幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。
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この記事について
サマリー
要約
遺伝子治療は、機能遺伝子の導入、毒性遺伝子の不活性化、または製品の疾患生物学を調節できる遺伝子の提供など、疾患の治療のために患者に新しい遺伝子を送達するための強力な技術です。治療用ベクターの送達方法は、全身送達のための静脈内注入から標的組織への直接注入まで、さまざまな形態をとることができます。神経変性疾患の場合、形質導入を脳や脊髄に偏らせることが望ましいことがよくあります。中枢神経系全体を標的とする最も侵襲性の低いアプローチには、脳脊髄液(CSF)への注射が含まれ、治療薬が中枢神経系の大部分に到達することを可能にします。CSFにベクターを送達する最も安全なアプローチは、針を脊髄の腰椎槽に導入する腰椎髄腔内注射です。この技術は、腰椎穿刺とも呼ばれ、新生児や成体のげっ歯類、および大型動物モデルで広く使用されています。この手法は種や発生段階によって似ていますが、髄腔内空間を取り巻く組織のサイズ、構造、弾力性の微妙な違いにより、アプローチには適応が必要です。この記事では、アデノ随伴血清型9ベクターを送達するために、幼若ラットに腰椎穿刺を行う方法について説明します。ここでは、25〜35μLのベクターを腰椎槽に注入し、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを使用して、各注入から生じる形質導入プロファイルを評価しました。このアプローチの利点と課題について説明します。
概要
近年、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、第IX因子血友病、がんなどの治療薬がFDAに承認されたことで、ウイルス媒介性遺伝子治療の有望性がついに実現されました1,2,3,4。現在、他にも数え切れないほどの治療法が開発されています。遺伝子治療は、治療用遺伝子を患者さんの細胞に届けることを目的としています。この新しい遺伝子の産物は、欠損した内因性遺伝子の欠落した活性を補ったり、毒性遺伝子を阻害したり、がん細胞を殺したり、その他の有益な機能を提供したりすることができます。
中枢神経系(CNS)に影響を与える疾患では、遺伝子治療ベクターを標的組織に直接送達することが望ましい場合が多いです。非全身的アプローチは、末梢形質導入によって引き起こされる可能性のあるオフターゲット副作用を最小限に抑えることと、標的組織5で適切なレベルの形質導入を達成するために必要なベクターの量を大幅に減少させるという2つの利点を提供する。
遺伝子治療ベクターをCNSに送達するには、さまざまなアプローチがあります。実質内注射は、ベクターを脊髄または脳組織に直接注入することであり、定義された領域への送達に使用できます。しかし、多くの疾患では、CNSの広範な形質導入が望まれています。これは、脳と脊髄の中や周囲を流れる脳脊髄液(CSF)5にベクターを送達することで達成できます。ベクトルを CSF に送達するには、主に 3 つの方法があります。最も侵襲的なアプローチは、頭蓋骨にバリ穴を開け、脳から側脳室に針を進める脳室内分娩です。これにより、脳全体に形質導入が起こります。しかし、この手順は頭蓋内出血を引き起こす可能性があり、このアプローチは一般に脊髄の限定的な形質導入のみを引き起こします6。頭蓋骨の基部にある大槽への注射は侵襲性が低いですが、脳幹に損傷を与えるリスクがあります。動物実験5ではよく使用されるが、大槽への注射はもはや診療所では日常的に使用されていない7。腰椎穿刺は、CSFにアクセスするための最も侵襲性の低いアプローチです。これには、2つの腰椎の間と腰椎槽に針を配置することが含まれます。
ベクター送達のための腰椎穿刺は、成体ラットとマウス、および新生児マウスで日常的に行われています8,9。この研究の著者らは最近、幼若ラット(生後28〜30日)で腰椎穿刺を行い、アデノ随伴ウイルス血清型9(AAV9)ベクターを送達しました。成体ラットでは、新生児腰椎穿刺針をL3椎骨とL4椎骨9の間に垂直に配置した。適切に配置すると、テールフリックとCSFがニードルリザーバーに流れ込みます。しかし、幼若ラットでは、これらの読み出しはどちらも達成できませんでした。次に、著者らは、L5とL6の間の角度で挿入された27Gインスリン注射器を使用して、成体マウスの手順を適応させようと試みました10。成体マウスでは、通常、P28ラットよりも小さいため、これはテールフリックを引き起こしませんが、注射液の逆流により誤った針の配置が明らかになります。しかし、幼若ラットでは、このアプローチにより、注射液が硬膜外に送達されることが一様に示され、これは、成体マウスと幼若ラットの間で脊髄を囲む組織層の弾力性が異なるためと考えられる。次に、カテーテルアプローチを評価しました。具体的には、カテーテルは腰椎槽の硬膜の切開部から胸部中央部の脊髄まで導入されました。しかし、このアプローチでは、分娩中に注射液が切開部位から大幅に逆流することになりました。ガイド針を使用して経皮的にカテーテルを髄腔内空間に配置する試みも成功しませんでした。層間幅が狭いため、カテーテルは吻側椎吻板に当たって前進しない可能性があります。
ここでは、幼若ラットにおける腰椎穿刺 による 成功し再現性のある溶液送達を達成するための方法が記載されている。このアプローチは、ウイルスベクターに使用でき、細胞、医薬品、その他の治療薬にも使用できる可能性があります。
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プロトコル
この研究は、エモリー大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(生後28-30日齢、体重約90-135g、雄と雌)を用いた。
1. ベクターの調製
- 手順の開始時に、AAV9ベクター( 材料の表を参照)を氷上で解凍します。
- ベクターを含む微量遠心チューブを卓上型遠心分離機で短時間遠心分離し、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。
- 微量遠心チューブを静かにフリックして、溶液が十分に混合されていることを確認します。
2.リカバリーケージの準備
- 清潔なケージを電気毛布( 材料の表を参照)に置き、ケージの半分だけが毛布に接触するようにします。
- ブランケットの温度を~37°Cに設定します。
3.手術台の準備
- 等温パッド( 材料の表を参照)を電子レンジまたはウォーターバスで39°Cに温め、内容物が液体になるようにします。
- 等温パッドを手術台に置き、清潔な吸収性ベンチパッドで覆います。
4.動物の調製
- 透明な箱に入ったイソフルランでラットに麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従います)。5%イソフルランを使用して麻酔導入を開始し、2%に達するまで1分あたり1%ずつ減らします。動物を2%でさらに3分間保持します。
- 動物を固定している箱をドラフトに移し、箱を開けます。
注:これにより、外科医の麻酔薬への曝露が制限されます。 - 電動バリカンを使用して動物の背中から毛を取り除きます。
注:あるいは、脱毛クリームまたは手動カミソリとシェービングクリームを使用することもできます。 - 動物を手術台に置き、鼻を麻酔鼻円錐形に置きます。
注:動物は、毛皮が手術部位から取り除かれている間に意識を取り戻し始めることがあります。これが発生した場合は、上記のように再度麻酔をかけてください。 - 手術中の角膜の乾燥を防ぐために、各眼に潤滑性の眼軟膏を塗布します。
- ポビドンヨードとイソプロパノールワイプの3つの交互の塗布を使用して、手術領域を消毒します。
- 鎮痛剤を皮下注射します。.
注:ブプレノルフィンは、通常、0.01〜0.05 mg / kgの用量で、12時間ごとに投与されます。.あるいは、この薬物の徐放型を1 mg / kgで1回投与して、72時間にわたって適切な疼痛制御を提供することもできます。疼痛管理に関するガイドラインについては、機関のIACUCに相談してください。 - 100μLの1%リドカインをL2からL6の棘突起の上に皮下注射して、局所麻酔を提供します。
- ペーパータオルのロールまたは直径1.5 cmのチューブを動物の下に置き、腰に向かって吻側に置きます。これにより、背骨が曲がり、2つの椎弓板の間に針を挿入しやすくなります。
- 動物に穴あきドレープ( 材料の表を参照)を置き、窓割りを腰椎の中央に置きます。
5.腰椎を露出させる
- 動物の各足をつまんで、離脱反応がないかどうかを探して、麻酔の深さを確認します。
- #11メスの刃を使用して、L2からL6の正中線に沿って皮膚に約3cmの長さの切開を作成します。
- 無菌の湾曲した手術用ハサミを筋肉と皮膚の間に挿入し、先端を開いて、筋肉から皮膚を緩めます。
- L2-L5棘突起を覆っている筋膜を取り外します。
6. シリンジの装填
- ベクターの25-35μL(所望の用量を達成するため)を滅菌微量遠心チューブのキャップにピペットで移します。
- 全ボリュームをインスリン注射器に引き込みます。
注意: このプロセス中に空気を吸い込まないように注意してください。
7. インジェクションの実行
- L5およびL4棘突起を特定します。
注:L6は2つの腸骨稜の間に直接位置しており、その棘突起は鈍器でプローブすることで簡単に識別できるはずです。その後、装置を背面からゆっくりと動かして、L5 と L4 のプロセスの境界を見つけることができます。 - 親指が動物の尻尾と片方の足にそっと置かれるように片方の手を置きます。指を使ってシリンジを安定させます。
- シリンジの針をL5棘突起の左側にくらみ、尾側の端と整列するように配置します。シリンジを正中線から約30°、テーブルの平面から30°上になるように配置します。
注:手術用顕微鏡を使用して、ランドマークをより適切に識別し、針の先端を配置すると役立つ場合があります。 - シリンジ針を約8 mm前方に進め、L5椎弓板の上部を越え、次にL4椎弓板の下を骨が当たるまで腰椎槽に入れます。正しい配置をすると、脚や尻尾がぴくぴくと動き、親指が脚/尻尾に乗ったときに見たり感じたりすることができます。けいれんがない場合は、針を取り外して左側から施術を試みます。それでもけいれんが起こらない場合は、必要に応じてL4/L3とL3/L2の間で手順を繰り返します。
- プランジャーをゆっくりと約5秒間押し下げます。
注:注射中に脚や尾にけいれんがある場合があります。 - プランジャーを完全に押し下げた後、シリンジを約30秒間所定の位置に保持して、圧力が平衡化し、針が引き抜かれたときの注射液の逆流を最小限に抑えます。.
- 針をゆっくりと取り外します。
8. 切開部の閉鎖
- 切開部の端を概算します。
- 創傷の一方の端から始めて、4-0縫合糸( 材料の表を参照)または外科用ステープルを使用して切開を閉じます。
9. 復旧と監視
- 動物を温めたケージに入れます。
- 動物が完全に歩行できるようになるまで、少なくとも15分ごとに動物をチェックしてください。
注:これには15分から45分かかります。 - 次の3日間は、少なくとも毎日健康チェックを実施します。手術後の最初の 2 日間、または IACUC の必要に応じて鎮痛薬を提供します。
- 手術の1週間後、縫合糸またはステープルを抜く。
10. フォローアップ手続き
注:注射技術の精度を判断するには、上記のようにトリパンブルー染料を注入し、動物をすぐに安楽死させ(施設で承認されたプロトコルに従って)、椎弓切除術を実施して結果を視覚化します。
- 動物が麻酔下にある間に、致死量のペントバルビタールを腹腔内注射 で 150 mg / kgの用量で投与することにより、動物を安楽死させます。.
- 呼吸と心臓の活動が止まったら、胸腔を開いて死を確実にします。外科的切開部を背中から首まで伸ばします。
- 棘突起の両側で脊椎と平行に筋肉に4cmの長さの切開を行い、突起にできるだけ近づけます。
- 細い鉗子またははさみを使用して、棘突起の間から筋肉を取り除きます。
- ロンゲールを使用して、L6から下部胸椎までの棘突起を取り除きます( 材料の表を参照)。ねじる動きは、ロンジャーを損傷する可能性があるため、避けてください。
- ロンゲールの下端をL5椎弓板の下に挿入し、脊髄の上にある骨を何度か「噛む」ことで骨を取り除きます。
注:L6棘突起を後退させると、ロンジャーの先端を挿入しやすくなります。脊髄の損傷を防ぐために注意する必要があります。 - 椎弓切除術を少なくとも4つの椎吻側に拡大し続けます。ラミナの内面に、注入の失敗を示す可能性のある染料の兆候がないか調べます。
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結果
注射技術の精度を決定するために、染料であるトリパンブルーを治療薬の代用として使用した。この色素はタンパク質に容易に結合するため、通常、注入された構造内に留まります。これは、色素が治療薬の注射後の分布を正確に予測できない可能性があることを意味します。これは、単に注入の精度を明らかにするために使用されます。腰椎槽にうまく導入されると、トリパンブルーは硬膜に結合し、脊髄の周囲を青く染めます。しかし、針が硬膜を貫通できないと、染料は硬膜外腔に行き着きます。硬膜と周囲の組織(骨の表面と椎弓板をつなぐ靭帯と筋肉)の両方が青色に染色されます。これらのパターンは肉眼で簡単に見ることができます。
正しく投与された注射と誤って投与された注射の違いは、脊髄と脊柱を横方向に切断するだけで評価することは困難です。代わりに、L5 椎弓板から始まり、吻側に移動する rongeurs のペアを使用して椎弓切除術を行うことをお勧めします。その過程で硬膜を傷つけないように注意する必要があります。解剖顕微鏡を使用すると、このプロセスが容易になります。 図 1 ...
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ディスカッション
CNSにはさまざまな疾患が罹患しています。ウイルスベクターを介して関連遺伝子の機能的コピーを提供することは、脊髄性筋萎縮症など、本質的に劣性で単一遺伝子である患者にとって魅力的な治療戦略です。ただし、血液脳関門 (BBB) は、静脈内投与されるほとんどの遺伝子治療ベクターを除外します11。AAV9のようなBBBを通過できるものは、末梢形質導入によるベクター損失を克服するために高用量で投与しなければならない12。年齢も障壁です。種々のAAV血清型への環境曝露は、13 歳とともに増加し、しばしば治療用ベクター14を中和できる抗体の産生につながる。したがって、CNS障害に対する遺伝子治療ベクターの静脈内送達は、一般に乳児に限定されており、後年診断された患者には使用されません。
高齢の患者の場合、CSFへの直接ベクター注入は、BBB抗体と既存の抗AAV抗体の両方をバイパスして、CNSで広範な形質導...
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開示事項
Donsante博士は、AAV9ベクターのCSF投与に関する出願中の特許の発明者です。
謝辞
著者らは、幼若ラットが髄腔内注射に対してもたらす課題について生産的な議論をしてくれたUTサウスウェスタン大学のSteven Gray氏、Matthew Rioux氏、Nanda Regmi氏、Lacey Stearman氏に感謝します。この研究は、ジャガー・ジーン・セラピー(JLFK)からの資金提供によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 200 µLフィルター付きピペットチップ | MidSci | PR-200RK-FL | ピペッティングウイルス |
| AAV9-GFP | ベクタービルダー | P200624-1005ynr | GFPを発現するAAV9ベクター |
| ニードルコーティング付き吸収性縫合糸 Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 サークルリバースカッティングニードル サイズ 4 - 0 編組 | マッケソン | J422H | 縫合 |
| ベンチパッド | VWR | 56616-031 | 手術 |
| Braintree Scientific Isothermal Pads、8インチ x 8インチ | フィッシャーサイエンティフィック | 50-195-4664 | 体温を維持 |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | 鎮痛剤 |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | 徐放性鎮痛剤 | |
| 綿 | フィッシャーサイエンティフィック | 19-365-409 | 血液除去 |
| ドレープ、マウス、透明プラスチック、12インチ x 12インチ、接着剤付き 開窓 | Steris | 1212CPSTF | 外科用ドレープ |
| デュモン #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11251-20 | 鉗子 |
| 電気ブランケット | CVS Health | CVS Health Series 500 超長熱パッド | |
| Eppendorf Research plus、1チャンネルピペット、可変、20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | ピペッティングウイルス |
| ファインハサミ | ファインサイエンスツール | 14059-11 | 湾曲した手術用ハサミ |
| フリードマン・ピアソン ロンゲールズ | ファインサイエンスツール | 16121-14 | 椎弓切除術 |
| ハルゼー ニードルホルダー | ファインサイエンスツール | 12001-13 | ニードルドライバー |
| インスリンシリンジ ウルトラファインニードル付き 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | シリンジ |
| イソフルラン | マッケッソン | 803250 | 麻酔薬 |
| イソプロパノール ワイプ | フィッシャー・サイエンティフィック | 22-031-350 | 皮膚消毒 |
| リドカイン、1% | マッケソン | 239935 局所麻酔 | |
| 微量遠心チューブ:1.5mL | フィッシャー・サイエンティフィ | 05-408-137 | シリンジの装填 |
| ポビドンヨード | フィッシャーサイエンティフィック | 50-118-0481 | 皮膚消毒 |
| メスハンドル-#4 | ファインサイエンスツール | 10004-13 | メスブレードホルダー |
| シュアシール誘導チャンバー | ブレインツリーサイエンティフィック | EZ-17 | ボックス |
| 外科用ブレードミルテックス炭素鋼No.11滅菌使い捨て個別包装 | マッケソン | 4-111 | #11メスブレード |
| SYSTANENIGHTTIMEアイ軟膏 | コン | アイ軟膏 | |
| トリパン | 注射 |
参考文献
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