方法論記事

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

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DOI：

10.3791/66461

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2024年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

この記事について

サマリー

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。

要約

DNAおよびRNA配列(分析物)を検出するためのDNAzymeベースのナノマシン(DNM)は、オリゴヌクレオチドで作られた多機能構造です。その機能には、緊密な分析物の結合、選択性の高い分析種の認識、蛍光レポーター基質の複数の触媒切断による蛍光シグナル増幅、およびセンサー応答の増加のための蛍光基質引力が含まれます。機能ユニットは、共通のDNAスキャフォールドに取り付けられ、協調的な働きをします。RNA切断10-23 DNMは、非触媒ハイブリダイゼーションプローブと比較して感度が向上しています。DNMの安定性と基質認識の可能性の増加は、二本鎖DNAフラグメントであるタイルによってもたらされます。DNMは、フォールドRNAと二本鎖DNAで一塩基が異なる2つの分析種を区別し、他のタンパク質フリーハイブリダイゼーションプローブよりも~1000倍低い濃度で分析種を検出できます。この記事では、DNA-ナノマシン活性の診断可能性の背後にある概念と、核酸検出アッセイにおけるDNMの設計、組み立て、およびアプリケーションの概要を示します。

概要

核酸検出の最も初期の方法の1つは、分析されたRNAまたはDNA配列への選択的オリゴヌクレオチドの相補的結合です。この方法では、標的DNAまたはRNA分析物1とWatson-Crick塩基対を形成できる核酸フラグメント(プローブ)を使用します。次に、複合体は、さまざまな手法によって分析物および非結合プローブと区別されます。ノーザンブロッティング、 in situ ハイブリダイゼーション、またはqPCRなどの特定の方法は、相補的結合2の現象に基づいています。最も一般的なハイブリダイゼーションプローブには、感度が低い(マイクロモルからナノモルレベルに達する)ことと、点変異を含む一塩基変異(SNV)に対する選択性が低いという2つの重大な欠点があります。この問題は、これらの欠点の解決策が互いに矛盾するため、洗練されたアプローチが必要です3。最高の選択性を得るためには、検出するオリゴヌクレオチドを、不適合な分析種と不安定なハイブリッドを形成するのに十分な短さに保つ必要があります。このような短いオリゴヌクレオチドは、標的核酸にしっかりと結合できず、その二次構造をほどくことができないため、検出可能なシグナルが得られないことがよくあります。生物学的RNAや二本鎖DNA(dsDNA)中のCGリッチフラグメントを検出することは特に困難です。一方、長いプローブはSNV3の影響を受けません。デッドロックを打破するために、バイナリプローブの概念が開発されました4。

バイナリセンサーは、1つの検出プローブを2つに分割し、その断片を特殊化し、そのうちの1つをヘアピンをほどいたりdsDNAに侵入したりするために長く保ちます。第2のバイナリプローブフラグメントは、塩基の不一致に対して感度を高めるために短いままであり、したがってSNVを検出する手段を提供する。2つのバイナリセンサー部品が結合されている場合、信号が生成されます4。全複合体は、FRET5、分子ビーコンプローブ6,7、またはペルオキシダーゼ様活性8,9,10のG-四重鎖、またはRNA切断11,12,13 DNAzymeを介して可視化することができる。10-23 DNAzymeコアを備えたバイナリセンサーについては、十分に説明されています。これらは、合成的に作成された一本鎖核酸フラグメント11、または一本鎖増幅産物14,15を検出するように適合されています。例えば、細胞培養物から抽出された16S rRNAの場合、この分子は細胞12,16に豊富に存在するため、増幅を伴わない検出も可能です。10-23 DNAzyme コアを備えたバイナリセンサーは、鉛イオン17 などの非核酸検出にも適合させることができます。それにもかかわらず、低感度は依然としてバイナリ10-23 DNAzymeセンサの主要な欠点の1つであると考えられており、この問題に対処するために、カスケード18または代替のシグナル増強方法19を含む様々なアプローチが開発されてきた。残念ながら、上記の手法はセンサー部品のコストと不安定性を大幅に増加させるため、実用化されていません。

この研究で記述された実験は、DNA-ナノマシン(DNM)20,21と呼ばれる10-23 DNAzymeベースのDNA-ナノセンサーを使用する。これらの構造には、バイナリセンサーと、(1)バイナリプローブに隣接するDNAファシリテーター、構造化領域を巻き戻して二本鎖DNAに侵入するDNAファシリテーター、(2)すべてのDNM部品を近接して保持し、シグナル形成の可能性を高めるDNAタイルが含まれます(図1)。全体として、10〜23 DNAzymeベースのDNMは、検出限界(LOD)をピコモル範囲21まで減少させる。これらは、細胞溶解物中の16rRNAを検出するために使用することができる22、または増幅せずにウイルスRNAの存在を報告するために23,24。同時に、DNMはSNVに対して感受性を保ち、ヘテロ接合体25の対立遺伝子の遺伝子型決定にさえ使用することができる。DNM法は、製品の可視化や、高い選択性を持つ複雑な混合物中の製品の同定のために、あらゆる増幅タイプを補完する技術として使用できます。DNM は、従来の TaqMan プローブや beacon プローブとは異なり、サンプルの加熱を必要としないため、エンドポイント検出プロトコルに使用でき、全体的な検出コストを有効にします。

この記事では、DNMの in silico 開発について説明し、DNMの組み立てと機能特性評価の手順を示します。この研究は、ウイルスDNA(OR652423.1)の13972-14154位に対応するエプスタイン・バーウイルス(EBV)の合成断片を用いて行った( 資料表参照)。

プロトコル

1. DNM設計

  1. 目的のゲノム内の一意の領域を選択します。
    注:この研究では、エプスタイン・バーウイルス(EBV)ゲノムの13972-14154(OR652423.1)の領域を使用しています。
  2. 選択したフラグメントを増幅するためのプライマーセットを、例えばUgene26に埋め込まれたPrimer3ツールで作成します。
  3. UNAFold Web Tool27 ( 資料の表を参照) を開き、選択した領域を挿入します。フォールディング温度を55°Cに変更し、イオン条件を一価イオンを250 mM、Mg2+を200 mMに変更します。
    1. 得られたssDNAフラグメントの二次構造を開き、安定したヘアピンを選択します。DNA-ナノマシンの結合部位を非構造化領域、またはヘアピン構造のループ上に位置付けて、ターゲットのより強力な結合を実現します。
  4. 標的分析物部位がステムループ構造で折り畳まれている場合は、アーム1とアーム2を次のように配置します:アーム2がステムの片側、ループ、および2番目のステム側の3〜5 ntに結合していることを確認します。アーム1は、第2のステム側の断片を結合します。
  5. DinaMeltツール28 ( 材料の表を参照)を開き、アームのシーケンスとその逆補数シーケンスを分析します。DinaMeltツールを使用して、アーム2およびアーム3のTm が65°Cを超えていること、つまりアッセイ温度(55°C)より少なくとも10°C高いことを確認します。
    1. 高い認識選択性を達成するには、Arm1のTm を反応温度(55°C)より少なくとも1〜3°C高く保つ29。
  6. アーム1および2の配列をDNAzymeコアの半分およびF-sub結合フラグメント13と組み合わせます。
  7. UNAFold27を使用して、設計されたDNA鎖の二次構造を解析します。
    注:55°C(アッセイ温度)、200 mM Mg2+、250 mM一価イオン(HEPES、Na +、K +)。
    1. 折り畳みΔGが-4 kcal/mol未満の場合にのみ、設計を使用してください。CGを多用した長いシーケンスは避けてください。二次構造が安定しすぎる場合は、Armに突然変異を導入して、折り畳みΔG30を増加させます。あるいは、Arm 3 2-3 ntをArm 2から離して配置することは、Arm 3の配列を変更して安定した分子間構造を回避する別の戦略です。
  8. Arm 3 の長さの DNA タイルフラグメントのランダム配列を作成します。Arm 3配列を(dT)4-6またはエチレングリコール(トリエチレングリコール(TEG)またはヘキサエチレングリコール(HEG)など)を介してDNAタイル配列と組み合わせます。実験で示されたDNMバージョンは、(dT)6を使用します。
  9. ステップ1.8で選択したDNAタイルフラグメントに相補的な配列とArm 2をリンカー を介して リンクする。
  10. UNAFold Webアプリを使用して、設計されたDNA鎖の二次構造を解析します。各DNA鎖のフォールディングエネルギーが55°Cで4 kJ/molを超えていることを確認し、CGが豊富な長い配列は避けてください。好ましくは、DNAタイル配列を変更する。
  11. 利用可能なベクターグラフィックスソフトウェアを使用して構造を描画します。この記事では、視覚化に Biorender と Pixelmator Pro を使用します ( マテリアルの表を参照)。各ストランドの5'->3'方向の精度を確認します。
    注:配列は、信頼できる商用ベンダーから入手してください。

2. DNMの機能テスト

  1. バッファーおよび試薬の調製
    1. 50 mM HEPES(pH 7.5-7.8)、50 mM NaCl、150 mM KCl、および200 mM MgCl2で構成される反応バッファーを調製します。脱イオン水を最大50mL満たします。
    2. Dzb-TileおよびTile-Arm3オリゴヌクレオチドの10 μMアリコートを調製します。Dza、100 μM F-sub、および1 nM、10 nM、100 nMの分析種の1 μM溶液を、RNase/遊離水または滅菌脱イオン水で調製します。オリゴヌクレオチド配列の詳細は、 材料表に記載されています。
  2. DNMアセンブリ
    1. 使用する前に、オリゴヌクレオチド溶液を完全に解凍してください。軽くたたいて穏やかに混ぜます(激しく渦巻かないでください)。微量遠心分離機を使用して溶液を(数秒間、急速に)スピンダウンします。
    2. 0.5 mL微量遠心チューブ中の反応バッファー200 μLに、Dzb-TileとTile-Arm3をそれぞれ1 μMずつ混合します。
    3. チューブを穏やかに混合し、溶液をスピンダウンします。
    4. 閉じたチューブの蓋をパラフィンフィルムで包みます。または、スクリューキャップチューブを使用します。
    5. チューブを沸騰したお湯で500mLのビーカーに2分間インキュベートし、ヒーターの電源を切り、温度を受動的に一晩冷まします。
    6. 12% ネイティブ PAGE を調製する: 1 mL の 10х TBE バッファー、3 mL の 40% AA:BA、最大10 mLの脱イオン水、50 μL の APS、および 5 μL の TEMED を混合します ( 材料の表を参照)。混合物をゲルカセットに移し、重合させます。
    7. 各サンプル、すなわちアセンブルしたDNM、Dzb-Tile、Tile-arm3 1 μLを4xローディング色素1 μLと混合し、ゲルにロードします。
    8. カセットをチャンバーに入れ、1x TBEバッファーで満たし、ゲルを80Vで90分間泳動させます。
    9. ゲルを臭化エチジウムで染色し、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して視覚化します( 材料の表を参照)。
  3. LODアッセイ
    1. 反応バッファーに200 nM F-sub 160 μLを調製します。これは、基板の安定性の基本的な背景を評価するために行われます。
    2. 反応バッファー中に、20 nMのDNMおよびDzaおよび200 nMのF-subの濃度で、160 μLのプレアセンブルDNM、F-sub、およびDzaを7アリコート調製します。7 つのチューブのうち、チューブ #1 を空白の背景として保持し、DNAzyme コアの自発的な組み立てを評価します。
    3. 最終濃度1 pM、10 pM、100 pM、200 pM、500 pM、1000 pMで分析種をチューブ#2-7に加えます。
    4. 穏やかに混合し、チューブをスピンダウンし、溶液を3つの50 μLの部分に分別して、黒色の96ウェルプレートに入れます。プレートを光学的に透明なフィルムで密封します。
    5. プレートを55°Cの水浴で1時間インキュベートします。プレートをスピンダウンします。
    6. 525 nm(λex = 495 nm)で蛍光を測定します。各ポイントの平均と標準偏差を計算します。
    7. F-sub と DNM を含む真空管の信号を F-sub のみを含む真空管の信号で割ることにより、ブランクと基本の比率を計算します。比率が1.1〜1.5の範囲内にあることを確認します。
    8. F-sub、DNMを含むチューブの信号、および分析対象物をF-subおよびDNMのみを含むチューブの信号で割ることにより、S/Blank比を計算します。信号がバックグラウンド平均に 3 つの標準偏差を加えた値よりも高い場合、その信号を真陽性と見なします。
    9. 実験を2回繰り返し、分析反復間の標準偏差が0.5未満であることを確認します。

結果

最初の実験の目的は、分析物の合成断片の前にDNMが組み立てられていることを示すことでした。すべての構成DNMストランドを反応バッファーに添加し、ビーカーで組み立てました。組み立てられたDNM複合体は、ネイティブPAGEによってその正しいサイズと均質性について評価されました。ネイティブPAGEは、レーン1に分析種、レーン2と4に2つのDNMストランドを使用して組み立てられたDNMを示しています。DNAナノマシンが組み立てられていなかった場合、1つの低移動度バンドではなく、2つまたは3つの別々のバンドが見えるでしょう( 図2Aのレーン2)。

プロトコールの2番目の部分は、DNM性能の機能特性評価と標的核酸の検出を意味します。本研究では、EBV 13972-14154の合成断片を用いた。この目的のために、事前に組み立てたDNMのフラグメントをDzaとともに、さまざまな濃度の分析物と55°Cで1時間インキュベートしました。 2つのコントロール蛍光シグナル値を測定しました:事前にアセンブルされたDNMのフラグメントと分析物を含まないDzb(ブランク)、およびF-subからのバックグラウンド(塩基性)の値。3つの技術的な測定が行われました。統計学については、3つの独立した試験も実施されています。この研究のマグネシウム濃度が文献30で見つけることができるものよりも高いことは注目に値します。高レベルのマグネシウムイオンは、自発的なFサブ切断を促進するため、すべての試験管の信号を増加させます31。技術開発の準備段階で反応バッファーの組成を最適化し、実施するすべての研究でこのプロセスを繰り返すことはありませんでした。

1時間のインキュベーション後、サンプルの蛍光を分光蛍光計を使用して測定しました( 材料の表を参照)。DNMによる解析されたDNAの検出を確認するために、解析されたDNAとアセンブルされたセンサーの蛍光シグナルと、分析物を添加していないネガティブコントロールの蛍光シグナルを比較しました。シグナル対ブランク比(分析物を含むウェルと分析物を含まないウェルの平均相対蛍光単位との間の比)は、検出が成功したことを確認するために1.5以上である必要があります32。ブランクと基本の比率(分析物がない場合のセンサー応答の蛍光をF-subのみのコントロールの蛍光で割ったもの)は、1.1〜1.5の範囲である必要があります。この比率は、DNMとDzbの濃度を変更することで調整できます(それぞれの一般的な濃度範囲は5〜20 nMです)。私たちの実践では、LOD は、トレンドラインと平均ブランクより 3 標準偏差上の交点として定量化されます (図 2B)。DNM は、LOD が <100 pM33 の場合に有効です。LOD が 100 pM を超える場合は、DNM を再設計する必要があります。

figure-results-1
図1:この研究で使用した3アームDNM。 3つのオリゴヌクレオチド、Dza、Dzb-Tile、およびTile-Arm3は、それぞれ緑、青、紫でマークされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:DNMの特性評価。 (A)50 bp+ DNAラダーを使用して、12%ポリアクリルアミドゲル、80 V、1時間で天然電気泳動 による DNMの組み立て。(B)55°Cで60分間インキュベートした後の合成DNAの検出限界。 水平線はしきい値を表し、垂直線はLODです。3つの独立した測定値の平均値は、1つの標準偏差で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

DNAマシンの設計は簡単ですが、ハイブリダイゼーションプローブや機能的なDNAナノ構造の設計にはある程度の経験が必要です。分析種のフラグメントをできるだけ短く保つことで、二次構造の数を減らし、二次構造へのDNM浸潤を簡素化することが適切です。CG含有量は、安定した分子内構造を避けるために、できれば60%未満である必要があります。DNMの組み立ては、低速の冷却速度で成功します。場合によっては、DNMをチューブ内で自発的に組み立てることができ、アニールステップをなくすことができます。DNMアセンブリは、0.1〜0.3°C/minのサーマルサイクラーまたは大量の冷却水で実行できます。DNMの組み立てが不適切な場合は、アニーリングステップ中の温度変化を遅くすることをお勧めします。

LODを測定するには、少なくとも7つの分析種濃度ポイントが必要です:0 pMの分析種濃度(F-sub + DNM)と、線形依存性を観察するために1 nM〜1 pMの範囲の6つの異なる分析種濃度(図2B)。多くの場合、より高い精度を得るために7つ以上の集中ポイントが使用されました。各濃縮点について、3回の技術試験(各50 μL)を行う必要があります。したがって、各濃度の総容量は 160 μL (ピペット誤差を考慮すると 10 μL 過剰) でした。

DNM技術は、他のハイブリダイゼーションベースのシステムよりもSNVに対して高い感度を示します。SNVに対する高い選択性は、細菌のジェノタイピング22 に関連する点突然変異の同定や植物25におけるヘテロ接合体の選択など、特定の目的に関連することがある。非特異的な分析種についても、同じ実験手順が必要です。低濃度の分析物に対する SNV の理解不能を避けるために、実験的な未知の分析物のシグナルを、同じ濃度の既知の完全に相補的な分析種のシグナルと比較することをお勧めします。

この方法は、ssDNA、miRNA、フォールドRNA、またはdsDNAアンプリコンにうまく適用できます。長いRNAまたはdsDNAフラグメント、特にCGリッチフラグメントは、4〜6個の分析種結合アームを備えたDNMを必要とする場合がありますが、不安定な二次構造(-10 kcal/molを超えるΔGフォールディング)を持つ一本鎖分析物には、2つの分析種結合アームで十分です。この方法は、PCR、SDA、またはLAMPアンプリコンの検出に適用できます。DNMは、全RNAを単離することなく、細菌培養物の煮沸サンプル中のrRNAを増幅せずに検出するために使用できます22,34,35。この手法は、フェムトモルレベルのような低濃度や、隣接領域のCG含有量が65%を超えるdsDNA断片ではうまく機能しない可能性があります。CG含有量は、例えば、BiologicsのCG含有量計算機36を用いて推定することができる。DNM設計にフックパーツ37を追加して感度を高めたり、重心密度が高い場合はdsDNAをssDNAに変換したりすることを推奨します。この方法の別の制限は、DNMがサンプルの品質に敏感であるため、核酸を慎重に精製することです。同じことがDNMのオリゴヌクレオチド配列の品質にも当てはまります。したがって、すべてのオリゴヌクレオチド供給の安定性と純度を検証することが推奨されます。従来の増幅技術と比較して、DNMの設計にはスキルが必要であり、記事のリリース日までに、ほぼ完全に手動です。DNMは、合成フラグメントを実際のDNAまたはRNAサンプルにさらす前に、合成フラグメントの予備テストを必要とするため、テストシステム開発の全体的な期間が長くなります。

この方法は汎用性が高く、さまざまなタイプのレポータープローブを採用できます。それは多重化することができ38、そしてF-subがG-四重形成基板39に置き換えられるならば、その技術は比色バージョンに変換することができる。ポリメラーゼの存在は、鎖の成長のエラーと関連しています。したがって、この方法は、従来のリアルタイムPCRおよびデジタルPCRよりも、また、生鮮タンパク質酵素の欠如および堅牢で簡単な検出手順40,41のために、SHERLOCKおよびDETECTRなどの他のヌクレアーゼ依存性技術よりも有利である。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者らは、EBVのgDNAを提供してくださったEkaterina V. Nikitina氏に感謝します。Muhannad Ateiahさん、Maria Y. Berezovskayaさん、Maria S. Rubelさんは、ロシア連邦教育科学省(助成金番号:FSER-2022-0009)とPriority 2030プログラムに感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLチューブBiofilCFT011015
100 bp+ DNAラダーEvrogenNL002
100-1000 µLピペットKirgenKG-Pro1000
10-100 µLピペットKirgenKG-Pro100
1-10 µLピペットKirgenKG-Pro10
20-200 µLピペットKirgenKG-Pro200
2-20 µLピペットKirgenKG-Pro20
4xゲルローディング染料EvrogenPB020
アクリルアミド4KAppliChemA1090,0500
過硫酸アンモニウムカールロス2809447
バイオレンダリングレンダリングhttps://www.biorender.com
ビサアクリルアミドモレクラ22797959
ホウ酸TechSnabH-0202
ChemiDoc イメージングシステムBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
臭化エチジウムBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
塩化マグネシウムAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
ピペット 10 & マイクロ;LチップKirgenKG1111-L
ピペット1000µLチップKirgenKG1636
ピペット200µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
塩化カリウムCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse フリーウォーターInvitrogen10977049
PCR プレート用シーリングフィルムSovtechP-502
塩化ナトリウムベクトンHCh (0,1)
Spark マルチモード マイクロプレートリーダーTecanSpark- 10M
T100 アンプリフィケーターBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA研究所http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
ウォーターバスLOIPLB-140
<ストロング>オリゴ使用
<ストロング>アナライト:エブロゲン直訳、標準脱塩精製
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogen直販、標準脱塩精製
Dza: TGCCCAGGGAGGCCTCTCTT
GTCCGTGTGCCTGCA		エブロゲン直順、標準脱塩精製
F-subオリゴヌクレオチド: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntez直接オーダー、HPLC精製
バイオ

参考文献

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