光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

サマリー

ここでは、光熱オフレゾナンスタッピング(PORT)による生体分子の相互作用を観察するためのイメージングプロトコルを示し、イメージングパラメータを最適化し、システム限界を特定し、3点スターDNAモチーフアセンブリのイメージングにおける潜在的な改善を調査しました。

要約

高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)は、液体環境の生理学的条件下でイメージングする能力があるため、単一分子の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化するための一般的な分子イメージング技術です。光熱オフレゾナンスタッピング(PORT)モードは、ドライブレーザーを使用してカンチレバーを制御して発振します。この直接カンチレバー作動は、MHz範囲で効果的です。PORTは、共振振幅ではなく時間領域の力曲線でフィードバックループを操作することと組み合わせることで、チップサンプルの力を直接制御しながら、最大10フレーム/秒の高速イメージングを可能にします。PORTは、繊細なアセンブリダイナミクスのイメージングと、生体分子によって形成されるパターンの正確なモニタリングを可能にすることが示されています。これまで、この手法は、この研究で示されたDNA 3点スターモチーフの集合パターンなど、さまざまな動的 in vitro 研究に使用されてきました。一連の実験を通じて、このプロトコルは、HS-PORT AFMイメージングシステムの最適なイメージングパラメータ設定と最終的な限界、およびそれらが生体分子アセンブリプロセスにどのように影響するかを体系的に特定します。さらに、特にスキャンが小さな領域に限定されている場合に、ドライブレーザーがサンプルや周囲の液体に引き起こす潜在的な望ましくない熱影響を調査します。これらの知見は、複雑な生体システムの研究におけるPORTモードの応用を前進させる貴重な知見を提供します。

概要

高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)は、急速に成長しているイメージング技術^です1,2,3,4。これは、研究者が生体分子の相互作用をリアルタイムで視覚化できる速度で動作します5,6,7,8,9。光熱オフ共鳴タッピング(PORT)は、ピークフォースタッピング^{10、11、パルス}フォースモード^12、13、またはジャンピングモード¹⁴と同様のオフ共鳴イメージングモードです。ただし、スキャナーを垂直に振動させるのではなく、PORTはカンチレバー(通常はクランプポイントの近く)に集束した励起レーザーを介してカンチレバーのみを垂直に振動させます。カンチレバーはバイモルフ効果により変形する:パワー変調励起レーザーは、カンチレバーとコーティング材料の異なる熱膨張係数のために曲がる被覆カンチレバーを周期的に加熱する¹⁵。カンチレバーとサンプルの加熱は、完全な正弦波ドライブ⁵を使用するのではなく、各振動サイクル中に定期的にオフにされてオンに戻るドライブレーザーを使用することで最小限に抑えることができます。

DNAは、生物学的に関連性があり、構造的に興味深く、生化学的に有用なモチーフを形成するために使用されてきた16,17,18,19,20。さらに、DNA構造は、AFMイメージング品質²¹を特徴付け、高速^AFM22の先端効果を評価するのに理想的に適していることが証明されています。平滑末端DNAスリーポイントスター(3PS)は、複雑な生物学的システムにおける同様の構造の分子の超分子組織を調査するためのプログラム可能なモデルシステムとして実用的になった¹⁹。これまで、平滑末端の三量体DNAモノマーによって形成された格子の自己組織化は、HS-AFM²³を介して追跡されていました。最終的には、これらは六角形の順序で大きなネットワークに編成されます。ここでは、DNAの自己組織化3点星¹⁹は、自己組織化およびその修正メカニズム²⁴を追跡するのに十分な速さでPORT技術を用いて画像化され、プロセスまたはサンプルの損傷の中断を最小限に抑えながら行われる。他のHS-AFMモードと同様に、達成可能なイメージング品質、イメージング速度、およびサンプルの望ましくない乱れとの間にはトレードオフがあります。適切な妥協点を選択することで、超分子集合体の自己組織化パターンをよりよく理解することができます。したがって、このプロトコルでは、DNA 3PSをモデルシステムとして同様のセットアップを使用して、PORTに固有のパラメータを最適化します。これにより、サンプルの損傷を最小限に抑えながら、十分な大きさのスキャンサイズで高速イメージング速度で操作できます。

プロトコル

1. サンプルとバッファー

注:この研究で使用されたDNAタイルは、パデュー大学のMao研究室で開発された3点星モチーフ^です19,25。この研究で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies, Inc.から購入しました。

1. アニーリングバッファー(5 mM TRIS、1 mM EDTA、および10 mM MgAc₂)で、一本鎖DNA(ssDNA)を1:3:3 mol比(S1 0.6 μM、S2 1.8 μM、S3 1.8 μM)で混合します。DNAモチーフの最終濃度は0.6μM(49 ng/μL、3PSの分子量は82020.3 g/mol)でなければなりません。
2. DNA溶液を耐熱容器に入れ、80°Cに加熱します。 DNA溶液を80°Cから20°Cまで4時間かけてゆっくりと冷却します。このアニーリングプロセスは、ssDNAオリゴヌクレオチドが目的の二本鎖DNAモチーフを形成するのを助けます。
3. 精製するには、アニールしたDNA溶液を3%アガロースゲルにロードして、余分なssDNAと不要な副産物を取り除きます。3%ゲルを60 Vで約2.5時間、0.5x Tris-Borate-EDTA(TBE)と10 mM Mg(CH₃COO)₂を含むランニングバッファーで分析します。
4. DNAモチーフを含むゲル上のバンドを特定し、位置を特定します。バンドがそのサイズに基づいて特定の位置に移行したことを確認します。
5. DNAモチーフを含むバンドをゲルから慎重に切除します。切除したゲルフラグメントからDNAモチーフを抽出し、ゲル抽出スピンカラムに入れ、3,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
6. 抽出したDNAモチーフのバッファーを、遠心濃縮器を使用してアニーリングバッファーに置き換えます。濃縮溶液が100 μL未満になるまで、室温(またはそれ以下)で3000 x g で遠心分離します。次に、300 μLのアニーリングバッファーを加え、この手順を2回繰り返して、バッファーが交換されていることを確認します。
7. イメージングのためにDNAモチーフを6 nMに希釈します。分光光度計またはその他の適切な方法を使用して、濃度を正確に決定および調整します。これで、DNAモチーフをイメージングする準備が整いました。
   注:プロトコル内のすべての緩衝液はpH 8.0です。3 つのそれぞれのバンドの配列情報は次のとおりです。
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACGの
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2.カンチレバーチップの成長

1. SEMカンチレバーホルダーへのカンチレバーの取り付け:カンチレバーが清潔で、汚染物質がないことを確認してください。カンチレバーをSEMシステムと互換性のある適切なホルダーに取り付けます。特注のカンチレバーホルダーのデザインは、ご要望に応じて共有することができます。
2. ガス注入:ガス注入システムで使用する前駆体ガス(例:アモルファスカーボンチップ用のフェナントレンC₁₄H₁₀ 前駆体)を加熱して、新しいチップを成長させます。真空が10^〜5 mbarを下回ったらすぐに、ガス注入ラインを10回2秒間パージして、ノズルラインに望ましくない残留空気がないことを確認します(これは、ガンチャンバーのバルブを閉じた状態で行う必要があります)。
3. 先端位置の調整:走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、カンチレバーの端を特定します。カンチレバーホルダーを、AFMカンチレバーホルダーに置いたときにカンチレバーが表面に対して示す角度と同等の角度(この場合は11°など)に傾けて、成長した先端がイメージング中に表面に対して垂直になるようにします。SEMの位置と焦点を調整して、カンチレバーの先端がはっきりと見えるようになり、そこで鋭いカーボンナノチップが成長します。
4. 集束電子ビーム誘起堆積法(FEBID):
   1. 選択したソフトウェア(この場合はSmartFIB)で、ビーム電流(I)と加速電圧(V)、作動距離(WD)、倍率、露光形状、線量/蒸着時間、滞留時間などの蒸着パラメータを設定します。以下のパラメータを使用して、AFMイメージングに良好な機械的特性を示すアモルファスカーボンチップを成長させ、約130 nmの長さと2〜4 nmの範囲の半径を実現しました。
      スポット/ドットを露出形状として選択
      WD=5ミリメートル
      I = 78 pA、V = 5 kV
      滞留時間 = 1 μs
      線量 = 0.05 nC、沈着時間 = 0.64 秒
      倍率= 20000x
   2. カンチレバーの先端に一点の電子ビームを照射すると同時に、前駆体ガスを注入し、堆積が完了したらガスを閉じることにより、チップを成長させるための堆積プロセスを開始します。この場合、SmartFIBソフトウェアは、上記のレシピを設定した後、これを自動的に実行します。
5. 成長後の分析:成長後のSEMイメージングを実行して、新しく成長したチップを検査し、その品質と特性(チップの半径と長さ)を確認します。チップの成長後1〜2分待って、SEMイメージング中の再堆積を避けるために、すべての前駆体ガスが送り出されていることを確認してください。サンプルホルダーをSEMチャンバーから取り外します。
6. カンチレバーリサイクル:SEMシステムに複合集束イオンビーム(FIB)も取り付けられている場合は、損傷した、または汚れた以前に成長したチップを、低FIB電流(カンチレバーの損傷を避けるために1 pAなど)を使用してFIBシステムでフライス加工することにより、取り除きます。先端の潰れを防ぐために、先端の端から基部まで断面形状でフライス加工して先端の取り外しを行います。これにより、新しいものを再成長させることができます。

3. HS-AFMハードウェア

1. 撮像装置は、特注のPORTヘッド^5、26(図1A)、マイカを上に乗せたサンプルディスクを備えた高速スキャナ²⁶、互換コントローラ²⁷、高速撮像に必要な高帯域幅の高電圧増幅器、AFMベース、および前述の装置²⁷を制御するために必要なソフトウェアを備えたPCで構成される。
   注:この場合、これらはオープンソースのコンポーネントであり、EPFL^27、28のバイオおよびナノインスツルメンテーション研究所から計画を入手できます。また、PORTヘッドとコントローラ²⁹の構築方法に関するワークショップに参加したり、LabViewベースのソフトウェアをダウンロードして使用したりすることも可能です。
2. ピンセットを使用して、カンチレバーホルダーのスプリングクリップの下に超短カンチレバー(AC10DSまたは同等品など)を慎重に配置します。カンチレバーチップが固定され、安定していることを確認します。
3. 図1Bに示すように、シリンジを使用して左の液体アクセスポートから50μLの液体を加えます。励起レーザーをオフのまま、図1Aに示すAFMヘッドの3つの専用ノブを使用して、読み出しレーザーをカンチレバーに合わせます。これを行うには、白い紙の上でカンチレバーの影を観察しながら、合計を最大化します(シャドウ法)。次に、2つの専用ノブを使用して、レーザースポットをフォトダイオードの中央に配置します。
4. 「Excitation VI」の「 Excitation Enable 」ボックスにチェックを入れてドライブレーザーのスイッチを入れ、位置を合わせると、カンチレバーが作動して発振します。カンチレバー励起信号とカンチレバーたわみ信号を、接続したオシロスコープに表示します。たわみ振動が小さすぎる(または存在しない)場合は、ドライブレーザーがカンチレバーから非常に離れている可能性があります。その場合は、シャドー方式を使用し、偏向レーザーをオフにしておくと位置合わせがしやすくなります。 図1Aに示す駆動レーザー調整ノブを使用して、発振振幅を最大化します。
5. PORTでカンチレバー振動振幅を調整するには、レーザーダイオード制御回路に送られたピークtoピーク電圧(以下、P-P-PAC入力)をソフトウェアの対応する制御にExcitation VIに入力します。レーザダイオードを伝導領域に保ち、したがってレーザを発振するには、レーザダイオード制御回路にDC電圧を追加します(以降、DCオフセット入力)が、これも励起VIの構成ボックスから行います。どちらもレーザー出力にも影響しますが、レーザー出力計で測定でき、カンチレバー振動振幅の調整に使用されます。
6. カンチレバーに適用できる最大光熱励起周波数を決定します。これは、カンチレバーの共振周波数より低くなければなりません。共振周波数は、サーマルチューンまたは周波数スイープによって決定します。この研究で使用されたカンチレバー(AC10DS)は、液体中の共振周波数が約400kHz(空気中1MHz)³⁰であり、300kHz5未満の準静的曲げ領域^{を持っています。}したがって、その制限を下回るPORT周波数(約100〜200 kHz)を使用する必要があります。
7. PORTレートとスキャンレートのイメージングパラメータと設定を、それぞれExcitation VisとScan Visで必要な値に調整します(この記事で使用されているパラメータは、図の説明に記載されています)。セットアップとイメージングパラメータを設定したら、必要なイメージング実験を行い、分子相互作用を観察および追跡します。
   注意: AC10DSカンチレバーは販売されなくなったため、同等のものが利用可能になるまで、FastscanDや^BioLever31 などの代替品を使用する必要がある場合があります。

4. 適切な交互作用曲線の取得

1. 最初に、接触モードに設定されたZコントローラVIのスタートをクリックして、接触モードでサンプル表面にアプローチします。
   1. このモードでは、AFMチップがサンプルに直接接触します。サーフェスに到達したら、Ramp VIで力対距離曲線を実行して、カンチレバーのたわみ感度キャリブレーションを取得します。
   2. また、カンチレバーのばね定数は、干渉計で取得したカンチレバープロバイダーの仕様(精度は低い)から、またはたわみ感度キャリブレーション後のサーマルチューンベースのキャリブレーションを通じて推定します。正確なカンチレバーキャリブレーションは、正確なチップサンプルの力制御に不可欠です。
2. ZコントローラVIの 「上 」をクリックして、先端が表面に届かない表面からZピエゾを完全に引っ込めた後、ZコントローラVIの PORT モードに切り替え、「励起VI」のチェックボックスで励起レーザーをオンにします。まず、AC10DSカンチレバーを使用して、Excitation VIで目的の周波数(この実験的なケースでは100 kHz)で動作するように PORT モードを設定します。
3. 片持ち梁のない振動を、表面に触れないように閉じて記録します。次に、記録する表面に接触しているZコントローラーのフィードバック をオンにして [ 修正 ]をクリックすると、カンチレバーが断続的に表面に接触しているときのカンチレバーの振動(両方ともナノメートル)が得られます。断続的な接触曲線から自由振動曲線を差し引いて真の相互作用曲線を求め、カンチレバースプリング定数(この場合は0.1 N/m)を使用してpNに変換します。

5. HS-AFMイメージング

1. Mg(CH₃COO)₂ の溶液を10 mMの濃度で調製します。ハミルトンシリンジを使用して、調製した10 mM Mg(CH₃COO)₂ 溶液50 μLをカンチレバーホルダーの流体チャネルに注入し、カンチレバーを包み込む液体の滴を生成します。
2. ZコントローラVIの スタート をクリックして、カンチレバーを徐々に表面に近づけます。サーフェスが検出されたら、フィードバック をONにし、 ORTフォースカーブVIで相互作用カーブのピークを見つけます。適切なトラッキングが可能な最小の力の設定値を見つけます(壊れやすいバイオサンプルの損傷を避けるために300 pN未満)。
3. 「スキャン」VIの 「スキャンサイズ 」を800 nm x 800 nmに、「 ラインレート 」を100 Hzに設定します。「スキャン」VIの 「フレーム 」(下)矢印をクリックしてサーフェスをスキャンし、サーフェスの品質を確認します。汚れが検出された場合は、続行する前に、表面、カンチレバー、および/またはカンチレバーホルダーを清掃して問題に対処してください。
4. スキャン後、ZコントローラVIの 引き出し をクリックして、カンチレバーを表面から引っ込めます。カンチレバーホルダーの穴からハミルトンシリンジで緩衝液を取り出し、デッドボリュームの問題を防ぎます。
5. プロトコールのパート1から希釈したDNA 3PS溶液を調製します。希釈したDNA 3PS溶液50 μLをカンチレバーホルダーの専用チャネルに注入します。
6. 手順5.2〜5.3を繰り返し、デフォルトのラインレート100Hz(256ライン×256ピクセル)で800nm×800nmの領域をスキャンして、イメージングプロセスを開始します。最初のスキャン後、Scan VIのイメージングサイズと速度を指定された値に調整して、さらにデータを取得できるようにします。
7. Z Controller VI の設定値 ボックスのチップとサンプルの相互作用の入力力の設定値を、イメージングプロセス全体で適切なトラッキングに必要な最低レベル(300 pN未満)に保ち、特に指定がない限り、サンプルの損傷/乱れを最小限に抑えます。必要なすべてのサンプル領域について、このプロセスを繰り返します。

6. 画像処理

1. カスタマイズされた Pygwy (Python for Gwyddion) バッチ処理コードを実行するための環境を設定し、Python と必要なすべてのライブラリを確保します。詳細については、GwyddionのWebサイト³² がシステムに適切にインストールされています。これにより、コードがスムーズに実行され、必要な機能にアクセスできるようになります。
2. カスタマイズした Pygwy バッチ処理コードを開きます(リクエストに応じて提供)。これにより、画像処理と分析に必要なツールと機能にアクセスできるようになります。
3. 画像処理を開始するには、画像に対して水平方向の中央線補正を実行します。このステップは、スキャンラインに存在する不規則性やアーティファクトを除去し、後続の処理ステップが正確なデータに基づいていることを確認することを目的としています。平面の背景を削除した後、線の補正を適用します。傷跡の除去を使用して、外部要因によって引き起こされる不要なマークや欠陥を排除することにより、画像をさらに強化します。この手順により、画像の全体的な外観が向上します。
4. カラーハイトマップを調整することで、画像の視認性とコントラストを高めます。これにより、関心のある特徴が明確に視覚化され、画像内で目立つようになります。
5. 動画に結合する必要のある処理済みの画像を選択します。ビデオの目的のフレームレートを決定します。この場合は、7 フレーム/秒 (fps) に設定します。
6. 各フレームのデュレーションを計算します。フィジー(ImageJ)を使用して、処理された画像をビデオに結合します。フレームレートとフレーム時間が正しく設定されていることを確認します。

結果

本研究では、HS-PORT AFMの能力を利用して、DNAの3点星モチーフの安定な島への動的集合過程を観察することに成功しました。この技術により、これらの構造の組み立てをリアルタイムでキャプチャすることができました。 図2A、Bでは、100 kHz PORTレート(800 nm x 800 nmスキャンサイズ)で、それぞれ100 Hzと200 Hzのラインレートで鮮明な画像スキャンが行われています。これは、ピクセルあたりそれぞれ3.9回と1.95回の発振サイクルに相当します。ただし、PORTレートを同時に増加させずに高速でイメージングすると、ピクセルあたり最低1回の発振サイクルが可能になるため、 図2C (ピクセルあたりの発振サイクルは0.78)に見られるように、画質が大幅に低下します。イメージング速度は、カンチレバーが適切なチップサンプル力制御で表面をプローブする速度によって制限されます。これは、地形の変化速度が速すぎて表面サンプリングレートで追跡できなくなるためです。

十分に高いPORTレートを設定することに加えて、PORT曲線に力を制御するために必要な情報が含まれていることが重要です。特に流体力学的抗力と低い検出帯域幅は、加えられた力を不明瞭にする可能性があります。 図3 は、サンプルの表面からさまざまな距離でのカンチレバーのたわみと励起周波数率を、ノイズを低減するための平均4096曲線を使用して示しています。 図 3A (100 kHz PORT レートの場合) と 図 3D (500 Hz PORT レートの場合) の青い曲線は、カンチレバーが表面から離れて自由に振動する(1 回の振動サイクル中に表面に触れない)場合のカンチレバーの動きを表しています。赤い曲線は、カンチレバーが表面の近くで振動し、断続的に表面に接触してサンプルをプローブするときのカンチレバーのたわみを示しています。真の交互作用曲線、つまりチップとサンプルの交互作用を求めるために、赤の曲線から青の曲線を差し引いて、 それぞれ図3B、Eを求めます。非破壊バイオサンプルイメージングに必要な明確な相互作用曲線の例を 図3Bに示します。この構成により、 図 3C に示す良好なイメージング品質が得られ、PORT レートは 100kHz です。カンチレバー共振に近づくにつれて励起周波数を上げると、励起レーザー出力を上げた後にカンチレバーが表面から離れるほどの振幅振動を示しても、ある時点でフィードバック制御が劣化します(図3E)。PORT周波数がカンチレバー共振周波数に近すぎると、カンチレバー共振によりカンチレバーダイナミクスの時間応答が制限されます。したがって、カンチレバーの曲がりは、チップとサンプルの相互作用を正確に表さなくなり、得られる相互作用曲線が不明瞭になります。これにより、 図3Fに示すように、画質が低下します。

より高いPORT周波数での相互作用曲線の低下は、現在商用高速AFMカンチレバーの制限要因の1つである高周波数³³での作動効率の低下によっても発生する可能性があります。この減少は、最終的にロールオフの閾値レベルに達し、適切なイメージングが妨げられます:振動振幅が表面から離れるには不十分であり、先端が常に接触しているため、サンプル構造が損傷する可能性があります。PORTレートが高くなると発生する振幅の減少を打ち消すために、レーザー出力の増加を検討しました。この効果をよりよく観察するために、より高いレーザー出力に到達できるPORTヘッドを使用しました。励起レーザーのレーザー出力は、パワーメーターで測定し、DC成分とAC成分に分けました。総電力は、レーザーダイオード制御回路に送られるピークtoピーク電圧(ピークtoピークAC入力)とDC電圧(DCオフセット入力)をソフトウェアで調整することにより制御されます。 図4A は、ピークtoピークAC入力の増加に起因するピークtoピークカンチレバー発振振幅を示しています。予想通り、発振振幅はAC入力値とよく相関しています。これらのピークツーピーク振幅は、PORTイメージングで通常使用される振幅よりも大きいことに注意することが重要です。壊れやすいサンプルをイメージングする場合、AC振幅は10〜30nmのオーダーです。 図4B は、DCオフセット入力が増加した場合のピークtoピークのカンチレバー発振振幅を示しています。ピークtoピーク発振振幅は、DCオフセット電圧範囲にわたってほぼ一定に保たれます。この小さな変動は、検出の非線形性に起因すると考えています。 図4C は、ピークtoピークACの増加によるACおよびDCレーザーパワーコンポーネントの増加を示しています。 図4D は、DC入力オフセットの増加によるACおよびDCレーザーパワーコンポーネントの増加を示しています。

ピークtoピークAC入力とDCオフセット入力の増加による影響を別々にテストして、総電力と発振振幅に対するそれぞれの影響を決定しました。レーザー出力の増加は、おそらく温度上昇によってサンプルを混乱させますが、振動振幅の増加^{はサンプル5}への衝撃力を増加させます。 図4Cに示すように、ピークtoピークAC入力のみを増加させると、レーザー出力の合計増加への影響が少なくなり、 図4Aに示すように、カンチレバー振動の振幅(ひいては衝撃力)が主に増加します。DCオフセット入力を増やすと、 図4Dに示すように、レーザー出力の増加に大きな影響を与え、サンプルを加熱しますが、 図4Bに示すように、たわみ振幅への影響はごくわずかです。イメージング結果を 図4E、Fに示します。 図4E は、最も低いピークtoピークAC入力(左の画像、青丸で囲んだ部分)と最も高いピークtoピークAC入力(右の画像、赤丸で囲んだ部分)のDNA 3PSを示しています。これは、おそらくより高い力によってサンプルが損傷する結果です。 図4F は、構造が損傷している最小のDCオフセット入力(左の画像、青の丸で囲んだ部分)と最も高いDCオフセット入力(右の画像、赤の丸で囲んだ部分)のDNA 3PSを示しています。

図1:HS-AFMのセットアップ(A)スキャナーとAFMのベースのPORTヘッド、(i)カンチレバーの読み出しレーザーフォーカスを調整するためのノブ、(ii)カンチレバー上の読み出しレーザー位置を調整するためのノブ、(iii)フォトダイオード上のレーザーの水平位置を調整するためのノブ、(iv)フォトダイオード上のレーザーの垂直位置を調整するためのノブ、 (v)カンチレバー上の光熱駆動レーザーの位置を調整するためのノブ。(B)サンプルステージのあるヘッドの断面図でのカンチレバーのクローズアップ、(vi)はカンチレバーを保持しているスプリングクリップです。液体注入用のチャネルは赤でマークされています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:AC10を使用して100 kHz PORTレートで、異なるラインレートで画像化されたDNA 3PSサンプル(A)100 Hz(ピクセルあたり3.9振動サイクル)、(B)200 Hz(ピクセルあたり1.95振動サイクル)、および(C)500 Hz(ピクセルあたり0.78振動サイクル)。画像は350pN以下の設定値で撮影されました。スケールバー200nm。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:100KHzおよび500kHzのPORTレートでのカンチレバーのたわみ、相互作用曲線、および画質。 (A)カンチレバーのたわみ(カンチレバーが表面に接近しているが表面に接触していない状態のカンチレバーの自由な振動を青色で、カンチレバーが表面に断続的に接触しているときのカンチレバーの振動を赤色)、(B)相互作用曲線、(C)100kHz PORTレートでのそれぞれの画質。(D)カンチレバーのたわみ(カンチレバーの自由な振動が表面に近いが接触していない青色、カンチレバーが表面に断続的に接触しているときのカンチレバーの振動を赤色)、(E)相互作用曲線、(F)500kHzポートレートのそれぞれの画質。画像は100Hzのラインレートで撮影されました。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ピークツーピークAC入力電圧DCオフセット入力電圧の影響。 カンチレバーのピークtoピーク発振に対する(A)ピークtoピークAC入力電圧と(B)DCオフセット入力電圧の増加の影響。(C)ピークツーピークAC入力電圧と(D)DCオフセット入力電圧の増加がACおよびDCレーザー出力に及ぼす影響。最小(青丸)と最大(赤丸)の画像品質(E)ピークツーピークAC入力電圧と(F)DCオフセット入力電圧。ピークtoピークAC入力電圧を増加させると、DCオフセット入力電圧は600mVに維持されました。DCオフセット入力電圧を増加させると、ピークtoピークAC入力電圧は200mVに維持されました。高出力構成では、サンプルの完全性が損なわれます。PORTレートは100kHz、ラインレートは100Hzに保たれ、スケールバーは200nmに保たれました。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

デリケートな生体試料をイメージングする場合、AFMのオフレゾナンスタッピングイメージングモードは、先端と試料の相互作用力¹⁰を直接制御できるため、特に有用である。その中でも、PORTモードは、より高い発振率に到達できるため、より高いスキャンレートが可能になるという点で際立っています。PORTは直接かつレーザーでカンチレバーを作動させるだけなので、特に高共振周波数^の超短カンチレバーを使用する場合、従来のオフレゾナンタッピングモードよりもはるかに高い周波数での励起が可能です5。ただし、HS-AFMにPORTを使用する場合は、良好なイメージング品質を実現するために、イメージングパラメータに注意する必要があります。

図2に示すように、PORTレートを同時に上げずにスキャンレートを上げると、イメージングの品質が低下します。まず、PORTレートによりピクセルあたり1回の発振サイクルが減少すると、画質が大幅に低下します。イメージング速度は、カンチレバーが適切なチップサンプルの力制御で表面をプローブする速度によって本質的に制限されます。PORTでは、フィードバック制御は、各発振サイクル³⁴の終了時に離散的に動作する。この制限されたサンプリング・レートにより、フィードバック・ループに純粋な遅延が生じ、達成可能なフィードバック帯域幅が制限されます。トポグラフィーの変化率が速すぎて PORT サンプリング レートで追跡できなくなった場合、フィードバック ループでトポグラフィーを正確に検出または追跡できなくなります。したがって、より高い表面速度でサンプルを忠実に分離するには、PORTレートを上げる必要があります。ただし、カンチレバーの共振周波数は、使用できる最大PORTレートを本質的に制限します。PORTレートがカンチレバーの共振周波数に近い場合、光学レバー法で測定されたたわみは、先端サンプルの力を忠実に表さなくなります。適切なチップ-サンプル相互作用曲線を得るには、カンチレバーの機械的帯域幅とAFMシステムの電気的帯域幅の両方が、PORT周波数の数倍の偏向曲線のフーリエ成分を検出するのに十分な大きさである必要があります。これらの帯域幅のいずれかが低すぎると、相互作用曲線は片側のカットオフ(図3A)ではなく、実際のチップサンプルの相互作用(図3E)を不明瞭にする正弦波の動作(図3D)を示します。これにより、イメージングの力制御が不十分になります(図3F)。したがって、高い共振周波数を示すさらに小さなカンチレバーは、同時に低いばね定数を持っているため、PORTレートをさらに増加させる必要があります。このような高いPORTレートとスキャン速度は、AFMエレクトロニクスにとって課題であり、必要な高帯域幅と最適化されたデジタル信号処理戦略を特徴とする慎重なソフトウェアと電子設計が必要です。

タッピングモードの高速AFMと比較したPORTの利点の1つは、表面のサンプリング速度を調整できることです。タッピングモードAFMでは、表面サンプリングレートはカンチレバーの共振周波数によって与えられます。カンチレバー共振周波数をはるかに下回るPORTで動作する場合、各表面サンプリングが有効なデータポイントを提供すると仮定します。そのため、PORT検出帯域幅は、PORTレートの半分のナイキスト周波数によって与えられます。タッピングモードの場合、検出帯域幅はf₀/2Q³⁵で与えられます。PORTの最新の開発により、PORTレートを共振周波数まで徐々に上げることができます。このような状況では、 図3Eに示すように、PORTはカンチレバーとチップの相互作用を正確に検出できないため、PORTとタッピングモードはほぼ同じになります。共振周波数で動作する場合、タッピングモードに比べてPORTの発振振幅が大きいことがデメリットとなります。したがって、PORTイメージングレートを向上させるための目標は、カンチレバー共振周波数を上げて、PORTレートが共振周波数を十分に下回る状態での動作を維持することです。

PORTレートを上げてスキャンレートを高速化すると、光熱カンチレバー励起に固有の別の問題に直面することになります:高周波では、光熱励起効率の低下により発振振幅が減少し、最終的にはレーザー出力を増やす必要があるほどになり、サンプルの温度が上昇します。PORTレートを大きくすると、サンプルの損傷につながる作動効率の低下を補うためにより高い励起パワーが必要になるため、レーザー出力と振動振幅のバランスが崩れます。レーザー出力が高レベルになると、可能な限り低い力の設定値( 図4E、Fの右側のパネル)を使用したにもかかわらず、サンプルを観察できなくなりました。カンチレバーの振動振幅をどのように増加させ、レーザー出力を増加させるかに注意する必要があります。レーザー出力を上げるために調整できるパラメータは2つあります。まず、レーザーダイオードに送られる正弦波信号を制御して、供給されるレーザー出力強度を正弦波的に変化させるピークツーピークAC入力です。次に、レーザーダイオードを伝導領域に保ち、したがって発振するDCオフセット入力電圧。レーザーに送られるAC信号の振幅の増加は、レーザーの閾値を超えないようにDC電圧の増加を必要とするため、最初の増加は2番目の増加と組み合わせる必要があります。ただし、 図4Aに示すように、カンチレバーの発振振幅に影響を与えるのはピークtoピークAC入力のみです。DC電圧は発振振幅の変動をもたらさない(図4B)。したがって、正弦波の作動が必要な場合は、DC電圧をダイオードレーザーが発振領域になれる最小電圧に設定する必要があります。あるいは、完全な正弦^波駆動5を使用するのではなく、各発振サイクル中にレーザーダイオードを定期的にオフにしてからオンに戻すことにより、加熱を最小限に抑えることができます。光熱励起でカンチレバーを作動させるために必要な温度振動は、サイクルの一部でレーザーをオフにすることでより効率的に到達でき、カンチレバーの温度が下がるため、カンチレバーが曲がります。これにより、カンチレバーとサンプルに供給されるエネルギーが最小限に抑えられ、周囲の全温度が低下し、サンプルの熱損傷が軽減されます。

この研究では、熱サンプルの損傷を防ぎ、適切なフィードバック制御を行うためのHS-PORTのイメージングパラメータの限界を示します。これらの制限を理解することで、PORT AFMメソッドの現在の状態を最大限に活用し、チップとサンプルの相互作用をより適切に制御し、これらの測定でDNAモチーフのネイティブ状態を維持するのに役立ちます。高いスキャンレートと良好なフィードバック制御により、PORTはDNA 3PSとその相互作用^7,8,36の鮮明で詳細な画像を取得することを可能にしました。イメージング速度の向上と直接的なチップ-サンプル力制御²³の可能性により、生体分子集合体の成長と再編成をより正確に追跡し、詳細なダイナミクスを観察することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AC10DS	オリンパス	BL-AC10FS-A2	販売終了
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	電気泳動 ユニット
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	アニーリング用サーモサイクラー
カスタムAFMセットアップ	バイオナノ計装用研究室、インターファカルティバイオエンジニアリング研究所、工学部、エコールポリテクニークFédéローザンヌ		、バイオナノ計装
EDTA	ITW試薬	A5097	アニーリングバッファーレーザー
パワー	メーターThorlabsPM100D		デジタルハンドヘルド光学 パワー&エネルギーメーターコンソール
活気ある 3AP 電源, MP-310	メジャーサイエンス	MP-310	電気泳動電源
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	インアニーリングバッファー
TBE	サーモサイエンティフィック	327330010	電気泳動用ランニングバッファー
TRIS	Bio-Rad	1610719	インアニーリングバッファー