TD Drive:行動および睡眠ラットにおけるマルチエリア電気生理学的記録のためのパラメトリックなオープンソースインプラント

サマリー

ここでは、現在最大10の分布した脳領域に同時に対称的な両側ワイヤー電極記録が可能なTD Driveという、ラット用のユニークな3Dプリント可能なインプラントを紹介します。

要約

複数の脳領域間の複雑な相互作用は、脳に起因するほとんどの機能の根底にあります。学習のプロセスと、記憶の形成と統合は、脳全体の機能的接続性に大きく依存する2つの例です。さらに、半球の類似性や相違点を調査することは、これらのマルチエリア相互作用と密接に関連しています。したがって、これらの複雑なプロセスをさらに解明しようとする電気生理学的研究は、複数の場所で同時に、そしてしばしば二国間で脳活動を記録することに依存しています。ここで紹介するのは、TD Driveと名付けられたラット用の3Dプリント可能なインプラントで、対称的な両側のワイヤー電極記録が可能で、現在、最大10の分布した脳領域に同時に配置されています。オープンソースの設計は、パラメトリック設計の原則を使用して作成されており、見込みユーザーは、記録電極位置の前後座標や中外側座標などの高レベルのパラメータを調整するだけで、ドライブ設計をニーズに合わせて簡単に適応させることができます。インプラントの設計は、さまざまなタスクを実行したn = 20匹のLister Hoodedラットで検証されました。このインプラントは、テザー睡眠記録とオープンフィールド記録(オブジェクト探索)だけでなく、2つの異なる商用録音システムとヘッドステージを使用した大きな迷路での無線録音にも対応していました。したがって、ここでは、新しい電気生理学的インプラントの適応可能な設計と組み立てを示し、迅速な準備と埋め込みを容易にします。

概要

覚醒と睡眠の間の脳の相互作用は多領域性であるため、進行中の生理学的プロセスを徹底的に研究することは困難です。機能的MRI(fMRI)や機能的超音波(fUS)などのアプローチでは、脳全体から脳活動をサンプリングすることができます^が1,2、神経血管結合を利用して血行動態活動から脳活動を推測するため、時間分解能^{が制限されます2}。また、fMRIでは、研究対象をMRIスキャナーにセットする必要があり、自由に動く動物での実験は禁止されています。単一光子または多光子イメージングによるカルシウムダイナミクスの光学イメージングにより、数百のニューロンの細胞種特異的な同時記録が可能になります³。しかし、Miniscope³のようなヘッドマウント顕微鏡は、自由に動く行動を可能にしますが、通常は無傷の脳⁴の表面皮質領域をイメージングすることに限定されています。皮質上の視野の直径は1mm程度ですが、これらのヘッドマウント顕微鏡のスペース要件により、特に隣接する領域を対象とすることが難しくなる可能性があります。したがって、覚醒時と睡眠時のマルチエリアの脳ダイナミクスを正確に捉えるためには、関心のある脳領域に電極を埋め込んで記録する細胞外電気生理学が、その高い時間分解能と^{空間精度5}から選択可能な方法の1つである。さらに、ヒト脳波から得られた分析と互換性のある動物の睡眠ダイナミクスの特性評価を可能にし、この方法の並進価値を高めます⁶。

従来、細胞外電極を用いて脳活動を記録する研究では、四極管⁷などの個々のワイヤー電極または電極束が用いられてきた。Neuropixelsプローブ⁸ などの最先端のプローブは、動物を損なうことなくその軸に沿ってプローブを移植できる軸上に整列していることを考えると、複数の領域を同時に標的にすることができます。しかし、空間的に離れた複数のエリアを正確に同時録音することは、既存の方法が高価であったり、時間がかかったりするなど、依然として課題となっています。

近年、光造形法などの積層造形法が広く利用されるようになりました。これにより、研究者は、^{例えば、複数の}脳領域の反復可能なターゲティングを簡素化するなど、実験要件9に適応可能な新しい電極インプラントを開発することができました。多くの場合、これらのインプラント設計はオープンソースのハードウェアとして学術コミュニティと共有され、他の研究者が自分の目的に適合させることができます。特定のインプラントの適応性の程度は、インプラントの設計方法と共有方法の両方の結果として異なります。パラメトリックモデリング¹⁰ は、コンピュータ支援設計の一般的なアプローチであり、設計のさまざまなコンポーネントが相互に依存するパラメータと定義された設計履歴によってリンクされます。インプラントの設計にパラメトリックなアプローチを実装すると、個々のパラメータを変更すると、設計の複雑な再モデリングを必要とせずに完全な設計が自動的に更新されるため、インプラントの再利用性と適応性が向上します¹⁰。その結果、デザイン自体が、パラメトリックな関係とデザイン履歴を保持する編集可能な形式で共有される必要があります。STL や STEP など、ジオメトリ プリミティブのみを表すファイル形式では、パブリッシュされたモデルの後続のパラメトリック修正は実行不可能になります。

四極管ハイパードライブ11,12,13は数十の四極管からの録音を可能にしますが、その組み立てと埋め込みには時間がかかり、その品質は個々の研究者のスキルと経験に大きく依存します。さらに、通常、記録電極を目標位置に向けるガイドチューブを1つまたは2つの大きな束にまとめるため、効率的にターゲットを絞ることができる領域の数と広がりが制限されます。

他のインプラント^14,15は、完全な頭蓋骨を露出させ、記録電極を運ぶ複数の個別のマイクロドライブの自由な配置を可能にする。手術時間中に独立したマイクロドライブ¹⁶を配置すると、柔軟性が最大化されるが、手術時間が長くなり、個々のマイクロドライブのスペース要件のために複数の隣接領域を標的とすることが困難になる可能性がある。また、インプラントはオープンソースですが、STLファイルとしてのみ公開されているため、修正が困難です。

より固有のパラメトリック哲学を持つドライブの例は、RatHat¹⁷です。頭蓋骨の背側全体を覆う外科用ステンシルを提供することで、手術中に定位フレームを使用せずに、複数の脳ターゲットを正確にターゲティングすることができます。カニューレ、オプトロード、または四極筋用の複数のインプラントバリエーションが利用可能です。ただし、ドライブは学術目的で無料で使用できますが、オープンソースでは公開されていないため、研究者がインプラントを評価して使用するのはハードルが高くなります。

本稿では、ラットの細胞外電極記録用の新しい3Dプリント可能なインプラントであるTD Drive( 図1参照)を紹介します。TD Driveは、既存のソリューションの欠点を克服することを目的としています:それは、独立したワイヤー電極で、両方の半球にミラーリングされた複数の脳領域を同時にターゲットにすることができます。シンプルなデザインのため、経験の浅い研究者でも比較的低コストで数時間で組み立てることができます。TD Driveはオープンソースで公開されており、研究者が特定のニーズに合わせて調整できるように、簡単に変更できるファイル形式で公開されています。TD Driveの設計プロセスの初期段階からパラメトリック3Dモデリングアプローチを取り入れることで、変更が必要なパラメータを抽象化することができます:ターゲットの位置を変更するために、研究者はドライブ自体を再設計することなく、背腹座標と前後座標を表すパラメータを簡単に編集することができます。TDドライブを変更および製造するためのファイルは、 https://github.com/3Dneuro/TD_Drive にあります。

図1:TDドライブの概要(A)保護キャップ付きのTDドライブのレンダリング。(B)内部パーツが示されたレンダリング。TD Driveは、(a)固定および可動電極線用の複数のパラメトリックに調整可能な記録位置、(b)一般的なテザーおよびワイヤレスデータ収集システムと互換性のある高密度Omneticsコネクタを備えたEIB、および(c)Intan/Open Ephysシステムでの記録に最適化された直感的なチャネルマッピング(補足図1を参照)および(d)テザー録音中およびヘッドステージが接続されていないときにインプラントを保護するためのキャップ。(C)TDドライブの下部にあるガイドステンシルは、ガイドカニューレの配置を容易にし、手術中のインプラント位置の冗長な検証として機能します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

インプラントの設計は、n = 4で試験的に行われ、n = 8で検証され、異なるタスクを実行したn = 8のLister Hoodedラットで確認されました。最初の4匹は、ドライブの開発とパラメータの調整に使用されました。その後、8匹の動物でフルパイロットを実行しました(結果を参照)。8匹の動物の第2コホートを実行し、インプラント生存分析に含めました。このインプラントは、テザー睡眠記録とオープンフィールド記録(オブジェクト探索)だけでなく、2つの異なる商用記録システムとヘッドステージを使用した大きな迷路(HexMaze 9 m x 5 m)での無線記録にも対応していました。8人の2つのコホートは、長時間の睡眠記録用にテザー接続され、大規模な迷路探索記録用にワイヤレス化された2つの異なる取得システムで記録されました。この単純なワイヤードライブにより、経験の浅い研究者による大規模なコホートでの長期にわたる実験が可能になり、睡眠段階の分析や複数の脳領域での振動分析が可能になると結論付けることができます。これは、これまでのほとんどの電気生理学インプラントとは対照的であり、困難と時間の集中性のために、より小さな動物のコホートを可能にし、通常は非常に経験豊富な実験者を必要とします。ただし、このドライブでは、個々のニューロンの活動を記録することはできません。したがって、使用は局所電界電位(LFP)および総和活動の調査に限定されます。

プロトコル

本研究は、オランダ中央委員会(CCD)によって承認され、動物実験法(プロトコルコード:2020-0020-006および2020-0020-010)に従って実施されました。到着時に9〜12週のオスのLister Hoodedラットを使用しました。プロトコールで使用される試薬と機器は、 材料表に記載されています。ドライブ構築プロセスの手順については、 補足図 1 および 補足図 2 を参照してください。

1. 3Dモデルと電極インターフェースボード(EIB)データの調整と作成

1. Autodesk Fusion でドライブ本体の設計を開きます。[変更] タブの [パラメータの変更] をクリックします。最初の記録位置の座標を調整するには、前後座標を anteroPosteriorSite1 に、中外側座標を medioLateralSite1 に入力します。ガイドチューブや電極の穴の径は、diameterSite1を調整することで調整できます。記録位置2と3についても繰り返して、モデル設計が自動的に調整されます。
   注: 現在のプロトコルに使用される 3 つの場所は、移動可能なワイヤ バンドルを含む海馬 (HPC) と、固定ワイヤ バンドルを持つ前頭前野 (PFC) および脾臓後 (RSC) 皮質です (PFC ワイヤ バンドルは、前辺縁系 (PRL) と前帯状回 (ACC) の両方の皮質を標的とします)。 表1 は、記録サイトの中側座標を制御するパラメータに手動で課せられた制限を示しています。
2. 更新されたドライブ本体をブラウザで右クリックし、[ Save As Mesh] を選択してエクスポートします。 STL(バイナリ)、単位 mm、リファイン メントハイのタイプを選択します。
3. 通常のキャップ用に準備された STL ファイルを選択するか、必要に応じて (たとえば、ターゲットが非常に横方向の場合) ラージ キャップ用に準備された STL ファイルを選択します。
4. どちらのキャップを選択するかに応じて、生産用の通常のEIBまたは大きなEIBのいずれかを選択します。両方のEIBのガーバープロダクションファイルは、製造サービスに直接送信できるzipアーカイブとして提供されます。

2. 3DモデルのプリントとEIBの製作

注:本研究では、市販の3Dプリンターを使用して部品を製造しました( 材料の表を参照)。異なるプリンターを使用したり、生産を外部に委託したりする場合、部品の製造には異なる同等の樹脂を使用する必要がある場合があります。

1. 光^造形9 を使用して、層高25μmのレギュラー樹脂または生体適合性樹脂(透明、黒、白樹脂など)に高分解能でドライブ本体とシャトルをプリントします。キャップのパーツを丈夫で頑丈な樹脂で印刷します(例:Tough 2000)。
2. EIB は社内で製造するか、外部のサービス プロバイダーに製造してもらいます。SMD(Surface Mounted Device)はんだ付け技術を使用して、高密度コネクタをEIBにはんだ付けします。
   注:微細な電子部品のはんだ付けの経験がない場合は、大学の電子機器工場や商業サプライヤーなど、外部ではんだ付けを行うことをお勧めします。はんだ付けされた高密度コネクタを、コネクタの周囲に強力なエポキシを塗布して補強します。電極の穴をエポキシで覆わないように注意してください。

3. 3Dプリントされたボディの後処理

注:キャップとシャトルは後処理の必要はありません。3Dプリントの品質によっては、軽く研磨したり、残ったサポートトレースを削除したりする必要があるかもしれません。サンディングや穴あけの際は、ドライブ本体の壁を壊さないように注意してください。必要に応じて、後処理された部品をイソプロパノールと柔らかい布、および/または圧縮空気で洗浄します。

1. ピンバイスに取り付けられた0.5mmのドリルビットを使用して、ドライブ本体の上部と下部にあるガイドチューブ用の穴を開けます。これにより、ディメンションが正しく、サイト間で一貫性が保たれます。
2. ピンバイスに2mmドリルビットを使用して、シャトル真鍮インサートのドライブ本体にある2つの皿穴( 図2E)をドリルで開けます。
3. 圧縮空気で穴あけ破片から皿穴を清掃します。次に、皿穴の延長であるシャトルネジのガイド穴をM1タップでタップします。タッピングを 2 回以上繰り返して実行し、タップと穴の繰り返しの間にゴミを取り除きます。必要に応じて、蛇口に一滴の鉱油を注油します。
4. ドライブ本体をドリルで穴を開けたり、圧縮空気でタッピングしたりしないようにします。

図2:TDドライブのレンダリング(A、B)TDドライブ(A)なし、および(B)ラットの頭蓋骨モデルの保護キャップ付き。(C)ポリイミドガイドチューブが6つの記録部位のそれぞれに正しく挿入されていること。(D)ガイドスクリュー、3Dプリントされたシャトル、およびはんだ付けされた真鍮インサートを備えた、分離された完成したシャトルアセンブリ。(E)シャトルを2個挿入したTDドライブ本体。赤でマークされている:(a)シャトル用の皿穴、(b)シャトルガイド、(c)ドライブ本体の中央台座、(d)ガイドステンシル。(F,G)ドライブ本体の上部(F)と下部(G)で、3Dプリント後の後処理が必要になる可能性のある重要な場所は、それぞれ赤い矢印で示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. シャトル組立

1. 3DプリントされたシャトルをM1x16ネジにスライドさせます。M1真鍮インサートを使用して、3Dプリントされたシャトルを所定の位置に保持します。シャトルは、インサートが配置された後、上下に動かずに自由に回転できる必要があります。
   注意: 次の手順には、火傷の危険性(はんだ付け)が含まれています。使用するはんだやはんだ付け用フラックスによっては、呼吸器刺激物や鉛への曝露が含まれる場合があります。はんだ付けするときは常に目の保護具を着用し(はんだが飛び散る可能性があるため)、はんだ付けの煙を抽出するためのワークスペースの適切な換気など、潜在的に有害な物質を安全に取り扱うための適切なガイドラインに従ってください。地域の規制および操作手順に従うか、オンラインで入手可能な資料^{を参照してください18,19}。
2. 少量のはんだ付けペーストを使用して、真鍮インサートをネジにはんだ付けします。3Dプリントされたシャトルを溶かさないように、インサートとスクリューを過熱しないように注意してください。シャトルの3Dプリントに使用される樹脂によっては、少量の溶融(そしてその後、シャトルがインサートにくっつく)を避けるのは困難です。
   注意: ステンレス鋼のネジを使用する場合、はんだフラックスが必要になる場合があります。真鍮または機械鋼のネジははんだ付けが簡単なため、使用することをお勧めします。
3. シャトルアセンブリが冷えたら、3Dプリントされたシャトルをネジの周りでゆっくりと複数回回転させます。はんだ付け中にシャトルがインサートに融合した場合は、シャトルが外れます。
   注:シャトルが自由に回転でき、ぐらつかないことを確認してください。その場合は、シャトルアセンブリを破棄して、新しいアセンブリを開始します。真鍮インサートを慎重に回転させてみてください。ネジに対して回転する場合は、はんだ付け作業を繰り返します。

5. ドライブの組み立て

1. 市販のポリイミドチューブを長さ約25mmに切断しますが、少なくともドライブ本体全体まで伸びるのに十分な長さにします。
2. ポリイミドガイドチューブをドライブ本体に挿入します。各チューブは、ドライブの上部にある 1 つの穴と、ドライブの下部にあるガイド ステンシルの対応する穴 ( 図 2E の "d") に挿入します。チューブは、ドライブ本体の上部と同じ高さになるまで挿入する必要があります。
3. 細い針またはつまようじを使用して、ドライブ本体上部の穴に少量の液体シアノアクリレート接着剤を塗布し、ガイドチューブを所定の位置に固定します。ガイドチューブに接着剤が流れ込まないように、本体の底面から接着剤を塗布します。接着剤は、毛細管の力によって駆動体とガイドチューブの間の空間に引き込まれ、2つを接続します。
4. ガイドチューブとドライブ本体の下部にあるガイドステンシルとの間の界面に少量のシアノアクリレート接着剤を塗布します。繰り返しになりますが、ガイドチューブが接着剤で詰まらないように注意してください。接着剤を数分間乾かします。
   注意: 必要な正確な時間は、ドライブの材質とドライブ本体とガイドチューブの間のクリアランスによって異なります。一般的には、5〜10分で十分です。
5. ドライブ本体を逆さまにし、底面のポリイミドガイドチューブをドライブ本体の中央台座から約1mm離れるように切断します( 図2E および 補足図2の「c」)。この構成では、ガイドチューブの端部は、移植時に脳表面と同じ高さになります。
   注:このドライブは、脳のより深い領域をターゲットにするために開発されました。皮質表面領域を対象とする場合は、脳の初期の腫れの際に脳表面を傷つけないように、より短いポリイミドガイドチューブが必要になるかもしれません。
6. 2つのシャトルアセンブリをドライブ本体に挿入します。ねじをタップ付きガイド穴にねじ込むときは、ねじがシャトルガイド( 図2Eの「b」)と平行であることを確認してください。指を使って、シャトルをシャトルガイドにそっと合わせます。
7. シャトルを皿穴に完全にねじ込み、シャトルアセンブリの真ちゅう製インサートがドライブ本体に詰まったり、ポリイミドガイドチューブと衝突したりしないことを確認します。このプロトコルでは、最低でも16回転の距離が必要です。これに達しない場合は、ドライブ本体の上部にあるポリイミドチューブをさらに切断して、スペースを増やします。ドライブ本体のシャトルを締めすぎないでください - これにより、ドライブ本体の閉じ込められたスレッドとシャトルアセンブリのはんだ接続が破壊される可能性があります。
   注意: シャトルアセンブリが動かなくなった場合は、シャトルアセンブリを完全に取り外し、はんだ接続が緩んでいないか確認してください。その場合は、新しいシャトルアセンブリを使用してください。シャトルアセンブリがガイドチューブに衝突する場合は、ガイドチューブがドライブ本体からはみ出さないように短くしてください。
8. EIB を M2.5x5 ポリイミドねじでドライブ本体にねじ込みます。ドライブ本体とEIBの間にシアノアクリレート接着剤を数滴塗布します。電極接続用の貫通穴を詰まらせないように注意してください。

6. 保護カバーの準備

1. ステンレス製のM2ナットをキャップ左半分の押し出し部に挿入し、シアノアクリレート接着剤で固定します。
2. 必要に応じて、ピンバイスにM1ドリルビットを使用して、左側のキャップの前面に穴を開けます。右キャップハーフの前面にある穴をM1タップでタップします。

7. ワイヤー電極の準備

1. 電極線束を作成するための表面として、金属板を2枚用意します。プレートは、平らで安定しているが可動面として機能し、その上でワイヤーバンドルの組み立て、接着、および切断が行われます。最初のプレートにプロット用紙を貼り付け、2枚の粘着画家のテープを2番目のプレートに結び、粘着面を上に向けて結びます。
2. HPCバンドルの4本のワイヤーのうち3本は、背腹方向にオフセットを作成するために60度の角度で切断されます。これにより、海馬の錐体層の上、中、下にそれぞれワイヤーを配置できるようになります。カットを容易にするために、プロット用紙に60度の角度で明確な線を引きます(60度の線)。
3. HPC電極束ごとに、長さ4.5cmの電極線を4本切断します。PFCとRSCの電極束ごとに、電極線をそれぞれ3.5cmの長さで4本切断します。
4. 4本のワイヤーを指先で触れてそっとつまみ(くっつきます)、ペインターのテープにできるだけ近づけて配置します。それらを互いに重ね合わせないように注意してください。
5. 顕微鏡下で、鉗子を使用してワイヤーをできるだけ近くに配置します。液体シアノアクリレート接着剤の薄層を、バンドルの上部の最初の2cmに塗布します。HPCバンドルの場合は、ワイヤーの>を2cm、<3.5cmを接着します。接着剤が乾くのを待ちます。
6. 顕微鏡下でいくつかの鉗子でワイヤーにそっと触れます。それらが分離しない場合は、正しく接着されています。健全性チェックとして、接着剤の層が顕微鏡の照明の下で輝いていることを確認してください。
7. 完全に乾いたら、ワイヤー束をテープから取り出し、プロット用紙でプレートに移します。顕微鏡で、ワイヤーの束の上部または側面に余分な接着剤がないか確認し、メスの刃で慎重に取り除きます。
8. RSCバンドルの場合は、アレイの下部でワイヤの方向に垂直にまっすぐにカットします。
9. HPCバンドルの場合は、アレイをプロット用紙に置き、60度の線と交差するようにし、線をガイドとして使用して、ワイヤの方向に対して60度の角度で切断します。
   1. 次に、メスの刃を使用して、バンドルから4本のワイヤーのうち最も短いものを慎重に分割します。ワイヤーをワイヤーの方向に垂直に切断し、バンドル内で2番目に長いワイヤーと比較して約0.75mmに短くします。
10. PFC バンドルの場合は、アレイの底部を 2 つの 2 線式バンドルに分割します。2本のワイヤーがしっかりと接着されていることを確認してください。2本のワイヤー束の1つをワイヤー方向に垂直に切断して、1mm短くします。切断されたワイヤ束の画像については、 補足図1 (下)および 補足図2b を参照してください。

8.アース線とEEG線の準備

1. 1.27 mmピッチの相互接続されたSIP / DIPソケットストリップから、少なくとも10本のSIP / DIPピンを押し出します。
2. アース(GND)線用に長さ6cmを2本カットします。脳波ワイヤー用に長さ6cmを8本カットします。メスの刃を使用して、すべてのワイヤの両端から絶縁体の一部を慎重に取り除きます。
3. M1x3ステンレス鋼ネジを3番目の手で置き、ネジの頭の下にできるだけ多くのスペースを確保します。GNDまたはEEGワイヤーの非絶縁面をネジのシャンクの周りに巻き付けます、ネジの頭のすぐ下。
4. はんだフラックスを小さな針やつまようじで少量塗布します。ワイヤーをネジにはんだ付けします。誤ってネジ頭のスロットを詰まらせないように注意してください。
5. 女性側にアクセスできるように、SIP / DIPピンを3番目の手に配置します。ワイヤの反対側の絶縁解除部分をSIP / DIPピンに挿入します。はんだフラックスを少量塗布し、ワイヤをピンにはんだ付けします。
6. はんだ付けされたネジワイヤーアセンブリをホルダーから取り外します。このアセンブリは、移植手術中に頭蓋骨に埋め込まれます。
7. 別のSIP / DIPピンをホルダーに配置し、180度回転させます(つまり、オス側にアクセスできます)。はんだフラックスを少量塗布し、もう一方のワイヤの絶縁されていない側をピンのオス側にはんだ付けします。
8. はんだ付けされたワイヤーピンアセンブリをホルダーから取り外します。このアセンブリは後でEIBに接続され、スクリューワイヤーアセンブリとワイヤーピンアセンブリは、移植手術中に2つのピンを使用して互いに接続されます。
9. はんだ付けされた接続部を補強するには、ワイヤとピンの間の接続部に少量のシアノアクリレート接着剤を塗布します。
10. 接着剤が乾いたら、2つのアセンブリのSIP / DIPピンがスムーズに接続できることを確認します。マルチメータの導通チェックオプションを使用して、両方のアセンブリが接続されたときに、ネジとワイヤピンアセンブリの絶縁解除されたワイヤ端との間に連続接続があることを確認します。必要に応じて、各ワイヤーセットをマニキュアで色分けし( 材料の表を参照)、インプラント手術中の正しい接続を簡素化します。

9. ワイヤーバンドルをドライブにロードする

1. ドライブをホルダーに取り付けます。この手順では、EIB に圧力をかけすぎたり、高密度コネクタを損傷したりしないように注意してください。
2. ドライブ本体が安定した位置になったら、ワイヤーバンドルの1つを取り、手または細い鉗子を使用して、それぞれのポリイミドチューブに慎重にスライドさせます。ワイヤーアレイが正しい向きに配置されていることを確認し(たとえば、PFCアレイの場合、アレイの2本の長いワイヤーは内側を向いている必要があります)、ワイヤーアレイを曲げないように注意してください。
3. 他のすべてのワイヤバンドルについて、最後の手順を繰り返します。
4. 細い鉗子を使用してワイヤーの1つをつかみ、挿入したい穴に向かって慎重に曲げます。挿入したら、金色のピンを使用してEIB穴に固定します。バンドルのすべてのワイヤとすべてのバンドルに対して、この操作を繰り返します。
   1. この段階で、ワイヤがEIBの上で適切なループを作成し(この方法では、チューブの下部の長さを調整するためにバンドルをポリイミドチューブを上下に動かす余地がまだあります)、ポリイミドチューブの底から突き出ているアレイが誤って曲がらないようにします。各ワイヤ バンドルのどのワイヤが EIB の各チャネルに接続されているかを書き留めておきます。TDドライブのチャネルマッピングの詳細については、 補足図1 を参照してください。
      注:または、各ワイヤバンドルをロードした後(ステップ9.2)、ワイヤをEIBに直接接続し(ステップ9.4)、残りのワイヤバンドルに対してステップ9.2 + 9.4に進むこともできます。これは、実験者の個人的な好みに基づいて変更できます。ロードされたTDドライブの例については 、補足図2b を参照してください。
5. ワイヤーバンドルをガイドチューブにそっと押したり引いたりして、ワイヤーバンドルの長さを調整して、記録位置を正しくターゲットにします( 補足図2dを参照)。
   注:ガイドチューブが脳表面と同じ高さになるようにカットされているため、ワイヤーバンドルがガイドチューブを超えて伸びる距離は、ターゲット領域の背腹側の位置に対応します。可動式のHPCワイヤーバンドルはガイドチューブの底面と同じ高さにし、固定RSCバンドルは1.5mm、固定PFCバンドルはガイドチューブから3.5mm延長する必要があります。ワイヤーアセンブリを押したり引いたりするときは、上部のEIBから個々のワイヤーを引き抜いたり、ワイヤーバンドルの下部を曲げたりしないように注意してください。
6. 固定ワイヤアレイ(RSCおよびPFC)が整列している場合は、ガイドチューブの上部に少量の強力なエポキシ接着剤を塗布し、バンドルを所定の位置に接着します。エポキシ樹脂が硬化している間、ワイヤー束が底部で正しく位置合わせされていることを確認してください。
7. 可動式 HPC ワイヤ アレイを固定するには、まずシャトルを必要な最も高い位置に移動します (この記事で説明する実験では、最低位置から少なくとも 16 回転/4 mm 上)。次に、ワイヤーバンドルをシャトルのU字型の開口部に押し込み、少量の強力なエポキシ接着剤で所定の位置に接着します。
   注意: エポキシ樹脂が束を伝ってポリイミドチューブに流れ込まないようにしてください。エポキシが硬化したら、同じ場所にエポキシの2番目の層を塗布して接続を強化し、シャトルを動かしたときに接続が切断される可能性を低くします。
8. GND ワイヤのワイヤピンアセンブリの開放端を、GND とマークされた貫通穴の 1 つに慎重に挿入し、金色のピンで固定します。
   注意: GNDチャネルとリファレンス(REF)チャネルが短絡しているヘッドステージを使用する場合、より便利な場合はREFチャネルも使用できます。
9. ドライブをホルダーから取り外します。ワイヤーアセンブリを曲げないように注意してください。ドライブの前面部分を同じホルダーに再度取り付け、4つのEEGワイヤーピンアセンブリをEEGチャネルの貫通穴(2、4、29、31とマーク)に挿入し、それぞれ金色のピンで固定します。
10. すべてのGNDおよびEEGワイヤについて、導通設定でマルチメータを使用して、EIBの金ピンと接続されたワイヤピンアセンブリのピンとの間の連続接続を確認します。
11. ドライブを保管します。これは、たとえば、キャップをドライブ本体に取り付けて逆さまに保管することで行うことができます。
    注:外科的移植の前に、エタノールを使用してドライブの底を滅菌します。すべての骨ねじとGND/EEGワイヤーアセンブリは、エタノールで滅菌する必要があります。手術器具はオートクレーブ で 滅菌する必要があります。

10.ドライブインプラント手術

注意: この手順では、TDドライブを埋め込むための外科的手順の概要を簡単に説明します。ツールの説明、薬物の用量と濃度など、より広範な移植プロトコルは、 補足ファイル1に記載されています。

1. 手術器具を滅菌し、地域の施設のガイドラインに従って手術部位を清掃および消毒します。インプラントを滅菌するには、脳と接触する電極ワイヤーの部分をエタノールに少なくとも1分間配置します。
   注:エタノールまたはその煙に長時間さらされると、シアノアクリレート接着剤が弱まる可能性があります。煙が閉じ込められていない場合は、ワイヤーをエタノールに浸す時間を長くします。接着剤の完全性を確認するために、実際の実験で使用されていないテストインプラントで最適な時間を見つけることをお勧めします。
2. 必要な先制鎮痛薬、抗生物質、およびガス麻酔 (イソフルラン) を施設および地域のガイドラインに従って提供します。
3. ラットを定位装置に入れます。頭のてっぺんを剃り、ポビドンヨードで皮膚を消毒します。局所麻酔薬(リドカイン)を皮下投与し、正中線の上の頭蓋骨に小さな切開を行います。
4. 皮膚を横に引っ張って頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨上部の結合組織を取り除き、乾かして頭蓋骨の表面をきれいにします。頭蓋骨の側面の筋肉をそっと取り外して、固定ネジを配置できるようにします。
5. bregma 座標とラムダ座標を測定します。正確なターゲティングのために、ブレグマとラムダの背腹側位置の違いを測定することにより、頭蓋骨の表面がステレオタックスの前後中外側平面と平行であることを確認してください。座標が異なる場合は、マウスピースを上げたり下げたりして、ステレオタックスでラットの位置を調整します。
6. 標的部位(前辺縁皮質(AP +3.5 mmおよびML + -1 mm)、後脾(AP + 5.8 mmおよびML +-1mmおよび海馬(AP -3.8 mmおよびML + -2.5 mm))の周囲の開頭術に印を付けます。
7. GND/EEGネジとアンカーネジ用のドリル穴。ネジを挿入し、液体歯科用アクリルで覆います。開頭術をドリルで開け、硬膜を慎重に取り外します。滅菌生理食塩水を適用することにより、開頭術が乾燥するのを防ぎます。
8. TDドライブを開頭術の上に慎重に配置し、ガイドチューブが頭蓋骨と同じ高さになるようにします。ガイドチューブをワセリンで保護し、TDドライブをデンタルアクリルで頭蓋骨に取り付けます。
9. HPCを標的とするワイヤーアレイを、初期位置(脳表面から~1.5 mm DV)から海馬CA1の錐体層に向かってゆっくりと下げます。ピラミッド層は、ラットの回復期の信号チェック中に、その後の数日間で徐々に到達しました。
10. ドライブの周りに保護キャップを取り付けます。
11. ガス麻酔をオフにし、ラットを定位フレームから取り外します。ラットを加熱されたチャンバー内の清潔なケージに入れ、回復のために湿った餌と水を提供します。ラットが再び活動し、ケージ内を移動し、食べたり飲んだりするまで、ラットを監視します。
12. ネズミを住居に戻します。術後の鎮痛とケアを施設のガイドラインに従って提供します。例えば、 補足ファイル1の手術プロトコールの例を参照してください。

11. EIBの回復

1. 実験の最後に、ドライブを回復し、保護カバーを取り外します。
2. 金ピンを取り外し、電極線を慎重に接続します。EIB をドライブ本体から緩めます。EIBとドライブ本体の間に柔らかいピンセットをそっと押し込むか、手でEIBを慎重に持ち上げることで、EIBを本体に固定している残りのシアノアクリレート結合を放出します。
3. EIBピンとゴールドピンをクリーニングして、後続のTDドライブインプラントで再利用します。EIB を再利用する前に、金ピン ビアと高密度コネクタに摩耗がないか確認してください。EIBを再利用するのは、ビアが損傷しておらず、金ピン、電極ワイヤ、およびEIB間の接続が良好であり、高密度コネクタのヘッドステージへの接続がまだ十分に安定している場合にのみ行ってください。

結果

プロトコルに記載されている指示を使用して、TD Driveは複数の実験者によって簡単に構築できました。ドライブ開発(n = 4)の後、8匹の動物でフルパイロットが実行されました。さらに8匹の動物を移植し、実験データの収集を行いました。これらの動物についてはデータ解析が完了していないため、生存解析には含めていますが、他の解析(ターゲティングや組織型など)には含まれていません。インプラント手術は、到着後2週間で行われました(パイロットで使用された目標位置については 、図3A を参照)。インプラントは通常の外科的処置で行われ、~3時間持続しました。経験豊富な外科医が初期インプラントを行い、2〜3回の手術で経験豊富な実験者と初心者の実験者の両方に自立を教えることができました。

図3:インプラント手術、睡眠データ、ブロードバンド活動。 (A)開頭術(青丸)と頭蓋骨ネジ(緑:脳波、青:GND、グレー:アンカーネジ、頭蓋骨側面に2本のアンカーネジがあることに注意してください)の目標位置を示す概略図。(B)睡眠時および覚醒時にヘッドステージがつながれた移植された動物の写真。(C)つながれた動物のPFC(Prelimbic)およびHPC(Ca1)からの睡眠データの例を、シータによるレム睡眠とデルタ、紡錘体、リップルによるノンレム睡眠に分けたもの。Y軸:マイクロボルト、x軸:秒。このデータは、例えば、睡眠スコアリングまたは振動イベントの検出および分析(D)例:覚覚醒した動物(左側のノイズの多いチャネルは接続されていなかった)で無線で記録された広帯域活動の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:インプラントの耐久性、デルタ検出、および組織型(A)2ラウンドの長期実験に対するインプラントの生存プロット。注目すべきは、85日目にn = 8が実験を終了し、灌流が計画されていたことです。(B)安定性のためのデータ例。記録日数(~週3日)における海馬チャネルでのデルタ検出の数を示しています。各動物は睡眠量に応じて正常な変動を示しましたが、信号と検出には経時的な一般的なドリフトはありませんでした。(C)1匹のラットに対するバイラテラシーターゲティングを示す代表的な組織型。左の列:左半球、右の列:右半球。AP座標は描かれたスライスの前後座標を示し、矢印は標的領域の病変を指しています。倍率:1.6倍。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

すべての動物は良好に回復し、インプラントに耐えました(図3B)。前頭と後脾臓の電極は固定されていましたが、海馬の束は可動式でした。海馬束は背腹の深さ 2 mm に移植され、手術回復の 2 週間で HPC カバレッジが最大になるように調整されました。8匹中7匹では、すべての標的部位が少なくとも1つの半球で到達しました(ヒット率については表2 、代表的な組織型については 図4C を参照)。ウェイクとスリープの録音は、録音ボックス内でテザリングされて正常に実行され、より大きな迷路でのワイヤレス録音も行われました(データ例図 3C、D)。動物はインプラントを2か月間保持しましたが、そのとき個々の動物はインプラントを失い始めます。しかし、大多数の動物は、インプラントの85〜100後の実験終了日までインプラントを保持していました(図4A)。この間、LFPは安定しており、デルタ振動が検出された分析の例(図4B)に見られます。時間経過に伴う正常な変動性はありましたが、記録された脳領域(CA1の錐体層を含む)のいずれにおいても信号の系統的なドリフトは見られませんでした。手術後10〜15週間以内に実験を終了することをお勧めします。すべての EIB を回復できました。

このインプラントは、主に学習やその他の介入に応じた睡眠ステージと睡眠振動の測定に適用されています。例えば、CBDの経口摂取が脳領域間の振動発生やコヒーレンスにどのように影響するか(Samanta et ^al.20参照)。

パラメーター	最小値(mm)	最大値(mm)
メディオラテラルサイト1	0.75	2
medioLateralSite2	1.5	5
メディオラテラルサイト3	0.75	2

表1:記録サイトの中側座標を制御するパラメータに手動で課せられた制限の概要。

半球	PFCの	RSCの	CA1 pyr.
右	8の8	5 / 8	6 / 8
左	8の8	7 / 8	7 / 8

表2:パイロット8匹の命中率。 8匹中4匹では、すべての電極が正しく配置されていました。しかし、8匹中7匹の動物では、すべての脳領域が少なくとも1つの半球で正しく標的とされていました(CA1錐体層が欠損した1匹のラットを除く)。

補足図1:TDドライブのアーキテクチャ。 (トップ)オーバーview Intan RHD32ヘッドステージで使用する場合のTDDドライブのチャネルマッピング。(ボトム)ワイヤ バンドル構成の追加図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:構築プロセスのいくつかの段階でのTDDドライブの追加写真。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:TDドライブの埋め込みのためのプロトコルの例。 手順と対象場所は、著者の研究課題と機関の方針に合わせて調整されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本稿では、自由に動くラットの左右対称マルチエリアワイヤー電極記録用の適応性インプラントを紹介します。

あらかじめ定義されたパラメータを変更することでインプラントを簡単に調整できることが、TD Driveを開発した動機の1つでした。パラメータの変更に対する柔軟性を最大限に高めることを目指す一方で、パラメータ間の関係に内在する制約が、この適応性に必然的に制限を課します。前後パラメータにはデフォルトでは制限は設定されておらず、これらの座標は論理的なサイト間相互作用とドライブ本体の全体的なサイズによって制御されます。すべての記録サイトの中横座標を制御するパラメータは、手動で課せられる制限の対象となります( 表1を参照)。多くのパラメトリック オプションの根底にあるのは、設計機能間の多数の相互作用です。これらの相互作用は、特定の条件下でばらばらになることがあります。理想的な状況では、パラメーター値の可能なすべての組み合わせが有効です。しかし、TD Driveのより複雑な設計では、メディオラテラル座標をテスト範囲内に制限することを選択しました。テストされた制限外の座標を選択することは、原則として可能です。ただし、設計の整合性が損なわれる可能性があり、限界外の座標を維持しながら復元するにはCADモデリングの経験が必要になる可能性があるため、このような変更を行うことはお勧めしません。これは、ドライブの生産の容易さと柔軟性の間のトレードオフの本質的な結果です。自由度が大きくなると、ドライブのパラメトリック定義がより複雑になり、過度にきめ細かく望ましくない結果が生じる可能性があります (たとえば、ドライブ設計の小さな変更に対して異なる EIB を生成する必要があるなど)。

このTDドライブの現れで行われるパラメータの選択は、現在の実験者の好みによって導かれます。例えば、TDドライブの台座の高さを高くすることで、手術時の埋め込みのしやすさを向上させることを選択しましたが、最終的なインプラントはわずかに高くなります。しかし、このインプラントは、個々に可動する四極管を持つドライブよりもはるかに小さく、動物たちにも好評を博しました。ドライブを固定するために使用される2つの台座( 図2Eの「c」)は、ラットの頭蓋骨の正中線縫合糸に平行な中心面に意図的に配置されています。これにより、記録位置は0.75mm>中横座標に制限されます。多くの場合、正中線より下に矢状洞が存在すると、解剖学的に開頭術に同様の制限が課せられます。TD Drive の現在の設計は、Autodesk Fusion で作成されています。これは、パラメトリック3Dコンピュータ支援設計の最も先進的なプログラムの1つであり、公開時点では学術的な使用のための無料ライセンスを提供していますが、プログラムの商用およびクラウドベースの性質は、設計の無料利用にリスクをもたらします。したがって、設計を真のオープンソースのパラメトリックCADソフトウェア²¹(FreeCADなど)に移植することは、将来の反復のために必要になるかもしれない。

TDドライブの手術は2〜3時間で行うことができます。ワイヤーのターゲット位置は定位的にマークされており(正中線の隣にPFC + 3.5AP、正中線の隣にHPC -3.8AP -/+ 2.5 ML、RSC -5.8)、ネジ電極、GND、および安定性のための追加の頭蓋骨ネジは、それらの位置に対して相対的に配置されます。TD Driveステンシルは定位位置を提供しますが、ポリイミドチューブの配置が不正確であったり、剛性の低いチューブ材料を使用したりすると、電極の位置に小さなばらつきが生じる可能性があります。したがって、このばらつきを考慮して、(ガイドチューブサイズの0.5mmのバリ穴の代わりに)小さな開頭術をドリルで開けることをお勧めします。この手術では、RSCおよびHPCターゲットのための単一のより大きな開頭術が穿孔されます。PFCとRSCの場合、ワイヤー束が固定された深さに埋め込まれることが選択されました。PFCバンドルには、前辺縁質と前帯状皮質から記録するために、2つの異なる深さを対象としたワイヤーがありました。HPCバンドルは可動式で、Ca1ピラミッド層とラジアタム層に到達するのを容易にするために、高さの異なる3本のワイヤーで構築されていました。最後の短いワイヤーは、PPCからの録音を可能にしました。手術時間中に最も長い電極ワイヤーを目標の深さ(脳表面から2 mm)に移動させた場合、海馬Ca1を標的とした場合に最良の結果が得られ、手術後2週間のライブシグナルチェック中にわずかな調整のみを行い、手術後の個々のばらつきと脳の腫れに対応しました。

ラットの四極管ハイパードライブなどの大型インプラントの問題は、インプラントの安定性が低下し、動物がインプラントを失う可能性があることです。TDドライブでは、2ヶ月後のインプラント安定性の低下による個々の故障が観察されました(16匹中3匹)。したがって、TD Driveは、最大8週間の実験に推奨されます。この期間では、信号は安定しており、正確な海馬錐体層の記録でさえも安定しており、LFPの記録に影響を与える系統的なドリフトや大きなぐらつきがないことを示しています。この長期安定性を実現するための 1 つの要因は、複数の頭蓋骨ねじを使用することです ( 図 3A を参照)。特定の状況では、使用済みの頭蓋骨固定ネジの量が感染のリスクを高める可能性があります²²。しかし、これは頭部固定ラットに最も関連している可能性が高く、頭部固定と接続された固定ネジへの頭部固定の繰り返しのストレスにより、インプラントが劣化し、感染が促進される可能性があります。インプラントの失敗のリスクを高める(そして動物の行動に不快感を引き起こす可能性がある)別の要因は、インプラントの重量です。固定ネジと歯科用セメントを備えた完全なTDドライブインプラントの重量は約7gで、3Dプリントされた部品とEIBが重量の約半分を占めています。TDドライブの重量が小さい(他の大型四極管ハイパードライブの1/3未満)ため、インプラントの重量が過剰であってもTDドライブの故障の大きな要因になる可能性は低いです。一般に、安定した、感染のないインプラントの主な要因は、無菌手術手順と、インプラントをインプラント、固定ネジ、および頭蓋骨²³にコーティングしている歯科用セメントの良好な接着性です。TD Driveは、局所的な電界電位を記録するためにのみ評価し、単一ユニットの活動を取得しようとは試みませんでした。インプラントは一般的に十分に安定していると予想していますが、セッション内およびセッション間で同じユニットをたどるには、シャトルガイドレール( 図2Eの「b」)を最適化するなどして、シャトルの安定性を最適化する必要がある場合があります。他の記録サイトに可動シャトルを追加することで、ユニット記録の長期的な信号品質を向上させるための好ましい方法である可動ワイヤー電極の追加使用が可能になります。

約3時間の総組み立て時間と約2-3時間の手術時間で、TDドライブは四極管ハイパードライブとよりシンプルで調整の少ないマルチワイヤーインプラント²⁴との間の妥協点を提供します。選択したターゲットを使用して、6つのバンドルを持つ10の脳領域からの記録が達成されました。移動不可能なワイヤー束用の他のインプラントと比較して、記録部位の対称的な配置は別の利点をもたらします:横方向化が関連性がない場合、両方の半球に同時にワイヤーを移植すると、正しいターゲットに到達する可能性と動物あたりのデータ収量が2倍になります。パイロットでは、8匹中4匹の動物が5つの標的部位(前辺縁質(PRL)および前帯状皮質(ACC)皮質を含むPFC、RSC、PPC、およびHPCのCa1錐体層)をすべて両側に正しく標的としていましたが、8匹中7匹は少なくとも片側の各脳領域が記録されていました。したがって、このドライブは、特に睡眠研究など、より多くの動物数が必要な場合に、経験の浅い研究者が適用できるLFPを記録するための迅速で簡単なソリューションを求める人にはお勧めです。個々のニューロン活動の記録を可能にする多くのハイエンド四極管ハイパードライブでは、非常に熟練した経験豊富な研究者でさえ、年間2〜6個のインプラントしか構築および移植できず、その多くは関心のある脳領域にうまく到達できません。より高い成功率を達成するには何年もの訓練が必要であり、それでも効率的に記録できる動物の数は少ないままです。

要約すると、TDドライブは、さまざまな記録部位やカニューレやファイバーなどの他のインプラントを簡単に収容できるように適応できる6つのバンドルを備えた、簡単で迅速に構築できるワイヤードライブを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5mmドリルビット	McMaster	2951A38
1.27 mmピッチ相互接続SIP/DIPソケット(Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	EEGおよびEEGの接続および接続用GNDネジ
5分エポキシ	バイソン	市販	通常の既製エポキシ
シアノアクリレート接着剤	ロックタイト		瞬間接着剤-3
EEGワイヤー	Science Products GmbH	7SS-2T
電極ワイヤー	Science Products GmbH	NC7620F
エタノール	LC		の標準的な術前滅菌手順用
(5)	FST	91150-20	ワイヤーバンドルの準備と取り扱い用
Form 3B	Formlabs		TDドライブのセルフプリントパーツを3Dプリントに用いた3Dプリンター
ゴールドピン(小)	Neuralynx, Inc.	9885	EIB基板へのエレクトルド電線の取り付け
Ground	wire Science Products GmbH	SS-3T/A
高密度コネクタ	LabMaker GmbH / Omnetics	A79026-001
Lister Hodded rats	Charles River Laboratories	Crl:LIS	We used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert	AliExpress	Commercially available	https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap	McMaster	2504A33
M1x16 screw	Bossard	1096613
M1x3ステンレス鋼ネジ	ネジなど	84213_14985
M2.5x5 ポリイミドネジ	ネジなど	7985PA25S_50
鉱物油	マクマスター	1244K14
マニキュア	エトス	市販	脳波およびGNDワイヤー
画家用テープ	ガンマ	市販	ワイヤーバンドル準備用
ピン万力	McMaster	8455A16
プロット紙	Canson	市販	バンドル準備
ポリイミドチューブアマゾン	/小部品	TWPT-0159-30-50	AWG、0.0159 "ID、0.0219 "OD、0.0030"壁、30"長さ
RHD 32チャンネルヘッドステージ加速度計Intan	Technologies、LLC	C3324	テザー録音用sleepbox
RHD 3フィート(0.9 m)標準SPIケーブル	Intan Technologies, LLC	C3203	整流子からヘッドステージへ
RHD 6フィート(1.8 m)標準SPIケーブル	Intan Technologies, LLC	C3206	OpenEphysボックスから整流子へ
フランジ付きスリップリング	Adafruit	1196	整流子:直径22 mm、12線
はんだフラックス	グリフォンS-39 50 ml	市販	はんだ付け用 EEG &GNDネジ
はんだ付けペースト	アマゾン	B08CBZ5HC5
ステンレス鋼M2ナット	マク	マスター93935A305
テザー録音セットアップ	OpenEphys	Acquasition Board
ワイヤレス録音ロガー	SpikeGadgets	miniLogger 32	タスクのワイヤレス録音用
ワイヤレス録音セットアップ	SpikeGadgets	メインコントロールユニット(MCU)には、ブレークアウトボードとRFトランシーバーが含まれています	タスクのワイヤレス録音用