別された構造を示す矢印が付いたMassonのトリクローム染色組織。(E,F)陰性の結果は、創傷床ではなく咬筋の表面面に付着したゲルによるハイドロゲルの完全な喪失と、筋膜閉鎖の喪失を伴うヒドロゲルの不完全な喪失を示すものでした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ラット咬筋断面上の胚性ミオシン重鎖(eMHC)およびラミニンの免疫組織学的染色(A)術後2週間。(B)手術後12週間。eMHCの濃度は、2週間のサンプルと比較して12週間のサンプルで増加しています。20倍の倍率で撮影された画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:定量的線維症分析 (A)12週でのVML損傷後の創傷線維症の代理としての結合組織の沈着を定量化するためのMassonのトリクローム染色ラット咬筋切片。(B)画像Jを用いて、結合組織に対応する青色チャネルをデコンボリューションした。(C)画像は分析のためにグレースケールに変換されました。(D)線維性瘢痕に対応する領域を分離し、(E)白(背景)と黒(結合組織)に対応するフィールドの断面積とパーセンテージを計算しました。光学顕微鏡で撮影した画像、倍率10倍。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコルには、最適な結果を得るために特別な注意が必要ないくつかの重要なステップがあります。ステップ1.4では、表在性咬筋筋膜からの皮膚の初期切開と鈍的分離について説明します。鈍的解剖は、傷がついたり、意図せずに筋膜に窓を作ったりするのを防ぐために、はさみを下に向け、ハサミで下にある筋肉や筋膜から離れた方向を向いて、皮膚に沿って直接行う必要があります。顎下静脈または外部頸動脈への意図しない損傷を防ぐために、表在性咬筋の尾側は避けるべきです。ステップ 1.5 と 1.6 では、それぞれ筋膜ウィンドウと VML の欠陥の作成について説明します。筋膜は切開部から離れて収縮する傾向があり、切開が大きすぎるとステップ1.8でエッジを見つけるのが難しくなる可能性があるため、筋膜切開がパンチ生検に適合するために必要な最小サイズであることを確認するように注意する必要があります。繰り返しになりますが、筋膜の下の鈍的解剖は、パンチ生検が窓内に収まり、下顎骨に対して垂直になるように適切な角度になるように十分なだけ行う必要があります。VML損傷を作成するときは、顔面神経の下顎枝と頬側枝の間の最大の領域を特定することが重要です。遠位下顎神経は上側と下側に分かれており、上側が下側から顔面神経の頬側枝に向かって分岐する位置にばらつきがあります。この分裂が優位に進行するため、一部の動物は下顎神経の上部分裂を咬筋の腹に直接持っていて、欠陥が生じる可能性があります。このような場合、データを交絡させる末梢神経損傷がある可能性が高いため、動物を分析に使用しないでください。パンチ生検を作成するときは、5 mmの深さ全体に浸透するために、穏やかなねじれが必要になる場合があります。ステップ2.4では、組織サンプルを洗浄した後のブロッティングで、過剰な水分を除去する方法について説明します。これは、組織の凍結中に氷の結晶が形成され、その後の組織学上の凍結アーティファクトの減少を防ぐために行われます²⁰。

この方法の利点の1つは、表在性咬筋へのアクセスが容易で、手術中に遭遇する可能性のある高リスク構造が相対的に欠如していることです。血管系は筋肉の尾側端に入るため、ほとんどの場合、重大な出血を避けることができます。これは、罹患率のリスクを減らすだけでなく、標準化を促進し、虚血が筋肉の再生に交絡影響を与える可能性を減らすため、重要です。筋膜エンクロージャーが利用できるため、このプロトコルは、液体または固体のフォームファクターの生体材料を評価するために使用できます。このプロトコルの例として無細胞ヒドロゲルが使用されましたが、この方法は、四肢VML²¹の以前の研究で行われてきたように、免疫不全ラットを使用してヒト幹細胞を組み込んだ生体材料をテストするために複製できます。

この研究では、VML の臨界サイズの損傷を正式に定義しておらず、内因性の修復メカニズムが筋肉を再生できなくなった正確なポイントは不明のままです。この定義が筋肉の体積の一定の割合の除去を含む可能性があることは理にかなっていますが、実際には20%がしばしば引用されますが、矛盾する証拠があり、データは、怪我の場所と形状、動物の年齢などの他の要因も寄与する可能性があることを示唆しています16,21,22,23.それにもかかわらず、損傷後12週間で観察された線維性瘢痕と筋肉境界の目に見える収縮の観察(図4A)は、病理学的リモデリングが起こったことを示しており、ここで使用された損傷が標準定義に対して重大なサイズであることを強く示唆しています。

人間の頭蓋顔面筋は、内因性の手の筋肉と同様に、近位肢の筋肉に比べて小さく、より正確な動きを行うため、VMLによって機能が影響を受ける傾向があります。このプロトコルでは、咬筋が選択されたのは、試験に十分な大きさとアクセスのしやすさがあったからです。ただし、損傷の形状と位置は VML を評価する際の重要な要素であり、このモデルを使用して生成された結論は、他の頭蓋顔面筋に直接変換されない可能性があります。咬筋は咀嚼の筋肉であり、子供の顔の表情に寄与する一方で²⁴、成人期には顔の表情におけるその役割は減少します²⁴。顔の他の筋肉、例えば大頬骨筋への損傷は、咬筋^{2 5,26}と比較して生涯を通じて顔の表情においてより直接的な役割を果たすため、VML後により大きな心理的苦痛をもたらす可能性がある。さらに、この研究では、この分野で必要な領域である制限であるin vivoの力産生を評価していませんでした。今日まで、治療群を比較するのに十分な感度を備えた頭蓋顔面筋機能検査の再現可能な方法は報告されておらず、これは顔内の広範な代償筋によって複雑になっています。このプロトコルの今後の開発は、個々の顔の筋肉の力を直接測定するアプローチを導入することを目的としています。

げっ歯類モデルにおける咬筋VMLの組織学的解析の代替方法は非常に限られています。Kimらは、マウスのVML損傷した咬筋の機能を評価するためのウェアラブルEMGシステムを作成しました。しかし、彼らの最終時点は4週間であり、組織像における生体材料の可視化を示さず、筋膜閉鎖についても説明せず、主にEMGシステムの検証と筋肉再生の分析および生体材料ベースの治療の生体適合性の分析に焦点を当てていた¹⁷。頭蓋顔面容積筋の喪失には新しい治療法が必要であり、この咬筋VMLモデルは、VML損傷に対する筋肉の反応を評価し、特に損傷後最初の3か月間に再生、線維症、拘縮に対する治療の効果を評価するのに十分な再現性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
F1.652 ミオシン重鎖(胚性)モノクローナル抗体	DSHB	F1.652
ヤギ抗マウスIgG2b交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
インテグラ標準生検パンチ、使い捨て標準生検パンチ;5 mm、直径:0.19インチ、0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam		ab150127
スルファメトキサゾール/トリメトプリム経口懸濁液、チェリー風味、473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP

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