方法論記事

半自動8アーム放射状迷路におけるマウスの食欲をそそる空間作業記憶タスク、迷路における恐怖記憶連想の低減

DOI：

10.3791/66456

⸱

2025年7月29日

 ,  ,  , 
1The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, 2Gerald Choa Neuroscience Institute, The Chinese University of Hong Kong

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

げっ歯類の行動実験のほとんどは、もともとラットのために考案されました。ラットとマウスの行動の違いにより、マウスには改造が必要な場合があります。マウスの空間作業記憶をテストし、作業記憶タスク中のストレスを最小限に抑える方法を提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法論文では、半自動放射状 8 アーム迷路 (RAM) を使用してマウスの空間作業記憶をテストするプロトコルについて詳しく説明します。RAMは、中央ハブから放射状に伸びる8つの水平な等間隔アームを備えた部分密閉された装置であり、そこから各アームへのアクセスはサーボ制御の電動ドアによって個別に制御できます。動物は中央のハブから始まり、各腕または選択した腕の端にある食べ物の報酬を得るために迷路を探索することができます。RAMタスクはもともとラット用に設計されましたが、たとえば、より多くの慣れステップを含めることで、マウス用のプロトコルを適応させました。私たちのプロトコルでは、最初にすべてのアームに加糖コンデンスミルクを餌にし、マウスをランダムに選択された4つの擬似アームに順番に入れて報酬を集め(「強制ラン」)、すべてのドアを一緒に開けてマウスが自由に走らせ、残りの4つの報酬を見つけます(「フリーラン」)。作業記憶に挑戦するために、強制実行とフリー実行の間に 5 秒の遅延が導入されます。フリーラン中にマウスが以前にアクセスしたアームに入ると、エラーが記録されます。すべての報酬が回収されるとタスクは完了です。6日間の慣れと9日間の迷路トレーニングの後、雄のC57BL / 6マウスは、4/(4+E)として定義される80%の毎日の成功率スコアを定期的に≥達成し、Eはエラーの数です。この半自動タスクは、原則として、電気生理学、多光子顕微鏡、カルシウムイメージングなどの in vivo モニタリング方法と組み合わせることができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ワーキングメモリ1 は、電話番号や別の場所からの目的地へのルートを記憶するなど、精神的なタスクの計画と実行に操作および使用される間、限られた量の情報を短期間保持できる認知プロセスです。これは、素早く推論し、抽象的に考える能力である流動的知能と密接に関連しています。作業記憶トレーニングは流動的知能を改善できると考えられています2.したがって、ワーキングメモリは調査研究にとって非常に重要です。

げっ歯類の最も一般的な行動実験は、もともと1980年代にラット用に考案されたもので、今日の研究者はそれらのプロトコルをマウスに適用することがよくあります。しかし、ラットとマウスの間には一貫した行動の違いがあります3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .特に、マウスはラットに比べてストレスを感じやすいため、恐怖管理は実験結果に影響を与える重要な要素です 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17、18,19。したがって、これらのプロトコルをマウスに適用する際には、違いを考慮することが重要です。私たちのプロトコルでは、橈骨腕迷路での作業記憶タスク中のストレス要因を最小限に抑えようとしました。これは、マウス追跡ソフトウェアと迷路制御ソフトウェアを使用してドアを閉めるタイミングを慎重に計ることによって行われました。また、中央ハブでのセッション終了時のネズミの捕獲も回避されました。このアプローチにより、マウスは場所を捕まえることを恐れることなく、次の腕を選択することができました。迷路ですべての報酬が集まるまでネズミの捕獲を遅らせることで、最後の報酬が捕まった経験にリンクされないようにしました。

陸上橈骨腕迷路 (RAM) は、げっ歯類の空間的および非空間的学習と記憶を評価し、作業記憶と参照記憶をテストするために一般的で一般的に使用される装置です。これは、マウス20、21、22における空間学習および記憶のための最も人気のある装置の1つです。RAMは、採餌に加えて、迷路を探索し、目新しさを見つけ、試行錯誤しながら空間情報を学習するげっ歯類の自然な傾向を利用します。この傾向は、食事を制限し、迷路の中で好みの食べ物を与えることで増強できます。現在、RAM装置のいくつかの変種、例えば、6、8、12、または16のアーム、および部分的に密閉された、またはオープン/昇降された装置23、24、25を有する。現在のほとんどのプロトコルは、Olton et al.20,26 のプロトコルに基づいていますが、より単純な (6 アームまたは 8 アーム) 迷路 9,24,27,28,29 を使用します。放射状の腕の迷路(6本または8本の腕)での作業記憶のテストは、動物が探索する腕の選択肢が多いため、T型迷路(2本の腕)よりも強力です。

元のRAMは、負の強化、すなわち水浸20、すなわち水浸を使用するモリス水迷路や8アーム放射状水迷路などの水迷路とは異なり、正の強化のために餌を使用してラットの空間学習と記憶を評価するためにOltonとSamuelson20によって設計されました20。オルトンとサミュエルソン20は、ラットが RAM を通過するときに場所の優れた記憶を持っていることを発見しました。彼らは、海馬が空間情報処理に関与していることを示しました。したがって、彼らはげっ歯類に作業記憶と参照記憶からなる二重記憶システムの概念を導入しました。この二重記憶システムは、ハトの実験に基づいてHonig36によって以前に提案されていました。Oltonらは、海馬の機能がワーキングメモリに不可欠であることを発見しました。これは、嗅内領域、線毛円蓋の本体、海馬、中隔、または交連後円蓋の前方に病変を作り、海馬形成層の主要な外因性線維接続のそれぞれを破壊することによって達成されました26,33,34,35。円蓋線毛病変は参照記憶に影響を与えませんでした26。

現代のプロトコルでは、動物は、1日あたり10〜15分間、連続3日間迷路を自由に探索できるようにすることにより、環境に慣れ、その後、すべての腕の端に好みの食べ物または固定された選択された腕で1〜3週間迷路トレーニングを行い、作業記憶、または作業記憶と参照記憶を同じ実験でテストします。 それぞれ9、29、37。

多くの場合、これらのプロトコルは完全には説明されておらず、ラットとマウスの行動の違いは十分に考慮されていません。ここでは、私たちのプロトコルと経験、特にラットとマウスの恐怖管理の違いに基づいて、恐怖体験を場所やタイミングと関連付けないようにする方法を詳細に紹介します。このプロトコルは、空間ワーキングメモリを研究し、マウスを使用した電気生理学、リアルタイムイメージング、および組織学に適用したい研究者向けです。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべてのマウス実験は、UCL倫理委員会によって事前に承認され、1986年動物(科学的手順)法およびその後の英国政府の法律に基づいて認可されました。

1. ソフトウェアアプリケーションにおける自動迷路制御のためのプログラムの準備

注:図1A-Cに示すように、自動化されたラジアルアーム迷路と、図1Dの部屋のレイアウトが使用されました。

  1. 図2に示すように、ドアを閉めるための実験ワークフローを準備します。
  2. 習慣化ステージ1の開始をソフトウェアアプリケーションで設定します(図2A)。これを行うには、以下の手順に従ってください。
    1. トライアルとビデオ録画の開始を設定し、ソフトウェアのすべてのアームを閉じます。ソフトウェアが迷路の中央ハブにあるマウスを認識してから 5 秒後、追跡を開始し、すべてのドアを開きます。
    2. マウスがアームの内側に入り、中央ハブドアの最も近いドアから4cm離れたら、すべてのドアを閉めます。そして、すべてのドアを閉めた直後に、マウスが選択したアームのドアを開きます。
    3. マウスが中央ハブに戻ったら、ドアを閉め、中央ハブに 5 秒間閉じ込めます。これを30分間繰り返します。
    4. 30分が経過すると、ビデオの録画と追跡を停止し、マウスは中央のハブに戻ります。
      注:マウスに自由に迷路を探索させます。
  3. 慣れ段階2(図2B)
    1. 関連するソフトウェアでトライアルとビデオ録画の開始を設定し、すべてのドアを閉じます。
    2. ソフトウェアが迷路の中央ハブにあるマウスを認識してから 5 秒後、追跡を開始し、すべてのドアを開きます。
    3. マウスが少なくとも2回または30分後に各アームに入り、その後中央ハブに戻った場合は、試験を終了します。マウスに自由に迷路を探索させてください。
  4. 慣れ段階3(図2C)
    注:このステージは、ステージ1とステージ2の組み合わせです。
    1. トライアルとビデオ録画を開始し、すべてのドアを閉めるようにソフトウェアを設定します。
    2. ソフトウェアが中央ハブのマウスを認識してから5秒後に迷路のドアを制御するようにソフトウェアを設定します。この時点でトラッキングの開始を設定し、すべてのドアを開きます。
    3. マウスがアームの内側に入り、中央ハブドアの最も近いドアから4cm離れたら、すべてのドアを閉めます。次に、アームのドアを開きます。
    4. マウスが中央ハブに完全に入ったらドアを閉め、マウスを中央ハブに3秒間閉じ込めます。このシーケンスを30分間、またはマウスが各アームに少なくとも1回入るまで繰り返します。
    5. 条件を満たした後、マウスが中央ハブに完全に入ったときのトライアルの終了を設定します。
      注:マウスに自由に迷路を探索させます。
  5. 作業記憶タスク(図2D、E)
    1. トライアルと録画を開始するようにソフトウェアを設定し、すべてのドアを閉じます。
    2. ソフトウェアが中央ハブのマウスを認識してから5秒後、追跡を開始するようにソフトウェアを設定します。
    3. 強制実行フェーズを開始します。擬似ランダムに選ばれた4本の腕を1本ずつマウスにプレゼントする。
    4. マウスが最初のアームに入り、中央のハブから3 cm離れたら、ドアが閉じ、アームに15秒間閉じ込められることを確認します。
    5. ドアを開けて、マウスを中央のハブに戻します。
    6. ドアを閉めてから、2番目のアームを開きます。
    7. これを4番目のアームまで繰り返します。
    8. 強制実行フェーズの 4 番目のアームの後にマウスが中央ハブに戻ったら、マウスを中央ハブに 5 秒間閉じ込めます。
    9. すべてのドアを開けて、フリーランフェーズを開始します。
    10. すべての報酬を集めた/すべての腕を一度でも入った後、マウスが中央ハブに戻ったら試練を終了する。

2. 個人住宅用のホームケージの準備

  1. 新しい実験のために、標準のネスティング材料を使用して新しいケージをセットアップします。
    1. 実験のために、新しい寝具、おがくず、紙のイグルー、紙のトンネル、紙の巣の縞模様、木製のバイトブロックを新しいケージに入れます。
    2. フードホッパーを置き、蓋を閉めます。
      注意: マウスは、フードホッパーがないと換気用の部品を損傷する可能性があります。

3. 動物収容室での取り扱い、計量、食事制限(-7日目から0日目)

  1. マウスをホームケージに付属の紙トンネルに手でそっと誘導します。
  2. 紙トンネル38,39,40を手で使用して、グループ化されたケージからマウスを持ち上げ、数秒間胸の高さに保ちます。または、マウスを自発的に手の上に登らせます。
    注:最小限のストレスで動物を扱うことは、行動実験に不可欠です。ネズミにとってストレスになる尻尾をつかまないでください。マウスを実験者に慣れさせることも重要です。マウスはよく慣れてリラックスしている必要があり、そうしないと、後で迷路でうまく学習できません。
  3. 常に同じ処理方法を使用してマウスを保持してください。体重計にマウスを乗せて体重をモニタリングし、体重を記録します。
    注:体の動きが速いり、大きな音を立てたりしてマウスにストレスを与えないでください。これは静かな環境で行うことをお勧めします。そうしないと、体重計や実験者の手から飛び降りる可能性があります。また、マウスがストレスを受けると、目を細めたり、きしみたり、実験者の手を噛んだりすることがあります41,42。
  4. 計量後、マウスを先ほど用意した新しいケージに入れます。
  5. 橈骨腕迷路にさらされる前の1週間、マウスに制限された量の食事を与えます。これにより、彼らは提供される食べ物の報酬を求めて迷路を探す動機になります。実験中の食物報酬は、希釈した加糖練乳です。
  6. 2~3gの標準チャウをケージに入れ、実験中ずっと体重を開始体重の85~90%に維持します。
    注:C57BL / 6マウスは、毎日3〜4 gの標準的なチャウを食べます43。
  7. 翌日与える食事の量を標準化するためのガイドとして、一晩の体重の低下を観察してください。それ以降、実験全体を通して開始体重の85〜90%を維持するために、十分な量の標準食を毎日与えます。
    注:これらの動物はゆっくりと体重を減らす必要があります。ストレスを避けるために、体重と表情を監視してください。
  8. 希釈練乳(ご褒美、加糖練乳:水=1:1)をホームケージ内の小さなプラスチックカップに入れて1mL与え、慣れ段階1が終わるまでマウスを慣れさせます。ネズミが報酬を食べるようにしてください。マウス系統が提示された食物に対して新恐怖症を示した場合は、報酬食品を変更します。
    注: 慣れ段階 2 からは、ホームケージで報酬を提供しないでください。マウスの体重が開始体重の80%を下回った場合は、IACUCおよび国固有のガイドラインに従って安楽死させる必要があります。マウスが最初の体重チェックで使用されているマウス系統の正常な体重範囲(8〜12週齢で20〜30 g)にない場合、後で必要な範囲に体重を維持することが困難になることを避けるために、コホートで考慮すべきではありません。

4. マウスを実験室に連れて行く

  1. トロリーを使って、マウスをゆっくりと行動検査室に連れて行きます。
  2. マウスをトロリーの上に5分間放置します。

5. 部屋の設営

  1. 中央ハブを間接的に照らす室内照明を温白色電球で80ルクスに設定し、中央ハブで測定した70dBでホワイトノイズを再生します。注:中程度の強度のホワイトノイズにさらされると、ラットは幾何学的に複雑な迷路44,45でより優れたパフォーマンスを発揮することが知られています。ホワイトノイズは、単に環境中の避けられないノイズを隠す以上の役割を果たしているようです。70dBのホワイトノイズは、前頭前野、視床下部、海馬(線条体ではない)を含むラットのいくつかの脳領域でのコリン取り込みを増加させます46およびRAMワーキングメモリのパフォーマンスは、海馬、前頭皮質、および前脳の間のコリン作動性経路の完全性に依存することが知られています32,47.動物は遠位と近位の両方の視覚的手がかりを使用して、環境内を正確に移動することも知られています。ただし、マウスは、空間学習中にナビゲートするために、近位の手がかりよりも遠位の視覚的手がかりに依存しています48。この実験では、小さな紙に印刷された近位手がかりを 8 アーム RAM のすべてのアームの後壁に導入しましたが、デイジーチェーン接続の挙動は減少しませんでした。一方、幾何学的に非対称な遠位視覚的手がかり (部屋の天井と壁上) は、デイジーチェーン接続を減らし、RAM 内の空間ナビゲーションに不可欠でした。

6. 慣れ段階1 - 報酬なし(1日目〜2日目)

注:迷路には報酬が餌としては入っていません。この段階は、ネズミを迷路のドアとその音に慣れさせることです。

  1. クリックして、マウスの追跡とビデオ録画を開始します 開始 ソフトウェア のボタンをクリックし 、ストレスをかけずにマウスを迷路に持っていきます。これを行うには、マウスを実験者の手に持っている間にゆっくりと移動し、ゆっくりと高さを変えます。中央のハブにマウスを置きます。
    注:マウスが実験者の手を振った場合は、動きを遅くしてください。怖いという表れです。マウスは、強制走行フェーズを開始する前に、中央ハブで5秒間の監禁期間中動き回ります。中央のハブに配置すると、どの側にも面できます。
  2. 迷路から遠く離れた場所、または迷路の壁の高さより下に配置されたPCモニターでマウスの動作を監視し続けてください。マウスが壁に登って迷路から脱出しようとした場合は、椅子から立ち上がって実験者の存在を示し、実験者のパフォーマンスを監視しながら迷路に向かって歩きます。最悪の場合、マウスを迷路に押し戻します。
    注:通常、マウスは実験者が迷路に近づくときに服の摩擦音を聞いた後、迷路に戻ります。これは迅速に行う必要があります。実験者がこれを続ければ、マウスは慣れ段階1から3の後も迷路にとどまります。マウスが迷路から飛び出し続ける場合は、それ以上の実験や分析からマウスを削除することをお勧めします。
  3. 試行後、マウスを実験者の手に自発的に登らせ、もう一方の手で腕を覆って迷路から飛び降りないようにして、迷路の腕からマウスを回収します。
  4. ネズミの糞を払い落とし、乾いたティッシュで迷路を拭き取り、報酬の痕跡を取り除きます。次に、ウェットティッシュで拭き、ドライティッシュで迷路を乾かします(約2分)。
  5. これを各マウスに対して順番に2日間行います。
    注:30分後、マウスは迷路の8つのアームすべてを訪れていない可能性があります。これは正常であり、問題ありません。マウスは、非体系的で非連続的なパターンで腕を訪れ、慎重に動く傾向があり、各腕で不均一な時間を費やします。この段階では、ネズミは迷路の壁に登ったり、迷路から飛び出したりすることができます。このような場合(たとえば、マウスが壁に登ろうとする場合)、実験者が迷路に近づき、服がカサカサ音を立てるなどの音を立てて、マウスに自分の存在を認識させることで、それを防ぎます。したがって、RAM でのマウスの動作を注意深く観察し、迅速なアクションが必要になる場合があります。この手順を数回繰り返すと、マウスは迷路にとどまります。すべてにもかかわらず、慣れ中にマウスがRAMにとどまらない場合は、分析から削除します。

7. 慣れ段階2 - 報酬(3日目〜4日目)

注: このステージは、マウスが餌の報酬を得るために迷路を自由に探索することを奨励するためのものです。

  1. 各アームの各フードウェルに70 μLのフード報酬を入れます。
  2. 6.1で説明されているように、ソフトウェアの[ スタート] ボタンをクリックし、マウスを迷路の中央ハブに置いて、マウスの追跡とビデオ録画を開始します。
  3. 離れた場所からPCモニターでマウスの動作を観察し続け、必要に応じて、壁に登ったり、迷路から飛び降りたりするなど、それを書き留めてください。マウスが各アームに少なくとも2回または30分が経過したときに試験を終了します。
  4. 試行後、マウスを実験者の手に自発的に登らせ、もう一方の手で腕を覆い、迷路からマウスが迷路から飛び降りないようにして、マウスを腕に集めます。
  5. 6.4(慣れ段階1、約2分)で説明されているように迷路を掃除します。
  6. これを各マウスに対して1日2回、2日間順番に行います。
    注:この段階では、マウスはデイジーチェーン接続の行動を示すことがありますが、作業記憶タスクに追加の4つのアームエントリがこの動きを思いとどまらせる可能性があるため、心配する必要はありません。このステップでは、マウスは報酬を消費せずに腕の中で止まることができます。4日目には、マウスは3日目よりも訓練されているはずですが、それでも腕の真ん中で停止することができます。

8. 慣れ段階3 - 報酬(5日目〜6日目)

注:この段階は、マウスをステージ1と2の組み合わせの環境に慣れさせるためのものです。

  1. すべてのフードウェルに70μLの報酬を餌にします。
  2. ソフトウェアのスタート ボタンをクリックし、マウスを迷路の中央ハブに置いて、マウスの追跡とビデオ録画を開始します。
  3. マウスが少なくとも 1 回または 30 分経過するまで、離れた場所から PC モニターでマウスの動作を監視し続けます。ネズミが迷路から脱出しようとした場合は、慣れステージ 1 (6.2) で述べたように迅速に行動してください。
  4. 試練が終わったら、マウスを実験者の手に自発的に登らせ、もう一方の手で腕を覆い、迷路から飛び降りないようにして迷路から外す。
  5. 6.4(慣れ段階1)(約2分)で説明されているように迷路を掃除します。
  6. これを各マウスに対して1日2回、2日間行います。
    注:この段階では、迷路から脱出しようとするマウスを分析から取り除くのが最善です。

9. 作業記憶タスク - 報酬 (7 日目 - 15 日目)

  1. 40 μLの報酬ですべての腕を餌にします。各食べ物に報酬を中央ハブの近くによく配置して、ネズミが中央ハブから見えにくくします。
  2. ソフトウェアのスタートボタンをクリックしてマウスの追跡と記録を開始し、ストレスをかけずにマウスを迷路の中央ハブに置きます。
  3. 中央ハブに閉じ込められている 5 秒間は、迷路から離れてどこかに座ります。マウスの動作を監視し、マウスが迷路内を訪れる腕のシーケンスを書き留めます ( 補足ファイル 1 を参照)。
  4. マウスが 8 つの食べ物報酬をすべて収集したら、つまり作業記憶タスクの終了である腕訪問シーケンスの記録を停止し、さらに 4 つの腕を訪問させます。
    注:これを行うことで、マウスは捕まえるまでにもう少し時間を持つことができ、マウスは作業記憶タスクに集中できるようになります。このステップにより、マウスは一度集められた報酬が補充されないという事実を強化することもできます。
  5. 4回の腕の訪問の後、最後の腕の訪問の最後に、もう一方の手で腕を覆いながらマウスを手の上に登らせて、迷路からマウスを取り除きます。
    注:中央ハブでマウスを捕まえないことにより、マウスは、マウスが次にどのアームに行くかを決定する中央ハブに捕まえられることを関連付けません。マウスは、追加の腕の訪問を含むタスクに慣れると、最後の餌の井戸の近くを自由に移動したり、中央ハブでしばらく過ごすことができます。ただし、4 回の追加アーム訪問は 3 分以内に完了する必要があります。5分以内に食べ終わらない場合は、ホームケージに戻してください。
  6. 次のケージを選択すると、次の試行のケージをタップして覚醒レベルを調整します。
  7. 6.4(慣れ段階1)(約2分)で説明されているように迷路を掃除します。
  8. 次のマウスに移動し、これをマウスごとに順番に6回9日間繰り返します。
    注:マウスは、それ以上の報酬が利用できないとき、または新しい未訪問のアームがないことを認識することを学ぶため、後の試験で4回の追加アーム訪問の平均期間は長くなるはずです。

10. スコアリング

  1. 「毎日の成功率スコア」(%) = 4(ゴール) / (アームエントリー数[4+エラー]の合計数) x 100 を計算します。
    注: 強制走行後、報酬である目標で満たされるのは 4 本の腕だけです。マウスが強制走行で訪れた腕に入った場合は、それを 1 つのエラーとしてカウントし、フリー走行で繰り返される腕としてカウントします。
  2. 6回の試行で「完全試行率スコア」(%)を計算 = [(完全試行回数) / 6 ] x 100
    注: 満点は、作業記憶エラーがないことを意味します。
  3. ソフトウェアでマウスの速度、距離、加速度を選択して分析し、各日の平均を計算します。これらの分析から 4 回の余分なアーム訪問を除外してください。また、実験後にマウス追跡ビデオを確認して、4回の追加のアーム訪問の期間を測定します。
    注:マウスは腕に入った直後に素早く回転することができます。これは簡単な間違い修正であり、作業記憶が有効であることを意味します49 であるため、これをエントリとしてカウントして採点しないでください。ただし、マウスが腕の中点を横切ったり、腕に 3 秒以上留まったりする場合は、エントリを数えてスコアを獲得します。毎日の成功率スコアはマウスの学習曲線を示し、完璧な試行率スコアは作業記憶の保持効率を示します。

11. 統計

  1. 前回の出版物50で行われたように、対照とノックアウトマウス系統の違いを研究する場合は、以下に説明するように統計を実行します。
    1. 反復測定二元配置分散分析と事後分析 (ボンフェローニ検定など) [9 つの異なる時点で各被験者を測定] を使用して、対照群と実験群の結果データを比較します。
    2. グループを比較する場合は、各グループで少なくとも10匹、できれば~20匹のマウスを試験します。遺伝子操作、病変の作成、または薬物治療の効果が明らかな場合、サンプルサイズは小さくなって結論を出すことができます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、 MyRF cKOマウスと対照50を使用して、空間作業記憶タスクのパフォーマンスに新しいオリゴデンドロサイトとミエリン鞘が必要かどうかを尋ねた以前の出版物で使用されました。作業記憶タスクのパフォーマンスは、対照マウスでは改善されましたが、 MyRF cKOマウスでは改善されないことがわかりました。ワーキングメモリタスクは、野生型マウスのワーキングメモリ処理に関連する脳領域におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の増殖と分化、およびオリゴデンドロサイト(OL)の髄鞘形成を刺激および促進しました。また、空間作業記憶を評価するために、T 迷路報酬付き交互タスクも実行しました。このタスクは、 MyRF cKOマウスのワーキングメモリ欠損を検出するために実行されました。しかし、組織学的分析では、T迷路報酬交替タスクを行ったマウス群とホームケージ対照群との間で有意差は観察されませんでした。したがって、ここで提示されたプロトコルは、ワーキングメモリを研究するためのT迷路報酬付き交代タスクよりも効果的であると結論付けました。

各マウスは、作業記憶タスクを 1 日あたり 6 回試行し、合計 1 時間続きました。したがって、このプロトコルでは、コホートで最大8匹のマウスが可能になりました。慣れの初期には、マウスは迷路の腕の中で不均一な時間を過ごし、動きは遅かった。彼らは長い間腕の端にとどまりました。迷路での慣れの5日目が終わるまで、彼らは迷路の腕でさまざまな時間を過ごし、報酬に触れることなく中央ハブに戻ることができました(図3A)。しかし、6日目には、動物は8〜15分以内に少なくとも1回各アームに入り、各アームで同様の期間を過ごし、動物が迷路に慣れており、タスクの準備ができていることを示しました(図3A、6日目の下段および 図3B)。

慣れ段階では、彼らはしばしば後肢で立ち、腕や中央のハブから見上げました。作業記憶タスク中にも同様の動作が観察されましたが、必ずしも同じ方向に回るわけではありませんでした(たとえば、2 -> 3-> 5 -> 8 [時計回り]または8 -> 5 -> 3 ->2 [反時計回り])。彼らは方向を変えることができます(たとえば、5 -> 4 -> 6 -> 1)。個々のマウスには、腕の配列を選択する明らかな共同傾向はありませんでした。マウスは、フリーランで最初の報酬を受けた腕よりも、最後の報酬を受けた腕の選択に少し多くの時間を費やす傾向があります。これはおそらく、フリーランの最初の選択肢で選択できる選択肢が 4 つあり、最後の報酬には選択肢が 1 つしかなかったためでしょう。強制走行段階の最初のアームは、自由走行の開始の少なくとも50秒前(15 + 15 + 15 + 5)秒前にマウスに提示されました。したがって、この作業記憶タスクは、作業記憶エラーなしで実行するのはそれほど簡単ではありませんでした。 補足ビデオ1 は、作業記憶タスクトレーニングの8日目に完璧な試行を受けるマウスを示しています。

どちらのスコアリングシステムでも、9日間のRAMテスト期間の最初の3日間はパフォーマンスがほぼ横ばいでしたが、その後は著しく改善されたことがわかりました(図4A、B)。6日間の慣れと9日間の迷路トレーニングの後、雄のC57BL / 6マウスは、8日目から定期的に80%の毎日の成功率スコアを≥達成し、4/(4 + E)として定義され、Eはエラーの数です。フリーランの平均移動距離は時間の経過とともに短くなりましたが、平均速度と加速度は日ごとにほぼ一定でした(図4C-F)。マウスは、4回の追加アーム訪問中に捕まったという恐怖記憶を発達させた可能性があり、これがマウスが実験の終わりに向かってより多くの時間を費やした理由の1つである可能性があります(図4G)。

このプロトコルでは、慣れステップは6日間続き、動物施設で明暗サイクルが逆転していなくても、実験のために体内時計を調整する可能性があります。

figure-results-1
図1:RAMの仕様と機能。 (A)天井に取り付けられたCCDからの迷路と側面からの迷路の眺め、および寸法。(B)餌井戸は、マウスが>10cm離れたところから中身が見えないように、迷路の床の高さから1.5cm下に沈めました。(C) 迷路アリーナの設定。中央のハブとアーム1〜8が示されています。(D) 実験室の概略図と、部屋の写真による外部の視覚的手がかり。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:迷路制御プログラムのフロー図。 (A)慣れ段階1(1日目と2日目)。(B) 慣れ段階 2 (3 日目と 4 日目)。(C) 慣れ段階 3 (5 日目と 6 日目)。(D) 作業記憶タスク (7 日目から 15 日目)。(E)ワーキングメモリタスクパラダイムのスキーマ。マウスは、疑似ランダムに選択された 4 つの強制ラン アームを通過し、中央ハブに 5 秒間閉じ込められ、その後、残りの報酬を集めるためにフリーランに行きました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:6日間の習慣化中のヒートマップとツバメの巣マップ。 (A)3匹のマウスの慣れ1〜6日目のマウスの軌跡のヒートマップ。慣れ3〜6日目に、マウスは1日2回の試験を受けました。上のヒートマップは最初の試行を示し、下のヒートマップは 2 番目の試行を示しています。(B)慣れ6日目の鳥の巣の地図。上の3つはマウス1、2、および3の最初の試行を示し、下の3つは2番目の試行を示しています。下の表は、同じ3匹のマウスの試用期間を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:RAMワーキングメモリタスク。 (A) [4/(フリーラン中のアームエントリー数) x 100] で計算された 1 日平均成功率スコア (%)。6つの試行のスコアがその日の平均化されました。(B) タスクの 9 日間にわたる完全なトライアル スコア。(C)個々の移動距離と平均。(D)タスク中のマウスの個々の走行速度と平均。(E)マウスの個々の加速度と平均。(F)マウスの個々の減速と平均。(G) 追加の 4 回のアーム訪問の個人および平均期間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:マウスは、作業記憶タスクトレーニングの8日目に完璧な試験を受けます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:記録シートの例。マウスの動作を観察しながら、腕の訪問のシーケンスを書き留めます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RAMのワーキングメモリのトレーニングとテスト
ワーキングメモリは、限られた量の情報を短時間保持できる認知プロセスであり、精神的タスクの計画と実行に操作および使用されます。例としては、遠隔地のドアの入り口コードを記憶したり、特定の目的地への経路を記憶したりすることが挙げられます。デュアル N バック タスクと空間スパン タスクは、一般的に使用される視空間作業記憶タスクであり、人間の被験者に刺激の位置、同一性、および時間的順序を記憶するように求められます。Takeuchiらは、MRIを用いた研究で、デュアルNバックタスクを含むヒトの作業記憶タスクの成功におけるトレーニングの量が、脳梁の体の前部における分数異方性の増加と相関していることを発見しました51。以前の研究50では、この論文で説明されているプロトコルを使用して、前脳梁および注意に関与していると考えられている前帯状皮質を含む、ワーキングメモリ処理に関与していると考えられている他の脳領域で髄鞘形成乏突起膠細胞が増加することを発見しました。オリゴデンドロサイトの増加は、作業記憶タスクのパフォーマンスと密接に相関しており、これはTakeuchiら50,51,52によるヒトでの研究と一致しています。しかし、人間とマウスの心理的プロセスに類似点があるかどうか(電気生理学など)を研究することはまだ必要です。作業記憶は注意力と密接に関係しています。それは人間の「流動的知能」の尺度と相関しており、学習に重要であるため、研究することが重要です。オルトンとサミュエルソンは、ラットの空間記憶を訓練および評価するための8アーム放射状迷路(RAM)タスクについて説明しました20。自由選択実験では、すべての迷路アームに0.1gのラットチャウを提供しましたが、テスト中は補充されませんでした。そのため、1回のテストで8つの報酬しか得られませんでした。すべての腕が開いており、実験中、ラットはすべての腕にすぐにアクセスできました。食物の報酬が補充されなかったため、ラットは作業が終了する前にできるだけ多くの報酬を回復するために、以前に訪問した腕を再訪しないように作業記憶を使用しなければなりませんでした。各ラットは開始時に中央ハブに配置され、16 の腕の選択が行われるか 10 分が経過するまで、餌の報酬を回復するために、任意の腕に自由に入ることができました。最初の8つの選択肢の中でラットが訪れた異なるアームの数を数えたところ、すべてのラットが10日以内に平均7つ以上の異なるアームを選択したことがわかりました20。マウスで同様のプロトコルを試したところ、マウスはラットとは異なり、数日間デイジーチェーン接続を示し、その後戦略を変更しなかったため、作業記憶を評価する目的を回避していることがわかりました。したがって、マウスは腕の訪問の合間に中央ハブに閉じ込められ、中央ハブに閉じ込めることでデイジーチェーン接続の行動が防止されることを期待しました。

オルトンらは、ラットを中央ハブに1分間または15秒間閉じ込めて、一連の選択を妨害しました。これにより、迷路の周りを時計回りまたは反時計回りに連続的に進むという通常の傾向を採用することができなくなりました20,53。いずれかのアームの選択がランダムで、等しく、以前の選択から完全に独立している場合、実験は古典的な「占有問題」20の一例であるため、最初の8回の連続したアーム訪問内でn個の異なるアームを選択する確率p(n,8)は、p(1,8)=4.8x10-7、p(2,8)=4.2x10-4、p(3,8)=0.019、 p(4,8)=0.17、p(5,8)=0.42、p(6,8)=0.32、p(7,8)=0.067、p(8,8)=0.0024。これらの確率から、異なるアームを選択する平均確率は 8 つのうち 5.3 (期待値 = figure-discussion-1 = 5.25; 5.3/8= 66%) であると計算できます。Oltonらは、10日間のトレーニング期間にわたって、ラットは1〜5日目に平均5.7/8の異なるアーム(71%;範囲:4.2〜6.6)に入り、6〜10日目の間に7.6/8の異なるアーム(95%;範囲:7.2〜8.0)に増加し、これは偶然よりも有意に高いと報告しました。これは、ラットが食物が枯渇した腕を避けるために作業記憶を使用していることを示しました。マウスでも同様のアプローチを試み、腕の訪問の間に5秒間、マウスを中央ハブに閉じ込めました。マウスは、1〜5日目(71%;範囲:5.2〜5.8;11匹のC57BL/6マウス)にわたって8群試験あたり平均5.7/8の異なる群に入り、6〜10日目には5.9/8群(74%;範囲:5.7〜6.5;11匹のC57BL/6マウス)に入った。したがって、マウスは、実験の10日間に、報酬発見のパフォーマンスを偶然レベルを大幅に上回って改善することを学習できなかったか、非常にゆっくりと学習しました。したがって、上記のプロトコルはマウスには適さないと考えられ、代わりに、Sasakiらがラットに記述したものと同様の「強制走行/自由走行」パラダイムを選択しました27

Sasakiら27のプロトコルでは、実験の開始時にすべてのアームが餌にされ、報酬は補充されず、各ラットは最初にオープンハイド8アームRAMの中央ハブに閉じ込められていました。次に、事前に選択された 4 つの腕のそれぞれに、一度に 1 つの腕に解放され、腕の訪問の間に腕と中央ハブに閉じ込められませんでした (「強制ラン」)。4回目の腕の訪問の後、ネズミは中央ハブに戻り、すべてのドアがすぐに開かれ、ネズミが自由にすべての腕を訪問できるようにしました(「フリーラン」)。フリーラン中に最も効率的な方法で残りのすべての食べ物の報酬を集めるために、動物は強制ランまたはフリーランですでに訪れた腕を覚えて避ける必要があります。マウスで非常によく似たアプローチ(図2E)を使用しました。佐々木ら27の毎日のRAMトレーニングの開始時の10分間の慣れ期間は、トレーニング前の1回の6日間の慣れ期間に置き換えられました。加えられた別の変更は、すべての報酬が回収された後、マウスが各試験の終わりにさらに4回の腕を訪問できるようにすることでした。これは、以前に訪問した武器には報酬が補充されないという事実を強化することを目的としていました。また、マウスは「後悔を避ける」ことを学ぶので54,55、そのような行動は、その後の試験を開始する直前の4回の追加アーム訪問中に報われないため、次の試験でデイジーチェーン行動を思いとどまらせる可能性があります。追加の4回の腕訪問のもう一つの理由は、マウスがすべての報酬の回復の成功を、タスクの最後に実験者に捕まる恐ろしい経験と関連付けるのを防ぐためでした。マウスは、4回の追加アーム訪問中に捕らえられたときに恐怖記憶を発達させた可能性があり、それが実験の終わりに向かってより多くの時間を費やした理由の1つである可能性があります(図4G)。実際、マウスは、試験でそれを行った場合、追加の4回の腕訪問中にデイジーチェーン行動を壊しました。さらに、マウスは強制走行中に各腕に15秒間閉じ込められ、その後中央ハブに5秒間閉じ込められ、その後すべてのドアを開けて自由走行を開始した。マウスを中央ハブに閉じ込めずに、マウスは上記のようにデイジーチェーン接続を行う傾向がありました。

強制実行では、隣接するアームが3つ以下を含む5つの4アーム擬似ランダムシーケンスのセットから選択しました。これらは、(1,3,5,7)、(2,4,5,8)、(1,4,5,7)、(2,3,4,7)、(1,2,5,6)、およびさまざまな腕の順序と回転のバリエーションであり、上から時計回りに1〜8の腕に番号が付けられました(図1C)。コホート内の各マウスは、RAM テストの 9 日間の慣れ後段階で、1 日あたり 6 回の試験 (1 回の試験 = 強制走行 + 中央ハブでの 5 秒の監禁 + 自由走行) を受けました。フリーラン中、マウスが強制ラン後に残った4つの報酬をすべて回収するために腕を4回だけ訪問した場合、それは「完璧な試練」と呼ばれました。9日間のトレーニング中のパフォーマンスは、4/(4+E)として計算された「毎日の成功率スコア」によって定量化され、ここでEはフリーラン中のエラーの数、または「完璧な試行」であった試行の割合です(つまり、E = 0)。たとえば、マウスがフリーラン中に残りの 4 つの報酬を取得するために 7 回のアーム訪問が必要だった場合、「毎日の成功率スコア」は 4/7 = 0.57 または 57% となり、完璧な試行はこのスケールで 100% のスコアを獲得します。マウスが当日に5回の完全試験を行った場合、完全試験比スコアは5/6 = 83.3%になります。

デイジーチェーン接続によって達成された毎日の成功率スコアは、マウスがRAMの8つのアームのいずれかでランダムにフリーランを開始すると仮定して、採用された4アーム強制ランパターンのそれぞれについて手動で計算されました(前の段落)。デイジーチェーン接続によって達成できる多くの試験の平均スコアは、個々の強制ランアームパターンで53%から56%、またはアームパターン全体で~55%です。デイジーチェーン接続によって満点(100%)を得る確率はゼロであり、マウスが出たばかりの腕に戻らないと仮定すると、ランダムな腕訪問による満点(100%)は<1%(4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0.87%)です。したがって、9日間のテスト期間の最後の2日間にマウスが到達した平均1日の成功率スコア(>80%)および完全試験スコアの割合(>60%)は、ワーキングメモリベースの戦略を使用してのみ一貫して達成できました。

タスクに精通しているマウスは、すべての報酬を消費した後、最後の餌の井戸、または中央ハブで徘徊する傾向があり、また、タスクの終わりに余分な4つの腕の訪問により多くの時間を費やす傾向があり(図4G)、各腕には1つだけの報酬が含まれているという「ルール」を学んだことを示唆しています。 また、利用可能なすべての武器を訪問したという事実を追跡することもできました。ここで使用したもの(C57BL / 6)とは異なる遺伝的背景のマウスの場合、行動実験56,57,58では遺伝的背景が重要であるため、結果が異なる可能性があります。しかし、以前の研究50では、C57BL/6、CBA、129P2バックグラウンドが混合されているが、C57BL/6Jマウスとバッククロスしたマウスを使用して、ここで説明するプロトコルを使用して作業記憶タスクのパフォーマンスが大幅に向上し、フリーラン中にデイジーチェーン接続に頼るマウスが少なくなることがわかりました。Koikeら59は、129のマウス近交系亜株すべてが、Disc-1のエクソン6の25 bp欠失からなるDisc-1欠失多型を保有し、DISC-1タンパク質のフレームシフトと切り捨てを引き起こし、その機能に影響を与えることを報告しました60,61。この変異は、別の食欲をそそるウィンシフト迷路タスクであるT迷路遅延交代タスク59で研究したときに作業記憶障害を引き起こし、以前の研究50で使用された対照マウスが近交系C57BL / 6マウスよりも作業記憶スコアがわずかに低かった理由を説明している可能性があります。私たちは、体重を85%から90%に維持することが困難にならないように、年齢と株の正常体重範囲内に収まるマウスを常に使用しています。同腹児のサイズは、NMRI62 と呼ばれる系統での幼少期の過剰摂取により、空間記憶や不安のような行動に影響を与える可能性があります。同腹児数が小さいと、NMRIとC57BL/6マウス系統の両方で過剰摂食と体重増加を引き起こします。ただし、2 つの系統は空間学習タスクの解決方法が異なっていました。C57BL/6マウスは小型と対照同腹児数に差を示さなかったが、NMRIマウスはモリス水迷路(MWM)テストによる学習段階で有意な障害を示し、Y迷路自発的交代タスクでは有意ではなかったがわずかな障害を示した。さらに、NMRI 株の MWM および Y 迷路試験後、同腹児サイズが小さいと海馬脳由来神経栄養因子 (BDNF) のタンパク質レベルが有意に低下し、海馬インターロイキン-1b (IL-1b) のタンパク質含有量が増加しました。ただし、これらの変化はC57BL/6株では観察されませんでした。マウスのNMRI株は、小さな同腹児数で飼育された場合、不安様行動とストレス誘発性コルチコステロンレベルの有意な増加を示しました。対照的に、C57BL/6 株の同腹児数が小さいため、不安様行動とコルチコステロン レベルの両方が低下しました。したがって、行動実験を設計する際には、マウス系統の同腹児数を考慮することが重要です。

ラットとマウスの行動の違い
ほとんどの認知タスクはもともとラット用に設計されていました。また、空間学習/記憶はラットで広く研究されています。マウスに対する今日のトランスジェニックおよびゲノム改変技術の利点により、研究者はラット用に考案されたプロトコルをマウスに適用することがよくあります。しかし、ラットとマウスの間には一貫した行動の違いがあります3,4,5,6,7。たとえば、好みの違い(ラットによる社会的好みとマウスによる食物の好み)3があり、さまざまな迷路タスク(水または陸の迷路)を交渉するために異なる戦略を使用します4。また、マウスは8アームRAMで良好な空間学習スコアを達成するまでに時間がかかる傾向があり4,8,9であり、これがマウスが一般に空間学習タスクにおいてラットよりも劣っていると見なされる理由の1つです。

ラットとマウスは、ストレスや恐怖の管理に対する反応など、一般的な行動/性格も異なります3,4,5,6,7,10。たとえば、以前の研究では、思春期のマウス11、12、13、14では恐怖の消滅学習が不十分であることがわかりましたが、ラットでは15、16、17、18では見られませんでした。さらに、マウスはラットと比較してストレスを感じやすく、扱われることを好まないため、ラットは取り扱いに慣れていると、どうやらハンドラーにくすぐられることを楽しみ、より多くのくすぐりのためにハンドラーと対話しようとします19。したがって、恐怖管理はマウスの行動を研究する際に考慮すべき重要な要素です。さらに、Borrowら63は、慢性的な変動ストレスがオキシトシンmRNAを減少させ、傍脳室核のオキシトシンニューロンの体細胞量を増加させることを報告しています。さらに、最近の研究では、トンネルハンドリングがストレスを軽減し、行動実験のパフォーマンスを向上させることができることが示されています38,39,40。したがって、行動実験中または行動実験前にマウスにストレスを与えないようにすることが重要です。

マウスは、例えばオープンフィールドテストや高架プラス迷路など、屋外で露出されることを好みず、より密閉された暗い場所を好みます64,65。RAM のコンテキストでは、中央ハブは最もオープンなスペースであり、マウスが次にどのアームにアクセスするかを決定するのはそこからです。中央ハブで不安を感じている場合、タスクから気が散り、標準以下のパフォーマンスを発揮する可能性があります。このため、マウスがハブを恐怖体験と関連付けないように、中央ハブではなく放射状の腕の1つ(手順部分を参照)でマウスを捕まえることにしました。

食物の報酬のために8アームRAMを探索するとき、特定の腕から出てくるラットは、次の腕の訪問のために直角に回転する傾向があり、介在するアームをスキップし、順番に腕を訪問することはめったにありません(「デイジーチェーン」と呼んでいます)。つまり、ラットは1,2,3,4 20,53,66ではなく、1,3,5,7の順に訪れる傾向があります。対照的に、マウスはおそらく体の大きさと柔軟性のためにデイジーチェーン戦略を採用することがよくあります。デイジーチェーン戦略は、マウスが食物報酬を回復するためのかなり費用対効果の高い方法ですが、実験の目的を回避するため、空間作業記憶をテストしようとする実験者にとってはかなりの欠点です67。ただし、ストレスへの曝露は学習能力に影響を与え、学習戦略を変える可能性があります68。デイジーチェーン接続アプローチはストレスを示している可能性があるため、マウスがストレスを受けていないことを確認することが重要です。マウスはデイジーチェーン戦略を使用しないため、現在のプロトコルは作業記憶タスク中のマウスにとってストレスがないと説明しています。

マウスは迷路をナビゲートする際に、近位の視覚的手がかりよりも遠位の視覚的手がかりに依存することが知られています48,69,70。紙片に印刷され、すべての腕の後壁に配置された追加の近位視覚的手がかりを組み込んでも、そのような行動は減少しないことがわかり、これはラットに対するOltonらの主張と一致しています20。しかし、迷路内の手がかりとしてゴールアームにビーコンを配置することは、1つの実験71で6アーム放射状迷路参照記憶および作業記憶テストのタスクを解決する上で、マウスが迷路外の手がかりよりも役立った。さらに、マウス系統が異なれば視覚能力も異なる72が、バーンズ迷路でテストされた視覚空間学習能力と記憶は必ずしも視覚能力を反映しているわけではなく、BALB/cなどの視覚能力の低いマウスは、異なる脳プロセスに依存している可能性があることを示唆している。したがって、実験者は、実験に最適な手がかりを使用するかどうかを検討する必要があります。

取り扱い中のマウスの不安の軽減
ストレスの取り扱いは、動物に生理学的および行動的に影響を与えることがよく知られています 73,74,75,76,77。また、Sandiらは、最後の学習試験とプローブテストの間に雌猫をストレッサーとして使用して、海馬依存性の水迷路タスクでラットをテストすることにより、急性ストレスによって引き起こされる空間記憶障害が海馬および前頭前野における神経細胞接着分子(NCAM)の発現の低下と関連していることを実証しました78海馬と前頭前野が高レベルのストレスに対して脆弱であることを示唆しています。したがって、動物実験内および動物実験間の原因不明の変動を避けるために、実験動物のストレス/不安を軽減することが重要です。特に作業記憶タスクでは、動物がタスク中に集中する必要があるため、不必要な気晴らしは避ける必要があります。ラットの作業記憶、または作業記憶と参照記憶を一緒にテストするための公開されたプロトコルには、実験者がタスクの最後に動物を迷路から、いつ、どこからどのように取り除くかなどの重要な詳細が含まれていないことがよくあります。マウスはハンドラーを持つラットよりも社交性が低く、ストレスを受けやすいため、マウスを使った実験ではそのような詳細がより重要です。げっ歯類は、時間、場所、および関連する感情の記憶を含む明示的な長期記憶の一形態であるエピソード記憶を発達させる可能性があります79,80,81。そのため、マウスがRAMですべての食料報酬を集めた直後に迷路からネズミを取り除くのではなく、食料報酬を獲得せずにその後4回の腕訪問を許可しました。これは、マウスがすべての報酬の回復の成功を、特にRAMでの学習の初期段階にとって重要な実験者に捕まる恐ろしい経験と関連付けるのを防ぐために行われました。さらに、追加の4回の報酬のない腕の訪問は、マウスが以前に訪問した腕に食べ物の報酬が補充されないという事実を強化する可能性があります。マウスにとって取り扱いがそれほどストレスがかからない場合、マウスは実験者とより頻繁に対話します38。ストレスを避けるために、実験38のためにグループ化されたケージから分離されたときに提供されたホームケージ内の紙管を使用して、RAM実験の開始時にマウスをホームケージから持ち上げるか、実験前にホームケージでマウスを扱うとき、およびホームケージから迷路に連れて行くときに、マウスが実験者の手に自発的に登るようにします。実験の最後に迷路からネズミを回収するときは、迷路の中で追いかけるのではなく、片手で迷路アームの入り口を塞いでマウスが自発的に上がるようにし、もう一方の手で迷路アームを覆い、マウスが迷路の外に飛び出さないようにする。これにより、迷路で追われたり、尾に捕まったりするストレスが軽減されます。男性の実験者は、マウスが関係する女性の実験者よりもストレスを誘発することがあります82。しかし、ここで説明するストレス軽減手順に注意を払うことで、男性の実験者は大きな問題なくRAMテストを実施できることがわかりました。したがって、マウスの扱い方がより重要です。

性差
異なる種(げっ歯類とヒト)で観察される認知、学習、記憶における性別のさまざまな影響と、ストレス対処反応がオスとメスで異なるため、ここで報告された実験では雄のマウスのみが使用されています63,83,84,85,86,87.ただし、げっ歯類で得られた結果を人間にとっての利益の可能性について解釈する場合、男女を研究することが重要です。NIHやその他の資金提供評議会のガイドラインでも、オスとメスの両方の動物を使用することが推奨されています。

プロトコルの利点
当社の半自動 8 アーム ラジアル迷路は、不透明な白いアクリルの壁があるが蓋のない密閉された迷路です (寸法については 図 1A を参照)。迷路をナビゲートしている間、マウスは実験者を見ることができず、透明な壁や開いて高い腕を持つ迷路では気を散らす可能性がありますが、迷路の上の遠位の迷路外の視覚的手がかりを見ることができます( 図1を参照)。さらに、このプロトコルは、迷路の上に配線がなく、マウスが効率的にタスクを学習できるため、原則としてリアルタイム の in vivo イメージングおよび電気生理学に適用できます。

今後の方向性
現在のプロトコルは、慣れから作業記憶タスクの終了まで 15 日間です。週末は休憩なしでプロトコルを実行しました。ただし、6日間の慣れの後に週末の休暇を取っても、次の9日間の作業記憶タスクに大きな影響を与えることはありません。9日間の作業記憶タスク中に週末の休憩を取ると、マウスの学習が遅くなる可能性があります。したがって、マウスの取り扱いについて十分な訓練を受けた2人の実験者がいると、マウスの学習を遅らせることなく実験者のストレスを軽減できる可能性があります。 図4A、Bによると、マウスは4日目以降に平均して複数の完璧な試験を達成するため、最初の3日間は非常に重要です。したがって、最初の3日間は休憩を避けることをお勧めします。作業記憶タスクが関心のあるマウスにとって簡単すぎる場合は、強制実行後の閉じ込め時間を増やす必要があるかもしれません。これらは個々のケースに合わせて調整する必要があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

有益な議論をしてくれたウルフソン生物医学研究所の同僚と、マウスの行動に関するアドバイスと論文の初期草案のレビューを提供してくれたDavid Bannerman(オックスフォード大学)に感謝します。また、技術および管理上のサポートを提供してくれたMatthew Gristにも感謝します。この研究は、ウェルカム トラスト [108726/Z/15/Z および 214286/Z/18/Z] とジェラルド チョア神経科学研究所 [PJ8425013] から資金提供を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
動脈鉗子またはペンチ任意のN/A標準的なチャウを切断するため
C57BL/6J マウスクソン研究所生後 2~3 か月
コンデンスミルク (カーネーション)ネスレN/Aタスクの報酬として使用
蒸留水任意のN/Aデンスミルクの洗浄と希釈剤
EthovisionXT13 ノルダスN/A迷路のドアとトラッキングマウスを制御
- マルチボディポイントモジュールノルダスN/Aマルチボディポイントトラッキング用
- トライアル&ハードウェア制御モジュールNoldusN/Aトライアル用 &ハードウェア制御
-- I/OボックスNoldusN/A迷路のドアを制御する
Extramazeの視覚的手がかり任意のN/Aマウスによる迷路のマッピングの場合
高解像度カメラTracksysN/Aマウスの追跡と撮影の場合
ペイントブラシ任意のN/A掃除用
紙トンネル任意のN/Aマウスの取り扱いの場合
ペーパーイグルー任意のN / Aスト用 ネスト用
ペーパーネスティングストライプ任意のN / Aネスティング用
ピペットマンP1000 ギルソンF144059M希釈したコンデンスミルクをホームケージに供給するため
ピペットチップ P1000任意のピ
ペットマン P200ギルソンF144058M迷路を餌にするため
ピペットチップ P200任意のラ
ジアルアーム迷路トラックシスN/Aカスタムメイド
ルームランプ任意N/A偶数の場合迷路の照明
小さなプラスチックカップ任意のN/A釈したコンデンスミルクをホームケージに提供するため
ホワイトノイズ用スピーカー任意のN/Aホワイトノイズを再生するため
標準食 任意のN/A食事制限
ッシュペーパー任意のN/Aリーニング用
ベリフォーカルレンズTracksysN/A5-50 mm、マニュアルフォーカス、手動アイリス
木製バイトブロック任意N/Aティング用
50 ml 遠心分離管FalconFalcon™ 352070コンデンスミルクと蒸留水を混合するため (1:1)
ジャ000664 コンネ 希ティ ク ネス

参考文献

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