顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

サマリー

このプロトコルは、顆粒膜細胞を欠くゼブラフィッシュのクリーンなステージI卵子を迅速に単離するための修正手順を説明しており、それにより卵子特異的研究に便利な方法を提供します。

要約

卵子の発生の研究は、発生生物学において重要な意味を持っています。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、卵母細胞から胚までの初期発生過程を調べるためのモデル生物として広く利用されてきました。ゼブラフィッシュでは、卵母細胞は体細胞顆粒膜細胞の単層に囲まれています。しかし、顆粒膜細胞を卵子から分離することは、純粋な卵子を得ることが正確な分析に不可欠であるため、課題を提起します。ゼブラフィッシュの卵子を異なる発生段階で単離するためには様々な方法が提案されていますが、現在の技術では顆粒膜細胞を完全に除去するには不十分であり、卵子のみに焦点を当てたゲノム解析の精度は限られています。本研究では、ゼブラフィッシュの純粋なステージIの卵子を迅速かつ効率的に単離し、顆粒膜細胞の汚染を排除するプロセスの開発に成功しました。この手法は、特に卵子に特有のエピジェネティックおよびゲノム構造の側面を探索する際に、生化学的および分子的分析を容易にします。特に、この方法はユーザーフレンドリーで、卵子の損傷を最小限に抑え、その後の研究と分析のための実用的なソリューションを提供します。

概要

ゼブラフィッシュは、発生生物学において最も重要なモデルシステムの1つです。近年、数多くの研究がゼブラフィッシュをモデルとして利用し、卵母細胞から胚までの重要な生物学的事象や調節過程を研究しています。これらには、卵子の発生と成熟¹、母体遺伝子の機能^性2、母体-接合子転換³の制御、および広範なオミクス解析⁴の複雑な過程が含まれます。

顆粒膜細胞は、卵巣卵胞^5,6内で発生中の卵子を包み育てる体細胞であり、この発生過程において極めて重要な役割を果たします。原始生殖細胞(PGC)が卵原細胞に進化すると、それらは顆粒膜細胞^の単層7に囲まれるようになる。外部髄膜細胞とともに、卵母細胞とその周囲の顆粒膜細胞は成熟した卵胞を構成する⁸。生殖細胞と体細胞の根本的な違いを考えると、特にゲノム関連の解析では、純粋な卵子サンプルを得ることが不可欠です。

ゼブラフィッシュの濾胞構造内では、顆粒膜細胞は通常、わずか数ミクロンの直径8^{を示し、顆}粒膜細胞と卵母細胞9との間の密接な相互接続を強調し^ている。この密接な関連は、顆粒膜細胞の数と体積の両方と卵子(単一の卵子と比較して数百の顆粒膜細胞)のかなりの違いのために、完全な分離を達成する上での課題を提示します^10,11。単一の顆粒膜細胞による最小限の汚染でさえ、特に卵子を標的とした下流の分析を妨げる可能性があります。したがって、ゲノムおよびエピジェネティックな特性に焦点を当てた研究では、顆粒膜細胞の排除が不可欠です。

十分に特徴付けられた形態学的基準の恩恵を受けて、各段階の卵子は直径¹¹に基づいて区別することができる。ゼブラフィッシュの卵形成過程は、形態学と核型¹¹によって5つの段階に分類されます。ステージIの卵子(直径7〜140μm)は、減数分裂の発症から減数分裂Iの初期段階までの卵子を包含しています。重要なことに、これらの卵子は透明であるため、透過光を通じて中心核を観察できます(図1Ai)。ステージIIの卵子(直径140-340μm)は、徐々に泡立ち、半透明になります。卵胞の肥大と皮質肺胞の増殖に伴い、中心の胚小胞を区別しにくくなる¹²(図1Aii)。ステージIIIの卵子(直径340〜690μm)は徐々にビテロゲニンを蓄積し、新鮮な卵胞はますます不透明になります(図1Aiii)。減数分裂は、染色体が減数分裂IIの中央に入り、そこで停滞するため、ステージIVの卵母細胞(直径690〜730μm)で継続します(図1Aiv)。ステージVの卵子(直径730〜750μm)は成熟し、排卵の準備ができています^7,11(図1Av)。

前述の各段階の特異な特性に基づいて、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、およびヒアルロニダーゼを含む消化液を用いてゼブラフィッシュの卵巣を消化し、続いて特定のサイズの細胞ス^{トレーナー13}で濾過することにより、I期からIII期の卵母細胞を分離する方法が提案されている。しかし、この方法では、異なる発生段階で卵子を得ることができる一方で、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離することはできません。他の研究者も、卵母細胞から顆粒膜細胞を分離する方法を提案しています。しかし、これらの方法は主に機械的なアプローチに依存しており、卵子の損傷を引き起こす可能性があり、時間がかかり、分析のためのかなりの数の卵子を得るには不十分である^14,15。

既存の方法の限界と特定の研究要件を考慮して、この研究は、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離し、分析に十分な数のきれいなステージIの卵子を得る手順を確立することを目的としています。参照された方法¹³を拡張して、より穏やかで卵母細胞の分散と顆粒膜細胞の解離を容易にする改良された消化バッファー( 材料の表を参照)を採用しています。その後、卵子を細胞ストレーナーに通し、洗浄してさらに顕微鏡で選択することで、多数のクリーンなステージIの卵子を獲得することができます。

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュは、関連する国や地域の動物福祉団体が定めた厳格な動物管理ガイドラインに従って取り扱われました。魚の飼育と取り扱いは、地方自治体と四川大学華西病院の動物倫理委員会の両方から承認を受けています(承認番号20220422003)。ゼブラフィッシュの卵巣には多段階の卵子が混在しており、各発生段階は成体のゼブラフィッシュの卵巣に存在します。しかし、ゼブラフィッシュの稚魚は、大型で不透明な成魚の卵巣に後期卵子(II-III期)が優勢であることから、本研究にセブラフィッシュの稚魚を選抜しました。対照的に、幼若の卵巣は、主にステージIの卵子からなる平らで細長い卵巣を持っています(図1B)(図1B)。これまでの研究では、ゼブラフィッシュの成体と幼魚における初期の卵形成の形態学的特徴が非常に一貫していることが示されており、ゼブラフィッシュの稚魚を利用する可能性を裏付けています¹³。 図2に概説する以下に説明する手順は、解剖からきれいなステージIの卵子を得るまでの単離プロセスの詳細な説明を提供します。さらに参考までに、この研究で使用した試薬、バッファー、および機器は 、材料表に記載されています。

1.卵巣解離

1. 標準体長(SL)が10mmから15mmの範囲のメスのゼブラフィッシュを数匹選択します。
   注:SLは、鼻から尾の付け根までミリメートル単位で測定され、適切な魚を選択するための信頼できる基準として機能します。この手順では、受精後5〜7週間(wpf)の稚魚を使用し、SLは10mmから15mmの範囲で使用することをお勧めします。ゼブラフィッシュの稚魚の卵巣は、主に初期の卵子によって占められており、ステージIの卵子を容易に得るための最適な条件を提供しています(図1B)。
2. 稚魚の雌魚を氷冷水(0〜4°C)に入れて安楽死させます。
   注:安楽死を確実にし、ゼブラフィッシュが安楽死中に経験する痛みを最小限に抑えるために、次の手順を実行する必要があります:温度計を使用して氷冷水の温度が0〜4°Cの範囲内にあることを確認し、ゼブラフィッシュを氷冷水に迅速に移し、手術運動の停止後少なくとも10分間氷冷水に維持します^16。17、18。
3. 魚の表面の余分な水分を吸収紙で乾かします。
4. ゼブラフィッシュを実体顕微鏡で解剖するには、次の手順に従います。
   1. 鰓カバーの後縁に沿ってマイクロハサミを使用して頭を切り取ります。クロアカに沿って尾を切り落とします。中央の幹を、2 mLのL-15培地(L-グルタミンを含む)が入った35 mmの皿に移します。
   2. L-15ミディアムで中央の幹を解剖します。腹部の中心軸に沿って切り込み、内臓を取り除き、膀胱を泳ぎます。
      注:ゼブラフィッシュの内臓はつながっています。そのため、肛門部付近の後腸をつまんで持ち上げると、内臓の塊全体を簡単に取り除きます。
   3. ピンセットを使用して両側の卵巣を腹部から切り離します。卵巣に付着している脂肪組織、鱗屑、およびその他の体組織を取り除きます。
      注:卵巣は脂肪組織で覆われています。したがって、卵母細胞への機械的損傷を避けるために、それらを一緒に取り除くのが最善です。
      注意: ピンセットは怪我をしないように注意して取り扱ってください。

2.消化

1. 卵巣を2 mLのKinger細胞解離溶液を含む6ウェルプレートに移し、28.5°Cで2〜3時間インキュベートします。 6ウェルプレートを30分ごとに振とうし、分散を促進します。
   注:ピンセットを使用して卵巣を小さな組織ブロックに分離し、消化効率を高めます。消化時間は可変です。実体顕微鏡の下にかなりの数のステージIの卵子が散らばっているときに、プロセスを定期的に監視し、終了します。キンガーの細胞解離溶液は作業溶液であり、直接使用することができます。包装後は-20°Cで安定して保存でき、低温(4°C)で解凍してから使用できます。
2. 28.5°Cに予熱したL-15培地を消化バッファーに加え、消化を停止します。

3. ろ過

1. 100 μmのセルストレーナーを6ウェルプレートの別のウェルに入れ、L-15培地を加えて、培地レベルがフィルターよりも高いことを確認します。
   注:ステージIの卵子の理論直径は140μm未満です。ただし、直径の大きい卵子は、細胞ストレーナーを通過する可能性があります。そこで、この工程では、ターゲットよりも直径が小さいセルストレーナーを選択した。メッシュサイズは、特定の実験ニーズに応じて調整できます。
2. ピペットを使用して、セルストレーナーを通して消化培地を引き出します。すべてのステージIの卵子がストレーナーを通過するまで1〜2分待ってから、ストレーナーを取り除きます。移し替えプロセス全体を通して卵母細胞が液体に留まることを確認してください。
   注:卵子を培地に保持すると、卵子の完全性と最適な状態を維持するのに役立ちます。卵子が長時間空気にさらされると、卵子が乾燥して損傷を受け、最終的な分離効率に影響を与える可能性があります。卵子を細胞ストレーナーを介して移すときは、卵子を懸濁状態で追加するのではなく、ピペットを液面の下に置いてください。

4. 洗濯

1. ピペットを使用して余分な培地を取り除きます。新鮮なL-15培地4mLを加え、卵子を穏やかに再懸濁します。1〜2分待ってから、上清を取り除きます。
   注:卵子の損傷を防ぐために、接着特性の低い器具を使用してください。
2. 他の不純物がなくなるまで、手順4.1を5〜6回繰り返します。
   注:卵子の損傷を避けるためには、洗浄プロセス中の穏やかな取り扱いが重要です。前の洗浄ステップでステージIの卵子(1匹のゼブラフィッシュから約200〜400のステージIの卵子)が豊富に得られたにもかかわらず、卵子は細胞断片、他のステージの卵子、または壊れた後期卵子によって形成された小さな顆粒とまだ混合されている可能性があります。さらに、一部の顆粒膜細胞は、不完全な酵素消化のために、まだいくつかの卵子の表面に付着している可能性があります。そのため、ゲノムシーケンシングなど、より高い純度が求められるアプリケーションでは、完全にクリーンな卵子を選択するための追加ステップが必要です。これに対処するには、ステップ 5 と 6 に進みます。

5. 品質管理のための選択

1. 洗浄したステージIの卵子を、新鮮なL-15培地が入った35 mmディッシュに移します。
2. 倍率10倍以上の顕微鏡で、鈍い注射針などの精密に操作できるツールを使用して、顆粒膜細胞に付着した細胞断片、他のステージの卵子、およびステージIの卵子を取り除きます。
   注:このステップには実験者の忍耐が必要ですが、清潔で無傷の卵子を確実に分離します。
   注意: 注射針は怪我をしないように注意して取り扱ってください。

6. 核染色による確認

注:単離された卵子をさらに精製するために、Hoechst 33342による染色を使用して、前のステップで見逃された可能性のある顆粒膜細胞に付着した個々の卵子を同定し、除去しました。

1. 最終濃度5 μg/mLのHoechst 33342をL-15培地に加え、室温で10分間インキュベートします。
2. 蛍光顕微鏡でヘキスト蛍光をUVレーザー励起下で観察します。
   注:ヘキストは通常、紫外線領域、通常は310〜360nmの波長で励起されます。このプロセスでは、80倍から100倍の間の倍率を使用することをお勧めします。自動露出モードを採用します。励起波長と露光時間は、特定の顕微鏡モデルと個々の要件に基づいて調整できます。
3. 針を使用して、目的の基準を満たさない卵子を慎重に選びます。
   注:細胞を視覚化すると、卵子の中心に大きな核クロマチンが存在します。顆粒膜細胞を卵子に接着すると、小さくて明るい核が卵子の縁にしがみついているのが見えます(図3)。顕微鏡でそれらを選び出します。
4. 卵子をL-15で徹底的に繰り返し洗浄し、余分なHoechstを取り除きます。
5. 同定したステージIの卵子を直接使用してその後の抽出を行うか、液体窒素で瞬間凍結した後、-80°Cで保存してください。
   注意: 液体窒素および超低温冷凍庫を取り扱うときは、保護フェイスマスクと極低温手袋を着用してください。

結果

図1 は、ゼブラフィッシュの成体と幼魚の両方で観察された卵巣の形態を示しており、参照として役立つさまざまな発生段階の卵子を示しています。 図1A は、一次成長段階(I期)から始まり、排卵卵子(V期)まで、各発生段階における卵子の形態とサイズをグラフで表したものです。 図1Ai-vは 、卵子のI期からV期に対応する直径を示しています。 図1B (左パネル)は、稚魚(SL = 1.5 cmで6 wpf)の卵巣画像を示しています。特に、幼若卵巣は明確な小葉状の外観を示し、主に透明なステージIの卵子が豊富にあり、ステージIIの卵子の集団が少ないことを特徴としています。このステージIの卵子の有病率は、卵子の観察と回収を非常に容易にします。右のパネルは、成魚の卵巣(6か月)の形態を示しており、さまざまな発生段階の卵子が観察できます。しかし、卵巣では不透明な後期卵子(II期からIII期)が優勢です。

図2 は、解剖からきれいなステージIの卵子を得るまでの代表的なプロセスを示しています。 図3 は、参照法と改変法の両方を使用して得られたI期の卵子を示しています。ヘキスト染色後、卵母細胞と顆粒膜細胞の核は紫外線下で青色の蛍光を示しました。参照方法(図3A)を使用して得られた画像では、卵母細胞の表面は多数の染色された顆粒膜細胞核によって密に囲まれていました。対照的に、改変法(図3B)によって分離されたI期の卵子は、完全な曝露と清浄度を示し、顆粒膜細胞核の染色は存在しません。

私たちの調査結果は、ステージIの卵子を単離するための提案された方法の有効性を実証しました。魚類の卵子の発生過程は、いくつかの共通の特徴を示している⁷。その種間の適用性を評価するために、他の魚種についてさらなる分析が行われました。雌の池のドジョウは地元の市場から入手し、初期卵子(直径<100μm)も同様の手順で単離しました。また、ドジョウの卵巣組成は、複数の発生段階で卵子の混合物を示し、卵子の形態と大きさが同じ段階のゼブラフィッシュと驚くほど似ていることを特徴としていました。 図4Aに示されているように、成体の雌の池ドジョウの卵巣は、透明な初期卵子が点在する不透明な後期卵子によって優勢でした。卵母細胞の表面に顆粒膜細胞の透明な単層が観察されました。ゼブラフィッシュでの観察結果と同様に、直径が100 μm未満のドジョウ卵母細胞は、ジプロテン期の前の段階に対応していました。 図4B は、改変法によって得られたきれいな池のドジョウ(Misgurnus anguillicaudatus)の卵子を示しています。ゼブラフィッシュの卵巣と比較して、池のドジョウの卵巣は解離するのがより困難です。消化の6〜7時間後、より多くの初期卵子が解離します。それにもかかわらず、この調整されたアプローチにより、望ましい清潔で裸の卵子が得られました。ゼブラフィッシュはコイ科に属し、ドジョウはコビ科に分類されます。これら2つの科は分類学的には遠い関係を示していますが、卵巣の発達段階と形態は著しく類似しており、この方法は一般的にさまざまな魚種の卵子の分析に利用できることを示しています。

図1:ゼブラフィッシュの卵巣と卵子の異なる段階の代表的な画像(A)各発生段階における卵子の形態と大きさ(St)。i-vは、ステージIからVまでの卵子の画像と直径を表し、スケールバー= 200μm。 (B)成体および幼体のゼブラフィッシュの卵巣形態。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:解剖からクリーンなステージI卵子の獲得までの単離手順の代表的な画像。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3:2つの方法によって得られたステージIの卵子 (A)参照された方法によって単離されたステージ(St)Iの卵子。(B)改変法により単離されたI期の卵子。卵子と顆粒膜細胞の核をHoechstで染色し、UV光で励起しました。スケールバー = 100 μm. BF = 明視野。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:改変法で得られた池のドジョウの初期卵子 (A)卵巣の代表的な画像と池のドジョウの卵子。I、IIはさまざまな倍率でイヌドジョウの卵巣を表し、III-IVはイヌドジョウの初期卵子を表しています。スケールバー:i(500μm);ii(200μm);III、IV(100μm)。(B)池のドジョウから分離された初期卵子。卵子と顆粒膜細胞の核をヘキストで染色し、UV光で励起しました。スケールバー = 100 μm. BF = 明視野。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、顆粒膜細胞を除く純粋でクリーンなステージIの卵子を、ダウンストリーム解析(特にゲノム解析)のために単離する方法を開発しました。この修正された方法を参照^{された方法13}と比較すると、この方法を使用して得られたステージIの卵子は、形態学的に無傷で、十分な数であり、他の体細胞との汚染がないため、その後のさまざまな研究および分析に適しています。さらに、他の機械的分離方法^14,15と比較して、改良された方法は、操作が容易で、より多くの卵子の獲得を容易にし、そして卵子の損傷を防止する。

また、ステージIのゼブラフィッシュの卵子細胞を効果的に単離するだけでなく、この方法はドジョウにも適用でき、さまざまな魚種に幅広く適用できることが示されています。顆粒膜細胞のコンタミネーションが遺伝子発現やエピジェネティックな解析に及ぼす影響を調べるため、リファレンス法と改変法を用いて得られた卵子のRNAシーケンシング(RNA-seq)およびCUT&Tag解析を行いました。RNA-seqによって発現差のある遺伝子がいくつか同定されましたが、顆粒膜細胞で特異的に発現する遺伝子の一部はまだ同定されていません(データは示されていません)。この分析では、異なる方法で単離された卵子間のヒストン修飾に大きな違いがあることも明らかになりました(データは示されていません)。これらの結果は、卵母細胞と顆粒膜細胞を完全に分離し、正確な遺伝子発現とエピジェネティックな解析を行うこの方法の重要性を強調しています。

提案手法を実施する際には、(1)ゼブラフィッシュの適切なサイズを選択することが重要である。これにより、十分な卵子が得られ、その後の洗浄ステップが減少します。SL<10mmのゼブラフィッシュの卵巣では十分な卵子が得られないため、サンプリング要件を満たすためにより多くの魚が必要となり、繁殖圧力が増加します。逆に、SLが15 mmを超えるゼブラフィッシュは、ステージII-IIIの卵子が徐々に形成され、消化反応中に膜が簡単に壊れます。(2)大型の魚を使用すると、損傷した卵子による細胞内容物の漏出によりコンタミネーションが発生し、消化反応がある程度抑制される可能性があります。このような場合は、古い消化緩衝液を取り出し、L-15で洗浄した後、新しいキンガー細胞解離液を追加してさらに消化することをお勧めします。(3)適切な機器が利用可能な場合、消化中に振とうすると分離が促進されます。

ステップ3.1では、小さな顆粒膜細胞が細胞ストレーナーを介して卵子に付随することがあります。しかし、実際の観察では、最終的に収集された卵子サンプルには顆粒膜細胞が含まれていないことが示されています。不完全な消化により一部の卵母細胞に残存顆粒膜細胞が存在する場合を除き、他のHoechst標識顆粒膜細胞はシステム内で検出されませんでした。.ここでは、顆粒膜細胞が小さくて軽いため、培地に懸濁したままになり、その後、複数の洗浄ステップで除去される可能性があるという仮説を立てました。単離効率は、顆粒膜細胞付着を有する卵母細胞とヘキスト染色後の清浄な卵子の割合を計算することによっても定量化されました。1000個の卵子を含むサンプルで最大98%のクリーンな卵子の割合が観察されました。

その多くの利点にもかかわらず、提案されたアプローチにはいくつかの注目すべき制限もありました。まず、この方法はDNAまたはRNAの抽出、シーケンシング、および無傷の生細胞の即時検出について検証されていますが、他のアッセイ領域への拡張の実現可能性と信頼性はまだ検証されていません。また、提案手法はI期の卵子の単離にしか適用できず、他の病期の単離効率が不十分であることも限界です。そのため、提案手法の効率性と適用性を向上させるためには、さらなる努力が必要です。さらに、今後の研究では、提案された方法を適用して卵子を他の段階から効率的に分離し、その適用範囲を広げることができるかどうかを検討することに焦点を当てる必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キンガーの細胞解離液	PlantChemMed	PC-33689	キンガーの細胞解離液は、-20°Cで安定して保存することができます。Cは包装後、低温(4°C;ゼブラフィッシュの卵巣の解離に直接使用できます。最適な温度は28.5°Cです。C、約2〜3時間。持続時間は、特定の解離条件に応じて、短縮または延長(https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689
セルストレーナー(100 μm )	Falcon	352360
蛍光顕微鏡	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
ガラス毛細管針	/	/	ライターで燃焼して鈍化
Hoechst	Yesen	40732ES03
低吸着ピペットチップ (10 μl)	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz's L-15 ミディアム メディウム (L-グルタミン付き)	Hyclone	SH30525.01
アイスバケツ	/	/	氷冷水はゼブラフィッシュの安楽死に使用されます
インキュベーター	WIGGENS	WH-01
幼魚	/	/	5–受精後6週間、標準の長さ[SL]は10&ndashです。15 mm
プラスチック皿 (35 mm)	SORFA	230101
実体顕微鏡	Motic	SMZ-161
組織培養プレート (6ウェル)	SORFA	0110006
Vannas 春鋏	Fine Science Toosl	#15000-00