蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

Summary

この研究で提示されたプロトコルは、2つの方法によるcAMPの測定におけるcAMP差分検出器 In Situ の有効性を示しています。1つの方法は、HEK-293セルを備えた96ウェルプレート読み取り分光光度計を利用します。もう1つの方法は、蛍光顕微鏡下で個々のHASM細胞を実証する方法です。

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis)は、生細胞内のcAMPレベルを連続的に測定できる新しいバイオセンサーです。バイオセンサーは、Epac2のヒンジ領域に結合した環状に置換された蛍光タンパク質から作成されます。これにより、cAMPの結合時に蛍光の増加または減少を示す単一の蛍光色素バイオセンサーが作成されます。バイオセンサーには、赤と緑の上向きバージョン、緑の下向きバージョン、および細胞内位置を対象としたいくつかの赤と緑のバージョンがあります。バイオセンサーの有効性を説明するために、cAMP結合時に蛍光が減少する緑色の下向きバージョンを使用しました。このセンサーを使用した2つのプロトコルが実演されています:1つはハイスループットスクリーニングと互換性のある96ウェルプレート読み取り分光光度計を利用し、もう1つは蛍光顕微鏡でのシングルセルイメージングを利用します。プレートリーダー上で、96ウェルプレートで培養したHEK-293細胞を10 μMフォルスコリンまたは10 nMイソプロテレノールで刺激したところ、緑色下向きバージョンで蛍光が急速かつ大幅に減少しました。バイオセンサーは、蛍光顕微鏡でモニターされた個々のヒト気道平滑筋(HASM)細胞のcAMPレベルを測定するために使用されました。緑色の下向きのバイオセンサーは、フォルスコリンまたはイソプロテレノールで刺激されたときに、細胞の集団に対して同様の応答を示しました。このシングルセルアッセイでは、バイオセンサーの位置を20倍および40倍の倍率で可視化することができます。したがって、このcAMPバイオセンサーは高感度で柔軟性があり、不死化細胞と初代細胞の両方、および単一細胞または細胞集団のcAMPをリアルタイムで測定できます。これらの特性により、cADDisは生細胞におけるcAMPシグナル伝達ダイナミクスを研究するための貴重なツールとなっています。

Introduction

アデノシン3′,5′-環状一リン酸(cAMP)は、細胞のコミュニケーションとさまざまな生理学的プロセスの調整において中心的な役割を果たします。cAMPはセカンドメッセンジャーとして機能し、ホルモン、神経伝達物質、またはその他の細胞外分子からの外部シグナルを中継して、細胞内イベントのカスケードを開始します¹。さらに、cAMPは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)やアデニリルシクラーゼに関連する経路など、さまざまなシグナル伝達経路に複雑に関与しています。細胞シグナル伝達におけるcAMPの役割を理解することは、正常な細胞機能の根底にある複雑なメカニズムを解明し、さまざまな病状に対する潜在的な治療法を開発するための基本です²。

これまで、cAMPを直接的または間接的に測定するために、さまざまな方法が採用されてきました。これらには、細胞ATPプールの放射性標識とそれに続くカラム精製、HPLC、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合イムノアッセイ^{が含まれていました1,2}。これらのレガシーアッセイは、エンドポイントの測定値であり、時間依存の応答を構築するために多数のサンプルが必要であるという事実によって制限されています。最近では、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)センサーが開発され、生細胞でのアッセイを作成し、リアルタイムの動的データを生成し、センサーをさまざまな細胞内位置で標的にすることを可能にしました³。FRETは、2つの蛍光色素分子、1つの蛍光ドナー、および1つの蛍光受容体を活用し、近接すると、受容体蛍光色素分子はドナーの蛍光出力によって励起されます。最も使用される2つの蛍光色素は、シアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)で、これらは励起特性と発光特性が適合するためです。FRETバイオセンサーには、CFPやYFPに加えて、緑色蛍光タンパク質(GFP)や赤色蛍光タンパク質(RFP)の利用が一般的に使用されています。cAMP FRETバイオセンサーは、Epac2 cAMP結合タンパク質の両端にドナーとアクセプターを持つことで動作します。cAMP結合は、Epacの確認を変化させ、ドナーとアクセプターの蛍光色素の間の距離を増加させます^3,4。このコンフォメーション変化は、FRETの喪失、すなわち、ドナーフルオロフォア滴³から伝達されるエネルギーによるアクセプターフルオロフォアの興奮によって検出される。一見単純なプロセスですが、cAMP研究用のFRETバイオセンサーには多くの制限と問題があります⁵。その一つは、蛍光タンパク質、例えばGFPの選択であり、これは自然に二量体化することができ、^{したがって感度を低下させ}ることができる6。FRETベースのcAMPバイオセンサーは、特定のマイクロドメインを標的としてきました⁷が、2つの蛍光色素を持つコンストラクトのサイズが大きいため、制限がある場合があります⁶。もう1つの重要な問題は、蛍光色素の励起と放出の重なりから生じるFRET信号の信号対雑音比が低く、サンプリング周波数が高くなり、結果の解析が複雑になることです^4,5。

最近では、新しいバイオセンサー(cAMP Difference Detector In Situ)であるcADDisが、cAMP^{シグナル伝達の}制御を研究する際のこれらの制限やその他の制限を解決しました8。重要な改善点の1つは、単一の蛍光色素への依存性です。これにより、より広いダイナミックレンジと高いS/N比で、迅速かつ効率的な信号を得ることができます。その結果、⁸をくまなく調べる波長の範囲が狭くなるため、精度が向上する可能性があります。FRETプローブと同様に、バイオセンサーは細胞内位置を標的としており、脂質ラフトと非ラフト、およびその他の細胞^{内ドメイン9}におけるコンパートメント化理論の研究と探索を可能にしている。おそらく最も重要なのは、単一の蛍光色素バイオセンサーがハイスループットスクリーニングに適していることであり、FRETベースのバイオセンサーよりも感度と再現性が向上しています。バイオセンサーはBacMamベクターにパッケージ化されており、さまざまな細胞タイプの形質導入を容易にし、タンパク質発現を正確に制御できます。

BacMamベクター による 発現制御は、動物実験のデータの解釈を容易にするために、異なる種由来のGPCRオルソログを用いたアッセイに特に有用です。さらに、受容体発現の制御は、さまざまな程度の薬物効果(例えば、インバースアゴニストおよびパーシャルアゴニスト)を測定するために重要であり、低レベルの受容体発現は、動物組織に見られる低レベルを模倣するために有用である。BacMamは、初代細胞培養やHEK-293系統¹⁰などの哺乳類細胞に形質導入するように改変されたバキュロウイルスベクターです。優勢な選択マーカーにより、BacMamは従来のプラスミド感染症よりも安定性を高めることができます¹¹。このような選択的プロモーターは、より効率的な遺伝子導入と発現を可能にします。さらに、トリコスタチンA(ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤)を添加すると、レポータータンパク質レベルが増強されます¹¹。発現レベルは、使用するBacMamウイルスの力価 で 制御でき、細胞タイプごとに最適化する必要があります。このバイオセンサーの場合、赤または緑の蛍光タンパク質がN末端とC末端でEpacに結合しています。cAMPが結合すると、バイオセンサーのコンフォメーション変化により、蛍光タンパク質に隣接するアミノ酸が移動します。このようなシフトにより、吸光度は400nmで陰イオン状態から中性状態に移動し、蛍光が減少します。

1つの細胞に発現する90〜120のGPCRがあり、さまざまな神経液性シグナルに応答します¹²。したがって、細胞あたり少なくとも数十のGPCRが、それぞれGsまたはGiカップリングを介してcAMPを刺激または阻害できると仮定できます。FRETなど、このセカンドメッセンジャーをリアルタイムで監視する動きは進んでいますが、より効率的な方法が求められています。ここでは、cADDisを使用してcAMP信号の合成と劣化をリアルタイムでモニタリングする方法論を紹介します。蛍光の変化は、ハイスループットアッセイには蛍光プレートリーダーを使用し、シングルセルアッセイには蛍光顕微鏡を使用して、リアルタイムでモニタリングできます。これらの方法は、cAMP を介した GPCRシグナル伝達に関するさまざまな生物学的問題に役立ちます。

Protocol

本試験に使用されたすべての試薬および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. プレート読み取り分光光度計ハイスループットアッセイ

1. 96ウェルプレートにcADDis BacMamベクターを用いたHEK-293細胞の播種(1日目)
   1. ウイルスフード内で細胞を分裂させて感染させます。
      1. 温温HEK培地(表1)と0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で使用。
      2. フードと材料をEtOHに浸したティッシュで拭いて消毒します。
      3. HEK培地をフラスコから取り出し、血清学的ピペットで廃棄します。
      4. 血清学的ピペットで5 mLのMg²⁺ およびCa²⁺ 遊離DPBS(37°C)を加えます。フラスコを前後に傾けて、DPBSで底を洗います。DPBSは血清ピペットで取り外して廃棄します。
      5. 血清ピペットで温めた0.25%トリプシン-EDTAを3mL加えて、細胞をトリプシン化します。フラスコを傾けて、試薬がフラスコの底を完全に覆うようにします。フラスコに蓋をし、試薬を3〜5分間放置して、細胞がフラスコから離れるのを待ちます。
         注:この実験は75 cm² フラスコ用に最適化されています。異なるサイズの培養装置を使用する場合は、試薬の容量調整が必要になることがあります。
      6. 抗生物質を含む新鮮な培地を5mL引き出します。フラスコのボリュームを排出して引き込み、フラスコの壁を洗い、細胞を物理的に分離します。
      7. フラスコの全容量(8 mL)を回収し、15 mLチューブ内(25°C)で200 x g で5分間遠心分離します。
      8. 遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、血清ピペットで上清を取り除きます。
      9. ペレットを乱さずに細胞を洗浄するには、15 mLチューブの側面に500 μLのMg²⁺ およびCa²⁺ DPBSを含まないDPBSを加えます。DPBSを穏やかに添加した後、ペレットを乱さないように、できるだけ多くのバッファーを取り外して廃棄します。もう一度繰り返します。
      10. 細胞をカウントし、細胞密度を250,000細胞/mLに調整します。
      11. 黒色の透明な底部の96ウェルプレートのウェルあたりに必要な試薬量に基づいてマスターミックスを作成します。これを「ティッシュプレート」と呼びます。以下のボリュームを参照してください。
          注:1ウェルの例(総容量200μL):バイオセンサーBacMamベクター40μL(ストック2 x 10¹⁰ ウイルス遺伝子/ mL)、2μLトリコスタチンA(ストック100μM、最終濃度1μM)、158μLの250,000細胞/ mL細胞密度。10ウェルの例(総容量2 mL):バイオセンサーBacMamベクター400 μL(ストック10^{10 10} ウイルス遺伝子/mL)、トリコスタチンA20 μL(ストック100 μM)、1,580 μL培地、細胞密度250,000細胞/mL。
      12. ウェルあたり200μLのマスターミックスを加えます。細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO₂ で24時間インキュベートしてから、プレート読み取り分光光度計で実行します。
2. プレートリーダーでの実行
   1. ベンチトップで、各ウェル内のすべての培地を慎重に取り出し、37°CでMg²⁺ およびCa²⁺ を含む180 μLのDPBSと交換します。
   2. 顕微鏡で細胞を検査し、細胞の健康状態を確認します。
   3. プレートをアルミホイルで包み、37°Cで30分間〜1時間インキュベートします。
   4. インキュベート中に、1:10希釈(10倍とも呼ばれる)で読み取り用の薬剤を調製し、所望の最終用量にします。したがって、100 μMのフォルスコリンと100 nMのイソプロテレノールを調製します。
   5. 各薬剤60μLを円柱状に透明な96ウェルプレート(「薬物プレート」と呼びます)に加えます。
      注:適切な薬物希釈と読み取りを最適化するために、薬物は「薬物プレート」と呼ばれる透明な96ウェルプレートに添加され、読み取り時に96マルチピペッターを使用して「組織プレート」に移され、薬物をすべてのウェルに同時に追加し、蛍光分光光度計で迅速に読み取ることができます。
3. 蛍光プレートリーダーのセットアップ
   1. 蛍光プレートリーダーの設定を調整します。
      1. 読み取りモード: 蛍光。読み取りタイプ: kinetic。読み取り波長: 494nm および 522nm。
      2. 読み取り時間:ベースラインの蛍光読み取りに 3分 、薬剤後の追加に 7分 を入力します。「Interval」は、各読み取りの間に 30 秒間 00:00:30 として入力されます。
         注意: 読み取り時間は、必要な時間に基づいて最適化および延長できます。
4. データ集録
   1. インキュベーターからティッシュプレートを取り外し、アルミホイルとプレートの蓋を取り外し、ティッシュプレートをプレートリーダーに置きます。リーダーの引き出しを閉じて、ティッシュプレートを休ませ、リーダーの温度(37°C)に平衡化させます。
   2. 薬物希釈液を入れた透明な96ウェルプレート(薬物プレート)を96マルチピペットの下に置き、ウェルから20μLを引き出す練習をします。ピペッターの先端に均等な量の薬物が引き込まれていることを確認してください。
   3. 「ベースライン」測定の実行を開始します。
      注:40 RFU以上は実行可能なデータと見なされます。データがこの値を下回っている場合は、実験を停止して破棄する必要があります。
   4. ティッシュプレートは、ベースラインランの終了時にリーダーから排出されます。透明な薬物プレートから20μLを黒色組織プレートに迅速かつ慎重に加えます。その後、すぐに「治療」の実行を開始します。ティッシュプレートは、薬物が追加されてから30秒以上リーダーから出てはいけません。.
      注:薬物の添加が速すぎると、細胞が組織プレートから剥離し、使用不能な実験が生じます。さらに、細胞は光感受性緑色蛍光タンパク質に感染しています。したがって、迅速かつ迅速に薬物を追加し、2回目の読み取りを開始することは、反応の初期部分を見逃さないようにするために不可欠です。
   5. 2回目の読み取りが完了したら、ティッシュプレートがリーダーから排出され、データ収集が完了したことを確認します。
      注:ティッシュプレートを廃棄する前に、細胞がまだプレートに付着していることを確認するのがベストプラクティスです。顕微鏡で細胞を観察します。セルが分離した場合、結果は無効であり、破棄する必要があります。実験を繰り返す必要があります。
   6. 結果のデータをExcelファイルとしてエクスポートします。
   7. エクスポートしたExcel読み取り可能なデータをプレートリーダーから開き、関連情報をコピーしてExcel変換テンプレートに貼り付けます。データは、セットアップされたプレートリーダーからシングルウェルに変換され、コピーされたデータの右側にカラムの読み取りが行われます。
      注:経時的なウェルの蛍光カラムは、RFU(タイトル付きカラム変換)および初期読み取り時のRFU読み取り値に対する10進数の変化(t₀ 、デルタF)としてリストされています。Excel テンプレートでは、Delta F テーブルは、薬剤を追加する前の最後のベースライン読み取り値に設定されます。これは 6^番目の データ収集ポイントです。
   8. データ変換後、Delta Fからデータをコピーし、時間の経過に伴う蛍光の減衰または相対的な減衰としてデータ解析ソフトウェアに貼り付けます。
   9. 相対的な 10 進数値の X タイトルを "time (s)" に変更し、Y タイトルを "ΔF/F₀" に変更します。

2. 倒立型蛍光顕微鏡を用いたシングルセルアッセイ

1. 35 mmディッシュ内のcADDis BacMamベクターによる細胞の播種(HASM)(1日目)
   1. ウイルスフード内で細胞を分裂させて感染させます。
      1. 温かいHASM培地(表1)、0.25%トリプシン-EDTA、37°Cの水浴中。
      2. フードと材料を消毒し、EtOHを染み込ませたティッシュでフードを拭いてください。
      3. HASM培地をフラスコから取り出し、血清学的ピペットで廃棄します。
      4. 新しい血清学的ピペットで5 mLのMg²⁺ およびCa²⁺ 遊離DPBS(37°C)を加え、フラスコを傾けてDPBSで底を洗浄します。
      5. 血清ピペットで温めた0.25%トリプシン-EDTAを3 mL加えて、細胞をトリプシン化します。フラスコを傾けて、試薬がフラスコの底を完全に覆うようにします。試薬を3〜5分間放置して、細胞がフラスコから分離するのを待ちます。
      6. 抗生物質を含む新鮮な培地を5mL引き出し、ピペットを排出してフラスコの底から細胞を取り除きます。
      7. フラスコ(8 mL)遠心分離機の総容量を200 x gの遠心チューブに5分間集めます。
      8. 遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、血清ピペットで上清を取り除きます。
      9. ペレットを乱さずに、Mg²⁺ およびCa²⁺ DPBSを含まないDPBSを500 μLを遠心分離管の側面に加えます。できるだけ多くの液体を取り除いて廃棄し、もう一度繰り返します。
         注:この実験は75 cm² フラスコ用に最適化されています。異なるサイズの培養装置を使用する場合は、試薬の容量調整が必要になることがあります。
      10. 細胞をカウントし、40,000細胞/mLの細胞密度に調整します。
      11. 35 mmディッシュのウェルあたりに必要な試薬量に基づいてマスターミックスを作成します。以下のボリュームを参照してください。
          注:1ウェルの例(総容量500μL):バイオセンサーBacMamベクター20μL(ストック2 x 10¹⁰ ウイルス遺伝子/ mL)、5μLトリコスタチンA(ストック100μM、最終濃度1μM)、500μLの40,000細胞/ mL細胞密度。4ウェルの例(総容量2 mL):バイオセンサーBacMamベクター80 μL(ウイルス遺伝子ストック/mL)、トリコスタチンA20 μL(ストック100 μM、最終濃度1 μM)、培地2000 μL、細胞密度40,000細胞/mL。
      12. ウェルあたり500μLのマスターミックスを加えます。実験を続行する前に、細胞を37°Cおよび5%CO₂ で24時間インキュベートします。
          注:細胞番号は細胞株によって異なる場合があります。解析でセルが重ならないようにするには、小さいセル番号を使用します。
2. 薬理学的薬剤の調製(2日目)
   1. 各ウェル内の培地を慎重に取り除き、37°CでMg²⁺ およびCa²⁺ を含む450 μLのDPBSと交換します。
   2. プレートをアルミホイルで包み、35 mmディスクを37°Cで30分間〜1時間インキュベートします。
   3. 顕微鏡で細胞を検査し、細胞の健康状態を確認します。
   4. その間に、目的の最終濃度(10倍以上)より1 log単位高い読み取りのために薬物を準備します。.したがって、100 μMのフォルスコリンと100 nMのイソプロテレノールを調製します。
   5. 対数用量力価の場合、薬物を10 mMで調製し、段階希釈を使用して100 μMのフォルスコリンと100 nMのイソプロテレノールを達成します。.
3. データ集録
   注意: 次の設定は、蛍光倒立顕微鏡用です。各顕微鏡に付属するソフトウェアは異なる場合があります。ここでは、現在のプロトコルで使用されている一般的な設定について説明します。
   1. 中央のハブをオンにし、次に倒立蛍光顕微鏡をオンにします。
   2. キャプチャに使用するソフトウェアを開き、 タイムラプスキャプチャ オプションを選択します。
   3. 35 mmディッシュサンプルホルダーを顕微鏡ステージに置きます。
   4. 対物レンズを 20倍に設定します。
   5. オートフォーカスを使用して、できるだけ鮮明な画像を取得します。個々のセルを見つけるのが難しい場合は、4倍の対物レンズから始めて、次に20倍に移動します。顕微鏡にオートフォーカス機能がない場合は、サンプルに手動で焦点を合わせます。
      注:40倍の倍率は、より重要な細胞形態学的詳細が必要な場合に使用できます。
   6. 最適なデータ取得を得るために、 オートブライトネス (露出)、 励起波長、 ブラックバランス (バックグラウンドノイズを低減するため)、 オートフォーカスの設定を調整します。
   7. いくつかの細胞質蛍光細胞を含む視野を見つけたら、30秒ごとに20分間のタイムラプスキャプチャを使用してデータを取得します。
   8. 移動をクリックして読み始めます。
   9. ベースラインを収集するために3分間実行します。3分間の捕捉を行ったらすぐに、適切なウェルに50μLの薬剤を静かに加えます。薬物が添加されると、皿上の最終濃度は10μMのフォルスコリンと10nMのイソプロテレノールになります。
      注:薬は慎重に追加する必要があります。ピペットの先端でプレートに触れると、視野が移動し、サンプルを分析できなくなる可能性があります。
   10. 実験をさらに 17 分間実行し、30 秒ごとにデータをキャプチャします。
   11. テストが完了したら、データを分析する準備ができていることを確認します。
       注:現在のプロトコルには焦点ドリフトのコントロールは組み込まれていませんが、実験にコントロールを含めることは有益です。例えば、核色素の使用は、顕微鏡分析中、特に長時間にわたる生細胞の画像をキャプチャする際に、焦点ドリフトの管理に役立ちます。cADDisバイオセンサーは通常、細胞内に広く分布しているため、広い焦点面が最も効果的な捕捉となり、焦点ドリフトを制御する必要性が軽減されます⁹。
4. データの分析
   注:各顕微鏡に付属するソフトウェアは異なる場合があるため、キャプチャした画像の分析に使用する一般的な設定については、ここで説明します。
   1. 実験中にキャプチャした画像ファイルを開きます。
   2. ポリゴンまたは円ツールを使用して、解析を実行する各セルの対象領域を選択します。解析では、各時点における各セルの明るさを求める必要があります。
      注:ベストプラクティスは、皿や他のセルの壁に接触しているセルではなく、個々のセルを選択することです。これにより、可能な限り最高のデータ収集が保証されます。各条件内で解析する細胞を5個以上選択し、実験を少なくとも3回繰り返します。
   3. データを分析した後、Excelシートでデータを開き、薬理学的薬剤またはビヒクルを追加する直前の写真から始めて、各写真の各条件の平均輝度を計算します。この例では、各写真が30秒ごとに撮影されるため、顕微鏡で撮影した3分目または6^枚目の 写真です。
   4. 各条件の平均値ごとにΔF/F₀ を計算します。
   5. 統計解析ソフトウェアにロードし、時間に対してΔF/F₀ をsでプロットします。
      メモ: 図 1 は、プロトコルの主な手順の概略図を示しています。

Results

本研究では、プレートリーダーと顕微鏡アッセイの両方で細胞質バイオセンサーが検証されました。バイオセンサーを発現させた細胞は、10 μM フォルスコリン(アデニリルシクラーゼの直接活性化因子)、10 nM イソプロテレノール(β₁AR および ß₂AR のアゴニスト)、またはビヒクル(図 1)のいずれかで刺激されました。その後の蛍光の変化は、cAMP産生を示すもので、30秒ごとに捕捉されました。

データは、初期蛍光(ΔF/F₀)からの蛍光の変化として変換されました。蛍光データに1サイト崩壊モデルを適用して、さまざまな条件でのcAMPレベルの時間的変化を定量化しました(図2および図3)。これらの崩壊曲線のパラメータを使用して、薬物の特定の濃度に対する応答を定量化できます。薬物反応を定量化する単一の値としての崩壊率(k)とプラトーの積が使用され、これらを使用して、同じ薬物の複数の濃度が適用された場合の濃度反応曲線を作成しました¹³。

プレートリーダー上で 10 μM フォルスコリンで刺激すると、細胞質センサーは数秒以内に蛍光強度の大幅な減少を示し、HEK-293 細胞の蛍光強度が数分間にわたって進行しました (ベースライン 0 ΔF/F_o の 200 秒から 600 秒の -0.7 ΔF/F_o まで) (図 2A)。緑色センサーの設計を考えると、蛍光の減少はcAMP産生の増加を示し、フォルスコリンがサイトゾル内のcAMPレベルを均一に増加させたことを示しています。HEK-293細胞を最大以下の濃度のイソプロテレノール(10 nM)で刺激すると、バイオセンサーの蛍光が急速かつわずかに減少しました(600秒で-0.3 ΔF/F_o、 図2A)。これらの低濃度のイソプロテレノール(10 nMおよび100 nM)を1つの細胞ウェルで経時的に調べたところ、HEK-293細胞でcAMPレベルの振動が観察されました(図2B)。これらの振動の周期性は一貫して約200秒でした。ルーチンデータ解析には、これらの振動を平均化する単一サイト減衰モデルへの応答のフィッティングが含まれます(接続線を参照)。複数の実験を平均化すると、通常、これらの振動がデータで不明瞭になります。それにもかかわらず、バイオセンサーは、cAMP振動の観察を可能にする感度と迅速な速度を示します。

cADDisは、蛍光顕微鏡を使用して測定することもできます。このアプローチにより、単一細胞内のcAMPのモニタリングが可能になり、さまざまな細胞内位置を標的とするバイオセンサーの可視化にも適応できます。本研究では、バイオセンサーをヒトの初代気道平滑筋(HASM)細胞に使用しました。ビヒクル、10 μM フォルスコリン、または 10 nM イソプロテレノールのいずれかで HASM を刺激すると、時間の経過とともに蛍光強度が観察可能なほど減少します (ベースラインの 0 ΔF/F_o の 120 秒から 410 秒の -0.9 ΔF/F_o) (図 3) (ビデオ 1、 ビデオ 2、 ビデオ 3)。蛍光は細胞の細胞質全体に均一に分布し、核を除外します(タイムラプスビデオを参照)。したがって、フォルスコリンとイソプロテレノールは、蛍光HASM細胞において同様の急速かつ大幅な減少をもたらしました。これらのデータは、初代細胞培養でバイオセンサーを使用する能力を示しています。

図1:バイオセンサーのプロトコールステップの概略図。 まず、培養細胞を分割し、新鮮な培地で再懸濁した後、cADDisセンサーを搭載したBacMamウイルスに感染させます。トランスフェクション後の細胞は、cAMPを変化させる細胞経路を誘発する薬理学的薬剤で刺激されます。cAMP濃度の変化に応じた蛍光強度の変化は、プレート読み取り分光光度計(A)または蛍光顕微鏡(B)を使用して捕捉され、cAMPダイナミクスのリアルタイム定量化を提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:プレート読み取り分光光度計による生HEK-293細胞中のcAMPのリアルタイムモニタリング。 バイオセンサーを発現する96ウェルプレート上のHEK-293細胞の蛍光を経時的に測定しました。ベースライン蛍光が確立された後、蛍光減衰を7分間モニターした±。(B)蛍光減衰振動は、10 nMまたは100 nMのイソプロテレノールを添加した後の1つの実験をプロットすることによって示されます。両方のグラフのデータは、1 つのサイト減衰モデル (接続線) に適合されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:蛍光顕微鏡による生HASM細胞中のcAMPのリアルタイムモニタリング。 バイオセンサーを発現する35 mmのめっき皿上のHASM細胞の蛍光を経時的に測定しました。ベースライン値が確立された後、蛍光減衰を30秒ごとに20分間測定しました。示された薬剤は 120 秒 (矢印) で追加されました。バイオセンサーの蛍光減衰は、ビヒクル、10 μM フォルスコリン、または 10 nM イソプロテレノールのいずれかに応答して減衰します。1 つの実験のデータは、接続線で示されています。ビヒクル(コントロール)、フォルスコリン、またはイソプロテレノールで処理された細胞のタイムラプスビデオが含まれており、バイオセンサーの蛍光応答を視覚的に表現できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:ビヒクルに応答した生HASM細胞のcAMPのリアルタイムモニタリングのタイムラプスビデオ。 ビヒクル(制御)に応答したバイオセンサーの蛍光減衰曲線。各フレームは 30 秒ごとに 20 分間キャプチャされました。スケールバー:40μM。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:10 μMフォルスコリンに応答した生HASM細胞中のcAMPのリアルタイムモニタリングのタイムラプスビデオ。 10 μM フォルスコリンに応答したバイオセンサーの蛍光減衰曲線。各フレームは 30 秒ごとに 20 分間キャプチャされました。スケールバー:40μM。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:10 nMイソプロテレノールに応答した生HASM細胞のcAMPのリアルタイムモニタリングのタイムラプスビデオ。 10 nMイソプロテレノールに応答したバイオセンサーの蛍光減衰曲線。各フレームは 30 秒ごとに 20 分間キャプチャされました。スケールバー:40μM。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

培地の定式化
HASMミディアム
名前	容積
ハムのF-12K	419.65ミリリットル
FBSの	50ミリリットル
HEPESの(1M)	12.5ミリリットル
水酸化ナトリウム溶液	6ミリリットル
L-グルタミン 200 mM (100X)	5ミリリットル
塩化カルシウム (1 M)	0.850ミリリットル
抗生物質-抗真菌薬(100倍)	5ミリリットル
プリモシン	1 mLの
HEKミディアム
名前	容積
DMEMの(1x)	444ミリリットル
FBSの	50ミリリットル
抗生物質-抗真菌薬(100倍)	5ミリリットル
プリモシン	1 mLの

表1:HASM培地とHEK培地の培地組成。

Discussion

cAMPの正確で高感度な測定は、さまざまな細胞プロセスにおけるcAMPの役割を理解し、cAMP依存性シグナル伝達経路の活性を研究するために重要です。cAMPレベルの測定には、ELISA、ラジオイムノアッセイ、FRETバイオセンサー、GloSensor cAMPアッセイ^{14、15、16、17、18}など、いくつかの方法が一般的に採用されています。各cAMPアッセイには長所と短所があります。このプロトコルにより、数分から数時間のリアルタイム検出とモニタリングが可能になり、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含めることなく、生細胞内のcAMPダイナミクスを測定できます。この後者の点は、cAMPシグナル伝達の調節におけるホスホジエステラーゼアイソフォームの役割を研究することに関心のある研究者にとって重要です¹⁹。バイオセンサーは、cAMP結合時に蛍光を減少させる緑色蛍光色素、cAMP結合時に蛍光性が増加する赤色蛍光色素、cAMP結合時に蛍光性が増加する緑色蛍光色素分子など、複数のバージョンが市販されています( 材料表を参照)。バイオセンサーの下向きバージョンは、主な制限要因がバイオセンサーの発現レベルであり、このバージョンは実験を開始する前にベースラインで最大の蛍光を表示し、最大のcAMP刺激を追加することでバイオセンサーの発現を評価する必要性を軽減するため、最も有用です。バイオセンサーは、膜マイクロドメイン、一次繊毛、または核を標的とするバージョンでも入手可能です。これらの異なるバージョンにより、同じ細胞内の細胞質および膜/繊毛のコンパートメントでcAMPを同時に測定できます。これらの新しいツールは、急速に進化する研究の重要な分野である、さまざまな細胞成分にわたるcAMPダイナミクスの視覚化と定量化に独自の長けを持っています²⁰。

バイオセンサーは、リアルタイムのcAMPダイナミクスを効果的に監視する簡単な方法を提供し、研究者はcAMPレベルの急激な変化を優れた時間分解能で観察することができます。バイオセンサーの主な強みの1つは、その高感度にあり、cAMP濃度の微妙な変動と大きな変動の両方を検出できます⁸。cAMP振動におけるこの例は、ホスホジエステラーゼ阻害剤が存在しないHEK-293細胞の低レベルのイソプロテレノール刺激で観察されます(図2B)。この振動挙動は理解されておらず、これらの細胞に特有のように見えますが、バイオセンサーの感度と迅速な動態により、それらの検出が可能になります。ただし、バイオセンサーは容易に飽和する可能性があるため、このバイオセンサーは中型と大型のcAMPシグナルの違いを定量化することに制限される可能性があることに注意してください。この制限機能は、受容体刺激も存在する場合にcAMPレベルの全体的な増加を引き起こすホスホジエステラーゼ阻害剤を使用する場合に特に重要です。この研究ではHASMの感染について紹介しますが、BacMamベクターを使用した初代細胞への感染に関連する課題を認識することが重要です。バイオセンサーの十分な発現を達成するために、条件は個々の細胞タイプに最適化する必要があります。それにもかかわらず、バイオセンサーの感度とスケーラビリティは、ハイスループットアッセイに最適です。

FRETベースのセンサーよりもこのバイオセンサーを使用する別の利点は、光退色を最小限に抑えることです。多くの蛍光バイオセンサーは、長時間の繰り返しの励起後に光退色を起こします。ここで説明するプロトコルは、30秒間隔で間隔を空けた短時間の励起を含む。また、バイオセンサーは非常に明るいため、このタイプの分析では光退色の可能性が抑えられます。光退色は、ドリフトとして読み取られた最初のベースライン中に観察されます。ベースラインドリフトが発生した場合は、曲線をフィッティングする前にデータからドリフトベースラインを差し引くか、サンプリング間隔を長くして励起の周波数を減らすことができます。

他のcAMPバイオセンサーと同様に、このバイオセンサーはcAMPへの結合に対して高い特異性を持っています。その結果、このアッセイで生成されるシグナルはcAMPレベルと直接相関し、他の細胞成分からの干渉の可能性を大幅に低減し、信頼性の高い結果を提供します。さらに、バイオセンサーの汎用性は注目に値します。GloSensorアッセイは現場で広く使用されていますが、いくつかの制限があります。例えば、一過性トランスフェクションに頼ると、特定の細胞タイプで非効率性が生じる可能性があり、同じ細胞内の複数のパラメーターやプロセスの解析が課題となります。さらに、このアッセイは、特定の化合物の影響を受ける可能性のあるルシフェラーゼ酵素に依存しているため、結果の精度が低下する可能性があります²¹。一方、バイオセンサーは、接着細胞や浮遊細胞など、さまざまな細胞タイプや実験系で使用できます。多様な細胞状況との互換性により、研究者は異なる生物学的システム22,23,24にわたるcAMPダイナミクスを調査することができる。このバイオセンサーアッセイと蛍光顕微鏡法の統合は、細胞形態学的情報も収集できるため、その有用性をさらに高めます25,26,27。

このアッセイは、研究者に実験デザインに大きな柔軟性を提供し、cAMPシグナル伝達に関連する幅広い研究を可能にします。これは、基礎cAMPレベルの測定、多様な刺激や治療に応答したcAMP変動の研究、およびさまざまな生理学的または病理学的条件におけるcAMPダイナミクスの探索を可能にする、複数の目的に役立ちます。このアッセイの主な強みの1つは、他の技術との互換性であり、これによりcAMPシグナル伝達をより包括的に理解することができます。バイオセンサーを免疫蛍光染色や遺伝子操作などの方法と組み合わせることで¹⁰、研究者は特定の細胞コンパートメントまたはシグナル伝達経路内のcAMPの正確な空間的および時間的調節についてより深い洞察を得ることができます。この統合により、研究者はさまざまな状況でのcAMPの多様な機能を調べることができ、cAMPを介した細胞プロセスの複雑さに関する貴重な洞察を得ることができます。これらの技術を採用することで、研究者は個々の細胞レベルと集団レベルの両方でcAMPレベルを視覚化および定量化し、cAMPプールの同定など、細胞内でのcAMP分布を包括的に理解することができます。その結果、これらの方法を組み合わせることで、正確なデータの取得が可能になり、cAMPシグナル伝達の知識に大きく貢献しています。

従来の方法はcAMP分析に価値がありましたが、cADDisの導入は、この分野での有望な進歩を表しています。その特異性、感度、およびリアルタイム性により、特に生細胞との互換性により、研究者のツールキットに貴重な追加機能が追加されます。cAMPレベルをリアルタイムで監視する機能と高感度を備えたバイオセンサーは、さまざまな実験環境で大きな利点を提供します。この進歩は、cAMPシグナル伝達の動的性質と、生理学的および病理学的プロセスにおけるその機能的意味のより深い理解に貢献します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェルプレート(クリア)	フィッシャーブランド	21-377-203
35 mmディッシュ	Greiner Bio-One	627870	ガラス底付き細胞培養ディッシュ
96ウェルプレート	Corning	3904	ブラック、クリアフラットボトム
抗生物質-抗真菌剤 (100x)	Gibco	15240062	HEK および HASM 培地用
BZ-X 蛍光顕微鏡	Keyence
塩化カルシウム (IM)	Quality Biological Inc	E506	HASM 培地
用 遠心チューブ (15 mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM (1x)	Gibco	11965092	HEKメディア
DPBS、Mg2+およびCa2+	Gibco	14040-133
DPBS Mg2+ および Ca2+	Corning	14040-133
ウシ胎児血清 (FBS)	R&Dシステム	S11195	HEKおよびHASMメディア用
Forskolin	Millipore	344270	Drug
Green Down cADDis cAMP Assay Kit	Montana Molecular	#D0200G	Reagent
Ham's F-12K	Gibco	21127022	HASM 培
HEPES (1M)	Gibco	15630080	HASM 培地用
Isoproterenol	Sigma	I6504	薬剤
L-グルタミン 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	HASM 培地用
微量遠心チューブ (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	HASM媒体用抗生物質
	Thermo Scientific	700511
酸化ナトリウム溶液	Sigma	S2770	HASM媒体用
Spectrmax M5 プレートリーダー	分子デバイス
トリコスタチンA	TCI	America T2477	試薬
トリプシンEDTA	Gibco	25200-056	試薬