排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

Summary

我々は、 アシネトバクター・バウマニの遺伝子操作された排出不全株に、mini-Tn7ベースの発現系を用いて、排出ポンプ遺伝子の単一コピー染色体相補のための簡単な手順について述べる。この精密な遺伝学的ツールにより、多剤耐性病原体における排出ポンプの特性評価の鍵となる遺伝子発現を制御することができます。

Abstract

アシネトバクター・バウマニは 、抗生物質に対する耐性が広範囲に及ぶため、困難なグラム陰性病原体として認識されています。この耐性の背後にあるメカニズムを理解することは、新しく効果的な治療法の選択肢を設計するために重要です。残念なことに、 A. baumannii のこれらのメカニズムを調査する私たちの能力は、適切な遺伝子操作ツールの不足によって妨げられています。本稿では、染色体mini-Tn7系を利用して、機能的なRND型排出機構を欠く A. baumannii 株の単一コピー遺伝子発現を実現する方法について述べる。高コピー数プラスミド上のRND排出オペロンの存在は、細菌細胞による忍容性が低いことが多いため、単一コピー挿入および誘導性排出ポンプ発現は非常に有利です。さらに、排出感受性を高めた組換えmini-Tn7発現ベクターを代理宿主A . baumannii の染色体に組み込むことで、他の排出ポンプからの干渉を回避することができます。このシステムは、特性不明の細菌排出ポンプの調査だけでなく、これらのポンプを標的とする潜在的な阻害剤の有効性を評価するためにも有用です。

Introduction

アシネトバクター・バウマニは 、すべてのクラスの抗生物質に対する包括的な耐性により、世界保健機関(WHO)の最優先病原体^です1。これは、主に入院、負傷、または免疫不全の人々に影響を及ぼす日和見病原体です。 A. baumannii は、排出ポンプ を介して 抗生物質を主に回避しており、最も関連性が高いのは、耐性結節部(RND)ファミリーの輸出業者^です2。これらの排出ポンプが機構的にどのように機能するかを理解することで、標的を絞った治療オプションを開発することができます。

細胞プロセスを特異的に区別できる一般的な方法の1つは、遺伝子操作によるものです。しかし、A. baumanniiの遺伝子研究に利用できるツールは限られており、実験デザインをさらに混乱させるために、臨床分離株は、遺伝子操作の選択に日常的に使用される抗生物質に耐性を持つことがよくあります³。排出ポンプを具体的に研究する際に遭遇する2つ目のハードルは、排出ポンプが厳密に規制されており、多くの場合、未知の要因によって規制されているため、機能を正確に分離して^{単一のポンプに}帰属させることが困難であることです4。研究ツールボックスを拡張する必要性を認識し、選択^{マーカー5,6,7}の除去を可能にするFlpリコンビナーゼターゲット(FRT)カセットを組み込んだ、ミニTn7ベースの単一コピー挿入誘導性発現システムを開発しました(図1)。シュードモナス^8,9,10のために最初に作成されたこのエレガントなクローニングおよび発現システムを使用して、A. baumanniiのRND排出ポンプ欠損株(ATCC 17978::ΔadeIJK、Δ adeFGH、ΔadeAB:以下、A. baumannii AB258と呼ぶ)にシングルコピー排出ポンプ補体を生成し、¹¹.一度に1つの排出ポンプを研究し、(プラスミドベースの発現システムで一般的に見られるように)高コピー発現で細菌細胞を圧倒しないため、干渉を最小限に抑え、合併症を減らしながら、各排出ポンプの重要な生理学的側面についてよりよく学ぶことができます。

本稿では、mini-Tn7システムを使用して、^{9日間にわたって}実行される一連の単純なステップを通じて、A. baumannii AB258の染色体に目的の欠失遺伝子であるRND排出ポンプadeIJKを補完する方法について説明します7。最初の一連のステップでは、十分に保存されたglmS遺伝子(図3A)の下流の単一のattTn7挿入部位に、mini-Tn7ベースの挿入プラスミド(図2A)にクローニングされた欠失排出ポンプ遺伝子を再導入します。このプロセスは、Tn7駆動の挿入に必要なトランスポザーゼ遺伝子をコードする非複製性ヘルパープラスミド(図2B)によって促進されます。第2のステップでは、切除プラスミド(図2C)を使用して、FRT部位(図3B)に隣接するゲンタマイシン遺伝子をFlpリコンビナーゼ媒介で除去し、マークのない株を作製します。このシステムは、抗生物質耐性に関するRND排出ポンプの本質的な役割と可能な阻害剤を解明するために使用されますが、目的の遺伝子を調べるために使用できます。

Protocol

1. 実験準備

1. プラスミドpUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (挿入プラスミド、 図2A)を目的の遺伝子で精製します。
   注:ここで、目的の遺伝子は adeIJKです。最終的なプラスミド濃度は ≥100 ng/μL です。
2. ヘルパープラスミド(pTNS2)⁹ および切除プラスミド(pFLP2^ab)⁶ (それぞれ図 2B、C)を、理想的には最終プラスミド DNA 濃度 ≥100 ng/μL になるまで精製します。
3. 50 mLの滅菌超純水と25 mLの滅菌LB(Lennox)ブロスを調製します( 材料表を参照)。
4. プレーン(添加物なし)、ゲンタマイシン(Gm)(50 μg/mL)、カルベニシリン(Cb)(200 μg/mL)(アンピシリン耐性遺伝子 による 選択用)、および5%スクロース( 材料表を参照)を添加した、最低10 LB寒天プレートを調製します。
5. LB寒天への挿入に使用する菌株をストリークし、37°Cで16〜18時間インキュベートします。 ここでは、 A. baumannii AB258を使用します。
   注:このプロトコルは、ベンチまたは生物学的安全キャビネットでブンゼンバーナーを使用して、可能な限り無菌環境で実行する必要があります。すべての消耗品(ピペットチップ、接種ループ、マイクロチューブなど)は滅菌済みである必要があります。

2. 培養の準備

1. A. baumannii AB258 の単一コロニーを、滅菌済み 13 mL 培養チューブ内の 4 mL の LB ブロスに、滅菌済み接種ループまたは滅菌済みの木製接種スティックを使用して接種します。
   注:1 つのサンプルと 1 つのコントロールに 1 つの 4 mL 培養物を使用します。必要なサンプル数に応じて培養数を増やします。
2. 37°Cで振とう(250rpm)しながら一晩インキュベートします。
3. 滅菌蒸留水(25〜50 mL)のボトルを4°Cで一晩置き、ステップ3で使用します。

3. エレクトロコンピテントセルの作製

1. すべての滅菌済み 1.5 mL マイクロチューブ(培養ごとに 2 本)および滅菌済みエレクトロポレーションキュベット(培養ごとに 2 本)を氷上に置きます( 材料表を参照)。手順全体を通して、サンプルを可能な限り氷上に保管してください。
2. 4°Cで保存した滅菌水のボトルを氷の上に置きます。
3. 1.5 mLの一晩培養した細菌を1.5 mLのマイクロチューブの1つに移します。
4. 13,000 x g で2分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   注:遠心分離は4°Cで行うのが理想的ですが、常温での遠心分離は許容範囲であり、有害ではありません。
5. 1 mLのピペットを使用して、細胞ペレットを乱すことなく上清をすべて除去します。
6. さらに1.5 mLの細菌培養液を同じマイクロチューブに加えます。13,000 x g で2分間遠心分離し、上清をすべて除去します。
7. 残りの1 mLの培養液で、最後にステップ3.6をもう1回繰り返します。
8. 細胞ペレットに氷冷滅菌水1 mLを加え、ペレットがマイクロチューブの底に留まらなくなるまで、穏やかなピペッティングで再懸濁します。
9. 再懸濁した細胞を13,000 x g で2分間遠心分離します。
10. 1 mLのピペットを使用して上清を慎重に除去します。上清は、特に細胞があまりコンパクトでないペレットを形成する傾向があるその後の洗浄ステップでは、注がないでください。
11. この洗浄ステップを氷冷滅菌水で、ステップ3.8からステップ3.10までさらに2回繰り返します。
12. 最終細胞ペレットを200 μLの氷冷滅菌水に静かに再懸濁します。
13. 最終細胞懸濁液100 μLを2本目の氷冷1.5 mLマイクロチューブに移します。この 2 番目のアリコートは、エレクトロポレーションのネガティブコントロールになります。細胞サンプルを氷上に保管してください。

4. エレクトロポレーション

1. 各サンプルについて、1 mLのLBブロスと1枚のLB + Gm⁵⁰ 寒天プレート(ステップ1.4で調製)を予熱し、37°Cに設定した静的インキュベーターでコントロールします。
2. 合計容量が5 μL以下で、pTNS2ヘルパープラスミドとpUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK挿入プラスミドをそれぞれ100〜200 ngのエレクトロコンピテントセルのアリコートに添加します。
3. 指先で軽く叩いて混合し、気泡を発生させることなくプラスミドとエレクトロコンピテントセルを完全に混合します。
4. 等量の滅菌蒸留水をネガティブコントロールセルのアリコートに加え、上記のように穏やかに混合します。
5. サンプルを氷上で20分間インキュベートします。
6. 細胞サンプル全体を氷冷エレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットを氷上に戻します。ネガティブコントロール細胞サンプルについて繰り返します。
7. 細胞サンプルをエレクトロポレーションします。
   1. エレクトロポレーターの電源を入れ、2.0 kV(25 μF、200 Ω)に設定します( 材料表を参照)。
   2. キュベットの表面を柔らかいティッシュで拭いて、付着した氷や湿気を取り除きます。
   3. キュベットをエレクトロポレーターに挿入し、電気ショックを与えます。
   4. ただちに0.9 mLの予熱したLBブロスをキュベット内の細胞に加え、静かに上下にピペットで移り、細胞を培地と混合します。
   5. 細胞懸濁液全体を新しい1.5 mLのマイクロチューブ(室温)に移します。
   6. エレクトロポレーターの時定数値を確認してください。最良の結果を得るには、この値を 4 から 6 の間に設定する必要があります。
8. ネガティブコントロール細胞サンプルについて、エレクトロポレーション手順(ステップ4.7.1〜ステップ4.7.6)を繰り返します。
9. エレクトロポレーションしたサンプルを37°C、250rpmで1時間インキュベートし、細胞を回収します。
10. 接種スプレッダーを使用して、エレクトロポレーションした各細胞サンプル100 μLを、予め加温したLB +^{Gm 50} 寒天プレートに広げます。
    1. 残りのサンプルを13,000 x g で2分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    2. ピペットを使用して上清をすべて除去した後、細胞を100μLのLBブロスに再懸濁します。
    3. 各サンプル全体を、予熱した個々のLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートに広げます。
       注:エレクトロポレーション効率はひずみに依存する場合があります。初めて菌株をエレクトロポレーションする場合、エレクトロポレーションサンプルの異なる容量または希釈液をプレーティングして、得られたプレートに単離されたコロニーがあることを確認することは有益です。
11. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。

5. PCRベースのスクリーニングのための形質転換コロニーの選択

1. エレクトロポレーションプレートを確認してください。ネガティブコントロールにはコロニーがあってはなりません。サンプルには明確なコロニーが必要です。
   注:コロニーのあるプレートは、このステップおよびコロニーまたはパッチを含む寒天プレートが製造される後続のすべてのステップで、4°Cで最大3日間保存してから続行できます。
2. 滅菌爪楊枝を使用して、LB + Gm⁵⁰ 寒天プレートから最大10個の単一コロニーをピックアップし、それらを新しいLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートにパッチします。
3. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。

6. コロニーPCRによる染色体挿入の確認

1. パッチを当てたコロニーを含むLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートをインキュベーターから取り出します。
2. 滅菌済みつまようじまたは滅菌ピペットチップを使用して、パッチから少量(大きなコロニーのサイズ程度)を取り出し、0.2 mL PCRチューブ内の滅菌蒸留水20 μLに入れます。よく混ぜます。水サンプルは、細胞がつまようじから放出されると、目に見えて濁るはずです。スクリーニングが必要なサンプルはいくつでも準備できますが、6つで十分です。
3. 細菌懸濁液を含むPCRチューブを100°Cで5〜10分間インキュベートします。
4. ミニ遠心分離機( 材料表を参照)を使用して、サンプルを固定の最高速度で2分間回転させ、細胞破片をペレット化します。
5. 上清を新しい0.2 mLのPCRチューブに移し、氷上に置いてください。このサンプルには、PCR反応用のテンプレートDNAが含まれています。
   注:このテンプレートDNAは、PCRを進める前に-20°Cで保存できます。
6. 1x ポリメラーゼバッファー、200 μM dNTP、0.18 μM ABglmS2_F_New フォワードプライマー、0.18 μM Tn7R リバースプライマー(表1)、1 U の Taq DNA ポリメラーゼ、および調製したテンプレート DNA 1 μL を総容量 25 μL で調製した PCR 反応混合物を調製します。 テンプレートDNA以外のすべてを含む非テンプレートコントロール(NTC)を調製します( 材料表を参照)。
7. 反応条件をサーマルサイクラーに入力します:95°Cで2分間。95°Cで30秒、49°Cで30秒、72°Cで30秒、合計35サイクル。72°Cで10分間;12°C保持。サンプルを実行します。
8. 最終濃度が1倍になるようにDNAローディング色素を添加した後、各PCR反応液10 μLを2%アガロースゲルにロードし、80 Vで40分間泳動します。このプライマーペアの予想されるアンプリコンサイズは 382 bp です。NTCにはバンドがあってはなりません。
9. 期待されるPCR産物を産生したサンプルを特定します。PCR陽性パッチのいずれかからLB + Gm⁵⁰ 寒天プレート上にストリークプレートを調製します。37°Cで16〜18時間インキュベートします。目標は、このマークされた菌株を保存するためのグリセロールストックの調製と、マークされていない菌株(以下で説明)を作成するための出発点として、単一のコロニーを有するプレートを生成することです。

7. pFLP2^abを用いたGm Rマーカーの除去

1. ステップ2:培養の準備に記載されている手順に従ってください。一晩培養を調製するために使用したサンプルは、ステップ6.9で離散コロニーを生成するように調製したLB+^Gm50 寒天プレートからの単一コロニーである。
2. ステップ3:エレクトロコンピテントセルの準備に記載されている手順に従ってください。エレクトロポレーションのために一晩培養した細胞を調製します。
3. ステップ4:エレクトロポレーションに記載されている手順に従います。ここで、細胞に導入するプラスミドはpFLP2^ab (100-200 ng)であり、ゲンタマイシン耐性遺伝子を除去し、染色体に挿入された目的の遺伝子に隣接します。
4. 細胞が1時間回復した後(ステップ4.9)、エレクトロポレーションした細胞サンプル100 μLを予熱したLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレート(ステップ1.4で調製)に広げます。この選択圧により、pFLP2^ab 切除プラスミドを有する細胞のみが増殖します。
5. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
6. プレートにコロニーがないか確認してください。ネガティブコントロールプレートにはコロニーがあってはなりません。LB + Cb²⁰⁰ 寒天サンプルプレートには、明確なコロニーが必要です。
7. 滅菌爪楊枝を使用して、最大20個の単離されたコロニーをLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレートおよびLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートにクロスパッチします。
8. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
9. プレートにパッチがないか確認します。LB + Cb²⁰⁰ 寒天プレート上では増殖するが、LB + Gm⁵⁰ 寒天プレートでは増殖しないクローンは、元のインサートからゲンタマイシン耐性遺伝子が除去されています。
10. カルベニシリン耐性でゲンタマイシンが感受性のあるパッチを選択し、5%(w/v)スクロースを添加して、pFLP2^ab プラスミドを細菌から強制的に排出する個々のLB寒天プレートにストリーキングします。最大10個のコロニーを選択します。
11. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
12. コロニーのプレートを確認します。
13. pFLP2^ab プラスミド損失の最終確認として、クロスパッチ4〜6個のコロニーを5%スクロースプレートからLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレートおよびLB寒天プレートに単離しました。
14. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
15. LB寒天プレート上で増殖しており、このマークのない株を保存するためのグリセロールストックの調製にカルベニシリン感受性であるクローンを選択してください。
    1. マークされていない株の遺伝的検証は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を標的とするプライマーを使用して、コロニーPCR(ステップ6:コロニーPCRによる染色体挿入の確認)で行うことができます。
    2. 1x ポリメラーゼバッファー、200 μM dNTP、0.18 μM Gm_F フォワードプライマー、0.18 μM Gm_R リバースプライマー(表1)、1 U の Taq DNA ポリメラーゼ、および調製したテンプレート DNA 1 μL を総容量 25 μL で調製した PCR 反応混合物を調製します。 鋳型DNA以外のすべてを含む非鋳型コントロール(NTC)を調製し、 マークされた株からのDNAを使用したポジティブコントロール。
    3. 反応条件をサーマルサイクラーに入力します:95°Cで2分間。95°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで40秒、合計35サイクル。72°Cで10分間;12°C保持。サンプルを実行します。
    4. 最終濃度が1xになるようにDNAローディング色素を添加した後、各PCR反応液10 μLを1%アガロースゲルにロードし、80 Vで40分間泳動します。このプライマーペアの予想されるアンプリコンサイズは 525 bp です。ポジティブコントロールには 1 つのバンドが必要です。サンプルとNTCにはバンドがあってはなりません。

Results

染色体挿入手順は、選択的寒天プレート上で結果コロニーが成長するのを見るために、3日間で合計2時間しかかかりません(図1A-C)。形質転換プレート上のコロニーの予想数はひずみに依存します:attTn7部位へのTn7の挿入が特異^{的で効率的であるため}、20〜30個、さらには数百個のコロニーが見られる場合があります9。形質転換プレートコロニーを選択培地にパッチングすると(図4A)、形質転換株が保存され、コロニーPCRスクリーニングの出発物質が得られます(図1Eおよび図4B)。PCRによるコロニーのスクリーニングは最低10コロニー以下処理する必要があり、ほとんどは挿入のための肯定的な結果をもたらすべきである最低に保つことができる。スクリーニングプライマー ABglmS2_F_NewおよびTn7R(表1)のPCR産物は382 bpです(図4Bレーン4)。反応のネガティブコントロールには、野生型 A. baumannii ATCC 17978(図 4B レーン 2)、AB258(図 4B レーン 3)、およびテンプレートなし(図 4B レーン 5)が含まれます。PCR陽性のコロニーは、補完されたマークされた株を表します。

ゲンタマイシン耐性遺伝子の除去(マーキング解除)は、切除プラスミドで形質転換した細胞を選択的プレーティングによって選択し、切除プラスミドを細菌から硬化させる必要があるため、3時間未満、6日間で完了します(図1F)。Flp-FRT組換えベースの切除は正確かつ効果的であり、形質転換プレート上に≥20コロニーが得られるはずです。カルベニシリン(切除プラスミドによって付与されるβ-ラクタム耐性を選択)およびゲンタマイシン(ゲンタマイシン耐性の喪失を探す)にクロスパッチされたコロニーは、すべてそれぞれカルベニシリン耐性およびゲンタマイシン感受性である必要があります。.切除プラスミドは、5%スクロース寒天プレート上で増殖することにより、細菌から押し出されます。プラスミド上のsacB遺伝子がスクロースの細菌に有毒な多糖類であるレバンへの変換を促進するため、スクロースでの増殖は細胞にpFLP2^abを排除するように強制します^12,13。5%スクロース培地で増殖するすべてのコロニーは、プレーンLB寒天プレートでのみ増殖する必要があります。カルベニシリン寒天プレートでは成長があってはなりません。プレーンLB寒天プレート上で成長するコロニーは、マークされていない株を表します。ゲンタマイシンマーカーの消失の確認は、Gm_FプライマーおよびGm_Rプライマーを用いたコロニーPCRによって達成することができる(表1および図5)。このプライマーペアは、ポジティブコントロールでのみ525 bpのアンプリコンを生成します(最初に作成されたマークされた株、図5レーン4)。野生型 ATCC 17978(図 5 レーン 2)、AB258(図 5 レーン 3)、試験したコロニー(図 5 レーン 5)、およびテンプレートなしのコントロール(図 5 レーン 6)では、増幅は見られません。

マークされていない菌株が確認されたら、表現型アッセイで機能テストを開始できます。シプロフロキサシンはAdeIJKの既知の基質であり、テトラサイクリンはAdeIJKによって除去可能であり(主要な排出ポンプはAdeABである)、カナマイシンはA. baumannii ATCC 17978 ^2,14に比較的小さな効果をもたらす。CLSIガイドライン¹⁵に従ったブロス微量希釈法を用いて、補完された非標識株AB258::adeIJKを、50μMのIPTGの非存在下および存在下で各抗生物質で試写した。野生型ATCC 17978株およびRND排出欠損株AB258を対照として含めた(表2)。全体として、MIC値に見られる傾向は、排出ポンプの発現が誘導されたシプロフロキサシンおよびテトラサイクリンに対するAB258::adeIJKの感受性の低下が予想されることを物語っており、adeIJKの挿入が成功したことを裏付けています。

図1:手順の概要。 (A)補完する A. baumannii 菌株の一晩培養液を調製する。(B)一晩培養した細胞を遠心分離 により 水で3回洗浄し、氷上に保持します。(C)デリバリープラスミドとヘルパープラスミドを細胞に添加し、氷上で20分間インキュベートします。サンプルをエレクトロポレーションし、LB培地を添加し、細胞を37°Cで1時間回収します。 100 μLの細胞アリコートをLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。(D)形質転換プレートからのコロニーをLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートにパッチし、37°Cで一晩増殖させる。 (E)パッチを当てたコロニーは、染色体挿入部位にまたがる増幅産物の存在をスクリーニングするためにPCR用に調製される。PCR増幅は、アガロースゲル電気泳動によって可視化されます。PCR陽性サンプルは、染色体への目的の遺伝子の挿入に成功し、マークされた株の作成を表します。(f)ゲンタマイシン陽性のコロニーをステップ(A〜C)のように調製し、pLFP2^ab プラスミドをエレクトロポレーションして、染色体挿入部からゲンタマイシンカセットを除去する。LB + Cb²⁰⁰ 寒天への選択的プレーティングにより、プラスミドの取り込みが確認されます。LB + Cb²⁰⁰ および LB + Gm⁵⁰ 寒天プレートに重複パッチを適用すると、Cb^R および Gm^S のコロニーが明らかになり、挿入によるゲンタマイシンカセットの喪失が確認されます。5%スクロース上で選択されたCb^R コロニーを増殖させると、細胞由来のpLFP2^ab プラスミドが硬化します。5%スクロースプレートからのコロニーをLB +^{Cb 200} 寒天およびLB寒天にパッチして、目的の^{Cb S} およびGm^S コロニーを明らかにし、マークされていない株の生成を確認します。Gm⁵⁰、ゲンタマイシン(50 μg/mL);Cb²⁰⁰、カルベニシリン(200 μg/mL); ^R、耐性があります。 ^S、センシティブ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:このプロトコルで使用されるプラスミド。 (A)pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm(挿入プラスミド)、(B)pTNS2(ヘルパープラスミド)、および(C)pFLP2^ab (切除プラスミド)の一般的なプラスミドマップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:挿入とマーキング解除の概略図。 (A)挿入。A. baumannii染色体における単一のTn7挿入部位は、glmS2遺伝子の末端から24 bpの位置にある。挿入プラスミドとヘルパープラスミドの同時エレクトロポレーションにより、目的の遺伝子(挿入された遺伝子、紫色)と残りの挿入カセット(マーカー切除用のFRT部位、黄色;ゲンタマイシン耐性のaccC1遺伝子、緑;lacIq遺伝子を誘導性発現させ、青色)を染色体に挿入する。(b) マーキング解除。pFLP2^ab excision プラスミドで補完されたマークされた挿入株をエレクトロポレーションすると、Flp-FRT 組換え(FRT 部位、黄色)によるゲンタマイシン耐性遺伝子(accC1、緑)の除去が容易になり、マークのない株が形成されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:コロニーPCRによる形質転換、パッチング、挿入の確認。 (A)パッチング後の形質転換コロニーの増殖、(B)染色体挿入を確認するためのABglmS_F_New(灰色)およびTn7R(オレンジ色)プライマーによるコロニーPCR増幅の代表的な結果。レーン1:低分子量DNAラダー;レーン2:ATCC 179798;レーン3:AB258;レーン4:AB258::adeIJK-LAC-Gm;レーン 5: テンプレートなしのコントロール。382 bpの予想帯域がラベル付けされています。ゲンタマイシン特異的プライマー(Gm_FおよびGm_R、緑色)は、染色体挿入を確認するためにも使用できることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:コロニーPCRによるマーカーの喪失の確認。ゲンタマイシン特異的プライマー(Gm_FおよびGm_R)を用いてコロニーPCR増幅を行い、pFLP^abベースの切除による抗生物質マーカーの喪失を確認した代表的な結果。レーン1:低分子量DNAラダー;レーン2:ATCC 179798;レーン3:AB258;レーン4:AB258::adeIJK-LAC-Gm;レーン5:AB258::adeIJK;レーン 6: テンプレートなしのコントロール。525bpの予想帯域がラベル付けされています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

菌株、プラスミド、プライマー	関連する特性	参考
汚す
A. baumannii (A. バウマニ) ATCCの17978	タイプひずみ	ATCCの
A. baumannii (A. バウマニ) ATCC 17978 AB258	ΔadeAB、ΔadeFGH、ΔadeIJK	11
プラスミド
pUC18T-miniTn7T-GM-LACの	GmR、アンプR	9
pUC18T - miniTn7T - GM - LAC - adeIJK	GmR、アンプR、 adeIJK	この研究
pTNS2型	アンプR	9
pFLP2アブ	pWH1266 起点または複製、sacB、AmpR	7
プライマー	配列(5'-3')
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
TN7R(テニセブンアール)	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	この研究
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	この研究

表1:このプロトコルで使用される細菌株、プラスミド、およびプライマー。 Gm、ゲンタマイシン;アンプ、アンピシリン; ^R、耐性があります。

	シプロフロキサシン		テトラサイクリン		カナマイシン
IPTGの	−	+	−	+	−	+
ATCCの17978	0.250	ndの	0.500	ndの	1.5	ndの
AB258型	0.031	ndの	0.063	ndの	4	ndの
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
折り曲げ変更		4.01		4.03		0.25

表2:抗生物質感受性による挿入遺伝子の機能性の試験。A. baumannii ATCC 17978、AB258、非誘導AB258::adeIJK、およびIPTG誘導AB258::adeIJKのシプロフロキサシン、テトラサイクリン、およびカナマイシンに対する最小発育阻害濃度(MIC)値の比較。倍率変化=誘導(+ IPTG)/非誘導(−IPTG);nd = 未定。

Discussion

A. baumanniiにおける誘導性単一コピー遺伝子発現系の染色体挿入のこの手順は、技術的には簡単で労働集約的ではありませんが、強調する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、培地を氷冷水で置き換える際に細胞が壊れやすくなるため、コンピテントセルの調製は可能な限り氷上で行う必要があります。遠心分離ステップは4°Cで行うのが理想的ですが、室温での遠心分離でも構いません。水洗い中の細胞の脆弱性が高まることを考えると、穏やかなピペッティングも重要です。第二に、エレクトロポレーションはイオンの存在に敏感です。細胞を複数回のペレット化で洗浄し、水に再懸濁することで、培地が完全に除去されます。また、プラスミドは新たに精製し、プラスミドDNA濃度が十分に高い限り、標準キット溶出バッファー(通常はTEバッファー)で溶出できます。100 μLの細胞懸濁液に<5 μLのプラスミドを添加して、サンプルのイオン強度を非常に低く保つことを目指していますが、最大10 μLまで許容する必要があります。第三に、添加された抗生物質の有効性を確保するために、必要に応じて選択的寒天プレートを準備する必要があります。カルベニシリンは、切除プラスミドpFLP2^abの形質転換中の選択のために、通常のアンピシリンの代わりに使用されたことに注意してください。A. baumanniiは、アミノペニシリン(アンピシリン)に対して本質的に耐性があります¹⁶。カルボキシペニシリン(カルベニシリン)を置換することで、プラスミドにコードされたβ-ラクタマーゼによる継続的な選択が可能になります。

実験プロトコルの最適化はより微妙で、 アシネトバクター の異なる種(または同じ種内の遺伝子操作された株)と、おそらく実験室で使用される特定の試薬によって異なります。例えば、エレクトロポレーションに使用される電圧は1.8〜2.5 kVの間で変化し、PCRに使用されるDNAポリメラーゼに応じてサーモサイクリング条件をわずかに変更する必要がある場合があります。エレクトロポレーション後の細胞の増殖が不十分であるかどうかを検討するのに役立つヒントには、寒天プレート中のゲンタマイシンの濃度を50 μg/mLから30 μg/mLに減らすこと、および/または寒天プレートのインキュベーション時間を≥24時間に延長することが含まれます。ゲンタマイシンカセットを除去する手順については、10%スクロースを含むLB寒天プレートを使用したり、カルベニシリン耐性が持続する場合は30°Cで≥24時間インキュベートしたりすると、より良い結果が得られる可能性があります。

エレクトロポレーションで使用するためのA. baumannii細胞の調製法は数多く文献に見られますが、多くの場合、最初の一晩培養後の継代培養ステップと、その後、所定の光学密度までの長い増殖段階が含まれます。私たちは、シンプルな一晩の培養も同様に効果的に使用できることを発見しました。A. baumanniiのエレクトロポレーションはよく説明されており、読者はここでプロトコルのこの特定の側面についてさらに洞察を得ることができます^17,18。プラスミドベースの相補系と比較したこのmini-Tn7染色体遺伝子相補系の主な利点は、IPTG制御可能なlacI^qリプレッサーシステムを介して相補遺伝子の発現レベルを調節する能力と、ゲンタマイシンマーカー(aacC1遺伝子)を次の方法で除去する選択です。隣接するFRTサイト。排出ポンプの発現に対する細胞の耐性は、挿入されたポンプによって異なることが観察された。例えば、細胞はAdeABCやAdeFGHと比較して、AdeIJKの発現に対してより感受性があります。これは、培養条件中のIPTGの濃度を変更することで対処できます。抗生物質マーカーを除去すると、絶え間ない選択圧による菌株の突然変異リスクが軽減され、抗生物質感受性の調査も無制限に可能^{になります3。}

このミニTn7システムは、シュードモナス^9,10、エルシニア⁹、バークホルデリア¹⁹、キサントモナス²⁰、およびアシネトバ^{クター5,6,21,22}種で成功裏に使用されていますが、いくつかの制限があります。例えば、A. baumanniiでは、ゲノム⁵に機能的なatt Tn7挿入部位が1つしかないため、複数の欠失で株を作ることができますが、一度に補完できる遺伝子は1つだけです。また、このシステムはグラム陽性菌に対して有効であることはまだ証明されていません¹⁰。

RND排出ポンプは、 A. baumanniiの抗生物質耐性の重要な促進因子です。それらを非常に強力にしているのは、内膜と外膜にまたがる3つの部分からなる構造であり、ペリプラズムから細胞外への抗生物質の除去を可能にします。最も研究され、ユビキタスなRNDポンプ(AdeABC、AdeFGH、およびAdeIJK)は、すべてのクラスを網羅する抗生物質を排除することが示されています。排出ポンプの機能を詳細に解明することは、多剤耐性株に対する新しい治療法を設計するための良い出発点となります。AB258トリプルRNDポンプ欠失株を使用し、一度に1つのポンプを補完することで、各ポンプを他のポンプから独立させて研究し、それぞれに固有の基質プロファイルと最も効果的な阻害剤を識別することができます。もちろん、排出ポンプは、細菌の正常な機能において「日常的な」役割も果たしています。これらの役割を理解することは、ポンプの間接的な機能不全につながり、その結果、抗生物質の排出が妨げられ、多剤耐性菌が再び一般的に使用されている抗生物質に感受性を持つようになる可能性があります。 一般に、mini-Tn7システムは、詳細な研究や有用なマーカーのために目的の遺伝子、例えば顕微鏡イメージング用の蛍光タンパク質を導入するために使用することができる⁶。

多剤耐性菌の蔓延は、私たち全員にとって懸念事項です。 A. baumannii のような病原体における排出ポンプによる防御メカニズムを理解することは、重篤な感染症と闘うために重要です。この染色体シングルコピー遺伝子発現システムは、機構研究や排出ポンプ機能を阻害する阻害剤の同定のための強力なツールです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCRチューブ	VWR	20170-012	コロニーボイル調製およびPCR反応用
1.5 mLマイクロチューブ	Sarstedt	72-690-301	一般用
13 mL培養チューブ、Pyrex	Fisher	14-957K	液体培養容器
6x DNAローディングバッファー	Froggabio	LD010	アガロースゲル電気泳動 サンプルローディング色素
酢酸酸、氷河	フィッシャー	351271-212	アガロースゲルランニングバッファー成分
寒天	バイオショップ	AGR003	固体成長培地
アガロース	バイオベーシック	D0012	PCR反応産物の電気泳動分離; 0.8&ndashの濃度で使用;2%
アガロースゲル電気泳動ユニット	フィッシャー	29-237-54	アガロースゲル電気泳動;PCR反応産物の分離
カルベニシリン	フィッシャー	50841231	選択培地
培養チューブクロージャー	フィッシャー	13-684-138	13mL培養チューブ用ステンレス製クロージャー
デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)セット	バイオベーシック	DD0058	PCR反応成分;各dATP、dCTP、dGTP、dTTPとして100mMとして供給されます。各dNTP
ドライバス/ブロックヒーター	フィッシャー	88860023	イソテンプデジタルドライバス(沸騰調製用)
エレクトロポレーションキュベット	VWR	89047-208	2 mmエレクトロポレーションキュベット(ラウンドキャップ付き
エレクトロポレーター	コール・パーマー	940000009	110VAC、60Hzエレクトロポレーター
チジウムブロマイド	フィッシャーBP102-1		アガロースゲル中のPCR反応産物とDNAマーカーの可視化
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	VWR	CA-EM4050	アガロースゲルランニングバッファー成分
ゲンタマイシン	バイオベーシック	GB0217	選択培地の調製用
グリセロール	フィッシャー	G33	超低温冷凍庫での長期保存用細菌ストックの調製
インキュベーター(振とう)	ニューブランズウィック科学	M1352-0000	セラE24インキュベーターシェーカー液体培養成長イン
キュベーター(静的)	フィ	ッシャー11-690-550D	イソテンプインキュベーターオーブンモデル550D固体(LB寒天)培養成長用
接種ループ	Sarstedt	86.1562.050	天プレートへの縞
種スプレッダーSarstedt		86.1569.005	広がり寒天プレートへの培養
Lysogenyブロス(LB)ブロス、レノックス	フィ	ッシャーBP1427	液体増殖培地(20 g/L:5 g/L 塩化ナトリウム、10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母抽出物)
マイクロフュージ	フィッシャー	75002431	Sorvall Legend Micro 17(サンプルの遠心分離用
) ミニ遠心分離	機 フィッシャー	S67601B	0.2mL PCRチューブの遠心分離
	SPL ライフサイエンス	10090	固体成長培地(寒天プレート)の場合:90 x 15 mm
ピペット	マンデル	各種	ギルソンシングルチャンネルピペット(P10、P20、P200、P1000)
電源	Biorad	1645050	PowerPac 電気泳動用基本電源
プライマー	IDT	NA	PCR反応成分;対象遺伝子に特異的;100 μ製品仕様書に記載されている
スクロー	BioBasic	SB0498	からの pFLP2ab プラスミドを除去するための対抗選択培地の調製
サーマルサイクラー	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
			供給されるポリメラーゼ
つまようじ	フィッシャー	S24559	寒天プレートへのコロニーのパッチング用
トリズマベース	Sigma	T1503	アガロースゲルランニングバッファー成分
超純水	ミリポアシグマ	ZLXLSD51040	ミリキュー水製造装置:培地・溶液調製、細胞洗浄用の超純水
ワイドレンジDNAマーカー	バイオベーシック	M103R-2	アガロースゲル上のPCR産物のサイズ決定
木製の接種スティック	フィッシャー	29-801-02	寒天プレートからのコロニーによる培養物の接種