方法論記事

穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備

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DOI：

10.3791/66479

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2024年5月24日

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1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

この記事について

サマリー

止血血栓形成のための穿刺創傷手順がここで紹介されています。形成された血栓は大きく、直径は数百ミクロンです。したがって、ボリュームイメージングアプローチが適切です。私たちは、多くの人が利用できる高解像度のアプローチとして、モンタージュされた広域透過型電子顕微鏡法を提案し、準備プロトコルを詳述します。

要約

止血は、血管の損傷を正常な生理学的に制御するプロセスであり、人間の生活の基本です。私たちは皆、時々小さな切り傷や刺し傷に苦しんでいます。止血では、自己制限的な血小板凝集により、構造的な血栓が形成され、外部から穴を塞ぐことで出血が止まります。この構造を詳細に特徴づけることで、止血と血栓症の区別が生まれる可能性があり、血小板が過剰に凝集して閉塞性凝固を引き起こすケースです。ここでは、止血栓の内部を視覚化する薄切片電子顕微鏡の能力を利用した、穿刺創血血血構造へのイメージングベースのアプローチを紹介します。イメージングベースの実験プロトコルの最も基本的なステップは、良好なサンプル調製です。このプロトコルは、その後の電子顕微鏡検査のためにマウスの穿刺創と多血小板血栓を準備するための詳細な手順を提供します。形成穿刺創血栓の in situ 固定と、その後の電子顕微鏡法のための染色および埋め込みのための処理について、詳細な手順が示されています。電子顕微鏡は、シーケンシャルセクショニングと組み合わせることで、血栓内部の詳細を高解像度で視覚化できるため、エンドイメージング技術として紹介されています。イメージング法として、電子顕微鏡は偏りのないサンプリングと、2次元または3次元でナノメートルからミリメートルにスケーリングする実験出力を提供します。穿刺創血栓断面全体のナノメートルスケールのイメージングを提供するために数百のフレームをブレンドできる広域電子顕微鏡をサポートする適切なフリーウェア電子顕微鏡ソフトウェアが引用されています。したがって、画像ファイルの任意のサブ領域を、完全な断面のコンテキストに簡単に配置できます。

概要

出血停止につながる穿刺創血栓の形成は、人生で最も重要なイベントの1つです1。しかし、その本質にもかかわらず、血栓形成中に構造的に何が起こるかについての知識は、それが静脈、動脈、アテローム性動脈硬化症、または閉塞性血栓のいずれであっても、解像度とイメージングの深さによって制限されてきました。従来の光学顕微鏡は、Z1で200〜300μmの完全に形成された穿刺創血栓と比較すると深さが限られており、血小板オルガネラのサイズとその間隔と比較すると分解能レベルは30nm2未満であることが多いです。2光子光学顕微鏡は、必要な深度のイメージングを得ることができますが、解像度は大幅に向上しません。光学顕微鏡法の最新の進歩、例えば超解像技術は、実際にはXYで~20nm、Zで2倍と分解能に限界があり、深さも従来の光学顕微鏡と変わらない程度です。さらに、超解像光学顕微鏡は、多くの研究用光学顕微鏡と同様に、蛍光顕微鏡法に基づいており、この技術は、良好な抗体が存在するか、または良好なタグ付き構築物3の候補タンパク質の小さなセットに本質的に偏っています。結論として、従来の走査型電子顕微鏡は、せいぜい形成中の多血小板血栓の表面を視覚化することができます。

血栓構造の特性評価におけるこれらの技術的限界を克服するために、私たちは3つの目標を持っていました。まず、マウスの静脈または動脈に明確な穿刺創を再現性よく作製し、その後、化学的固定によって その場で 容易に安定化させることができます。次に、形成血栓内の個々の血小板の位置を定義するという目的と一致する目標である、膜の保存を強調する準備手順を適用します。第三に、1枚の画像でナノメートルからミリメートルスケールまでスケールアップできる偏りのない可視化技術を使用します。

モンタージュされた広域電子顕微鏡法が主要なエンドイメージング技術として選ばれたのは、電子顕微鏡イメージングでは、細胞内の膨大な数の特徴が見られ、細胞小器官とその細胞小器官内の特徴の輪郭が描かれているからです。リボソームなどの小さな物体を認識することができます。この範囲の特徴は、電子顕微鏡法でコントラストを生成するために使用される電子密度の高い重金属染色剤、ウラニル、鉛、およびオスミウムが広範囲の分子に結合するために見られます。電子顕微鏡の画像では、そこにあるものの多くが見えますが、免疫蛍光法やタンパク質標識法のアプローチでは、光るものしか見えません。これは、例えば、所与の個々のタンパク質種上に存在する抗原部位を意味する。タグ付き分子(多くの場合はタンパク質)の場合、そのタンパク質が存在する部位です。他のすべての分子は暗く、点灯していません。しかし、この電子顕微鏡の選択は実用的ですか?穿刺創血栓のサイズは 300 x 500 μm で、ピクセル サイズが 3 nm の場合、100,000 x 167,000 ピクセルの画像になります。高品質の電子顕微鏡カメラは、4000 x 4000ピクセルです。つまり、1つの画像を得るには、約1000フレームをステッチ/ブレンドする必要があります。これは、過去15年間に製造されたほとんどの電子顕微鏡に存在していた可能性です。顕微鏡ステージはコンピュータ化されており、コンピュータで画像をつなぎ合わせることができます。これが、提示された議定書の策定の基礎となる選択につながった理論的根拠です。

結論として、マウスの静脈または動脈に再現可能な創傷を与える一連のステップを以下に示します。その後、 in situ 固定ステップとその後の埋め込みステップをたどると、nmスケールのモンタージュ広域透過型電子顕微鏡で視覚化でき、実際の in situ スケールのスケールであるmmスケールに近いmmスケールで視覚化されたスティッチド画像で視覚化できます固定血栓。この種のスケーラビリティは、血栓形成を血液学/健康の問題として、また血小板が主要な細胞型である発生生物学システムとして理解するために必要である。これらの進歩は、電子顕微鏡法の大きな長所、つまり、光るものだけでなく、そこに何があるかを見ることをもたらします。シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBF-SEM)のサンプル調製に関する詳細なプロトコルについては、Joshiらによる最近の論文4を参照してください。

プロトコル

実験は、アーカンソー医科学大学の動物管理・使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されました。ここでは、8〜12週齢の野生型オスとメスのC57BL/6マウスを使用しました。これらのマウスは、脂肪の蓄積がほとんどない若年成人です。同じ手順が、フォン・ヴィレブランド因子や血小板糖タンパク質VI(GPVI)5,6など、止血に重要なさまざまなタンパク質のマウス変異体にも適用できます。使用されるすべての機器、手術器具、試薬、およびその他の材料は、図1に示され、材料表に記載されています。

1. 頸静脈・大腿動脈穿刺創 1,7

  1. マウスの麻酔
    1. マウスを誘導チャンバーに置き、イソフルラン気化器を高流量設定(500 mL/分、3%イソフルラン)に回します。イソフルランが選択されるのは、血管の直径にほとんど影響を与えないためです。
      注意:イソフルランに長期間さらされると、健康に悪影響を与える可能性があります。.低流量気化器、麻酔ガス捕捉キャニスター、および良好な室内換気を使用すると、曝露を大幅に減らすことができます。
    2. マウスが眠っているように見える場合は、マウスのつま先をつまんで、マウスが反応するかどうかを確認します。その場合は、マウスを誘導チャンバーに数分間戻してから、ピンチテストを再試行してください。マウスが反応しない場合は、加熱プレート(以前はアルミホイルで覆われていた)の仰向けの位置に置きます。
    3. 気化器を低流量(100 mL / min、1.75%イソフルラン)に下げます。マウスの鼻をノーズコーンに置きます。各手足を伸ばし、小さな粘着テープでテープで留めます。
    4. 直腸温プローブを挿入し、温度コントローラーで温度を37°Cに設定します。プローブが誤って引き抜かれないように、温度プローブコードをテープで留めます。
  2. マウス切開
    1. バリカンを使用して、マウスの首と胸(頸静脈の場合)または右脚の内側(大腿動脈の場合)を剃ります。毛皮の切り抜きはアルコールパッドで拭き取ります。必要に応じて、バリカンでもう一度その領域を覆い、残っている毛皮を取り除きます。
    2. 新しいアルコールパッドでその部分をもう一度拭いて、すべての切り抜きを取り除きます。エリアができるだけきれいであることが非常に重要です。つま先をつまんで麻酔の手術面を確認します。
    3. はさみと鈍い鉗子を使用して、右頸静脈の上の皮膚を持ち上げて切ります。頸静脈と周囲の組織の一部を露出させるのに十分な大きさの皮膚の丸い窓を切ります。
  3. 頸静脈の洗浄(大腿動脈にも同じ原理が適用されます)
    1. 鈍解剖技術を使用して、脂肪とリンパ節、および結合組織をそっと脇に押します。
      注:このステップでは、容器の周りの一般的な清掃が行われます。ただし、頸静脈がパラホルムアルデヒドで24時間固定された後、顕微鏡下で慎重かつ徹底的な洗浄が行われます。
    2. 20 mLシリンジに、37°Cに温めた生理食塩水を入れます。 シリンジをシリンジ輸液ポンプに入れます。27Gバタフライニードルと関連するチューブをシリンジに取り付けます。
    3. シリンジポンプの流量を0.5mL/minに設定します。生理食塩水の穏やかな流れは、穿刺された静脈/動脈から血液を洗い流します。生理食塩水の流れを穿刺部位の真上ではなく、穿刺部位の側面に数mm配置します。
  4. 頸静脈/大腿動脈の穿刺
    1. タイマーを開始します。頸静脈には30Gの皮下注射針(公称直径300μm)、大腿動脈には33Gの皮下注射針(直径200μm)を装着します。より小さな針を使用すると、高圧の動脈状況では出血時間がわずかに長くなります。
    2. ベベルを上に向けて回します。針を頸静脈/大腿動脈に対して25°の角度で配置します。時間をメモします。
    3. 容器の上部のみを貫通するようにして、容器にすばやく穴を開けます。容器の底にも穴を開けないように注意してください。出血が完全に止まる時間に注意してください。
    4. 灌流固定を開始する前に、血栓形成を得るための適切な時間(図2A)を待ちます(すなわち、血栓発生のさまざまな段階を得るために1、5、10、または20分のいずれか)。放血によって動物を安楽死させるか、安楽死に関する地域の施設ガイドラインに従ってください。
  5. 経心灌流固定の実施
    1. 手術が始まる前に蠕動ポンプをセットアップします。50 mLコニカルチューブ2本を試験管ラックに入れます。頸部穿刺研究のために、カコジル酸ナトリウム緩衝液(0.2 Mカコジル酸ナトリウム、pH 7.4 の塩化 0.15 M ナトリウム)で調製した 4% パラホルムアルデヒド固定液を 1 つのチューブに充填し、もう 1 つのチューブにカコジル酸ナトリウム緩衝液を充填します。
      注:ここで詳述されている条件は、頸静脈の低圧の場合には十分であり、その後、動脈の高圧の場合には変更されます。動脈、すなわち大腿動脈を用いた高圧系研究では、パラホルムアルデヒド固定剤に0.1%グルタルアルデヒドを補充し、外部点滴固定と灌流固定を併用します。
    2. ポンプチューブの取り込み端を緩衝液の入ったチューブに入れます。27Gバタフライニードルと関連チューブをポンプチューブの出力端に取り付け、ニードルを清潔なビーカーに入れます。
    3. ペリスタルティックポンプの流速を10 mL/minに設定します。灌流ポンプをオンにします。
    4. 緩衝液が針からビーカーに流れ始めたら、ポンプをオフにしてください。これで、チューブと針が経心灌流のために準備されました。
    5. 解剖はさみと鈍い鉗子を使用して、胸骨の上部から胸骨の底を数ミリメートル過ぎて皮膚に正中線を切開することにより、胸腔を露出させます。胸郭の基部に沿って、正中線から開始し、両側の内側から外側に切断する横切開を行います。
    6. 経心灌流を開始する直前に、胸郭を素早く切り開き、両側を反射させて心臓を露出させます。
    7. 蠕動ポンプをオンにします。27Gバタフライニードルの先端を左心室の基部に配置します。
    8. 針を左心室に固定したまま、鋭利な解剖ハサミで右耳介にスリットを切って血液と灌流液を流出させます。タイマーの時刻をメモします。
    9. 緩衝液で3分間灌流し、循環器系から血液を洗い流します。針を左心室に固定したまま、蠕動ポンプの電源を切り、蠕動ポンプチューブの取り込み端を固定液を含む50mLチューブに移動します。.
    10. タイマーの時刻をメモします。蠕動ポンプを再度オンにし、固定液で7分間灌流します。蠕動ポンプをオフにします。
    11. 左心室から針を取り出し、廃棄物ビーカーに入れます。ポンプチューブの取り込み端を蒸留水のビーカーに入れます。
    12. ペリスタルティックポンプをオンにし、約20 mLの水をチューブを通って27G針から廃棄物ビーカーに流し、チューブを清掃します。ポンプをオフにする前に、必ずすべての水がチューブと針から出るようにしてください。

2. 電子顕微鏡用試料の採取

  1. 大腿動脈穿刺創の場合、最初の2分間の外部固定剤を補充した灌流固定後、穿刺部位と血栓を含む頸静脈/大腿動脈の部分を慎重に解剖します(図2A)。鋭利なハサミで、血管セグメントの遠位端を横切って斜めに切り込みを入れ、血管セグメントの近位端を横切ってまっすぐに切り込みを入れます。
    注:この方法でカットを作成すると、後で血管の向きを変え、血管内の血流の方向を特定するのに役立ちます。
  2. 容器セグメントを新鮮な室温の4%パラホルムアルデヒドにカコジル酸ナトリウム緩衝液(0.2 Mカコジル酸ナトリウム、0.15 M塩化ナトリウム、pH 7.4)に浸し、室温で1時間放置します。
  3. 固定組織を4°Cに24時間移します。翌日、厚さ~5mmのシリコンマット(メーカーの指示に従って事前に準備)を含む35mmの培養皿を取ります。十分な量のカコジル酸ナトリウム緩衝液を皿に注ぎ、固定静脈セグメントを沈めます。
  4. 光学顕微鏡(~15倍倍)で観察しながら、緩衝液の入った35mmディッシュに組織を慎重に移し、ステンレス製の微細ピンと細い鉗子を使用して、容器の両端をシリコンマットに固定します。
  5. 頸静脈/大腿動脈セグメントを、マイクロハサミと非常に細い鉗子を使用して慎重に清掃します。
    1. 頸静脈のみの場合:ピンの1つを取り外し、マイクロハサミを使用して、穿刺/血栓部位の反対側の血管壁を縦に切ります。.容器をそっと開き、4〜5本のピン(それぞれワイヤーカッターで半分にカット)を使用して、管腔内面を上にしてシリコンマットに固定します。
  6. 緩衝液を吸引し、カコジル酸ナトリウム緩衝液中の1%パラホルムアルデヒド溶液とすばやく交換し、皿に蓋をします。ティッシュを乾かさないでください。常に液体に浸しておいてください。
  7. 組織を電子顕微鏡で処理する時期になるまで、組織を4°Cで保存します(図2B)。頸静脈/大腿動脈穿刺創傷サンプルの一部をSBF-SEM4によるイメージング用に処理し、その他をWA-TEM 8,9によるイメージング用に処理します。WA-TEM の手順については、以下で詳しく説明します。
    注意:ホルムアルデヒド、プロピレンオキシド、OsO4、および2,4,6-トリス(ジメチルアミノメチル)フェノール(DMP-30)を含むすべての作業を化学ドラフトで行ってください。これらは危険な化学物質です。OsO4 への曝露は、失明や死に至る可能性があります。
    注:すべてのすすぎ量と染色量は、サンプルの2倍以上です。1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液の代わりに使用できます。固定処置中は、サンプルを乾燥させないことが非常に重要です。これは、超微細構造に大きな影響を与えるためです。ポリプロピレンチューブを使用してください。

3. モンタージュ広域透過型電子顕微鏡(WA-TEM)用試料の作製

注: このステップは、研究者が WA-TEM の準備に取り組む決定ポイントを表しています。この準備手順はSBF-SEMをサポートしていません。SBF-SEMボリュームEMの場合、プラスチックに埋め込む前にすべての染色を行う必要があります。SBF-SEM調製プロトコールについては、4 を参照してください。

  1. 35 mmディッシュで組織サンプルをハンク平衡塩溶液(HBSS)またはPBSで室温(RT)で2回洗浄します。サンプルをピン留めしたままにしておくと、これらの調製ステップを通じてサンプルの向きを追跡できます。
  2. 0.05% マラカイト グリーン/2.5% グルタルアルデヒド/0.1 M カコジル酸ナトリウム (pH 6.7 - 7.0) 0.8 mL で氷上で 20 分間固定します。
  3. 固定液を取り出し、サンプルを0.1 Mカコジル酸ナトリウムでそれぞれ5分間4回洗浄します。0.1 Mカコジル酸ナトリウムを除去します。
  4. 0.8 mLの0.8% K3Fe(CN)6 またはK4Fe(CN)6 / 1.0% OsO4 K3Fe(CN)6 を0.1 Mカコジル酸ナトリウムに0.8 mLで後置します。光が入らないように皿にカバーをかぶせます(OsO4 は感光性があります)。室温で20分から1時間染色します。
  5. OsO4 を取り外し、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液でそれぞれ5分間4回すすぎます。カコジル酸ナトリウム緩衝液を除去し、氷上で1%タンニン酸で20分間染色します。
  6. タンニン酸を除去し、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で1回および2回、分子グレードの蒸留水(DI)でそれぞれ5分間5分間洗浄します。
  7. 0.5%酢酸ウラニル(UA)で1時間RTまたは暗所で4°Cで一晩染色します。
  8. 酢酸ウラニルを取り出し、分子グレードの蒸留水でそれぞれ5分間5回すすぎます。最後の洗浄前、およびサンプルがまだ脱イオン水に浸かっている間に、ピンで留めたサンプルの周りのシリコンマットをかみそりの刃で切ります。この小さなシリコンマットをプレートから持ち上げて、ポリプロピレンチューブに入れます。
    注:チューブ内でサンプルをシリコンピースに固定したままにすることが重要です。このステップでポリプロピレンチューブに切り替える必要があるのは、後続のステップで使用されるプロピレンオキシドが35mmプレートのポリスチレンを分解するためです。
  9. 最後のバッファーを取り除いた後、25%エタノールで1xを短時間すすいでください。25%エタノールを廃棄し、25%エタノールと氷上で3分間インキュベートします。
  10. 25%エタノールを取り除きます。1xを50%エタノールで短時間すすぎます。50%エタノールを捨て、50%エタノールと氷上で3分間インキュベートします。
  11. 50%エタノールを取り出し、75%エタノールで1xを短時間すすぎます。75%エタノールを捨て、75%エタノールと氷上で3分間インキュベートします。
  12. 75%エタノールを取り出し、95%エタノールで1xを短時間すすぎます。95%エタノールを捨て、95%エタノールと氷上で3分間インキュベートします。
  13. 95%エタノールを取り出し、100%エタノール(200プルーフ)で毎回少なくとも10分間、3回洗浄します。100%エタノールを除去し、プロピレンオキシド(PO)を加えます。POを使用して、それぞれ少なくとも10分間3回すすぎます。
  14. 以下の説明に従って樹脂ミックスを準備します。
    1. 樹脂部品を60°Cで温め、完全に液化させます。12.5 mLのEmbed-218、7.5 mLのAraldite 502、および27.5 mLのDDSAを50 mLチューブに入れ、60°Cで十分に混合します。 この混合物は、4°Cで6ヶ月間保存できます。 60°Cに温めてからご使用ください。使用前に必要な量を補充してください。
  15. 以下で説明するように、サンプルを埋め込みます。
    1. レジンミックスのアリコートをチューブに入れ、20 μL/mLのDMP-30アクチベーターを加えます。60°Cで回転させて完全に混合します。色が濃くなるはずです。
    2. この活性樹脂のアリコートをPOで50%希釈し、樹脂とPOを完全に混合します。
    3. サンプル含有チューブから最後のPOリンスを取り外し、50%樹脂/PO混合物と交換して、チューブをほぼ完全に満たします。サンプルを室温で一晩回転させます。
    4. 翌日、新しい樹脂アリコート(サンプルあたり1 mL)を20 μL/mLのDMP-30と混合します。
  16. サンプルをポリプロピレン皿に入れ、サンプルチューブから少量の50%樹脂/PO混合物を注入し、解剖顕微鏡(~6倍の倍率)でピンを組織から慎重に取り出します。ティッシュのみを、DMP-30活性化剤を含む少量の100%樹脂を含む別のポリプロピレン皿に移します。
  17. DMP-30活性剤を使用して100%樹脂をシリコーン埋め込み型に充填し、サンプルを型に慎重に配置します。型をオーブンに入れ、60°Cで少なくとも48時間焼きます。調製したサンプルを 図2Bに示します。
  18. 10,11で説明されているように、モンタージュされた広域透過型電子顕微鏡(WA-TEM)イメージングを実行します。図 3 は、最初の穿刺から 3 次元でレンダリングされた 1 分間の血栓までのプロセスを示しています。モンタージュされたWA-TEM電子顕微鏡イメージングの詳細なプロトコルを含めることはここには含まれておらず、サンプル調製に関する現在のプロトコルの範囲を超えています。
    注:WA-TEMは、コンピュータ化されたステージを備えた最新の透過型電子顕微鏡のほとんどで過小評価されている機能です。これらの機能をサポートするシェアウェアソフトウェア10,11は、コロラド大学ボルダー校(http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/、http://bio3d.colorado.edu/imod/)のDavid Mastronarde博士のグループから入手可能です。

結果

穿刺創傷出血時間に対する薬物効果の定量化
穿刺創の出血時間は、マウスで容易に実施できる薬物リスクの生理学的モデルを提供します。穿刺創実験から得られる結果は予測可能です。ここでは、ダビガトランの用量反応出血曲線を示します。トロンビン阻害剤であるダビガトランは、経口直接作用型抗凝固剤、いわゆるDOAC12として使用されています。頸静脈穿刺創モデルを使用して、マウスの血栓形成の遅延による出血の長期化の可能性を通じて、ダビガトランのさまざまな用量に固有のリスクを評価しました。15、50、または 150 μg/kg のさまざまな用量のダビガトランを、頸静脈穿刺の 20 分前に静脈内 (i.v.) 投与しました。ダビガトランのさまざまな濃度での出血時間平均を示します(図4)。用量レベルでは、出血時間の有意な延長が観察される、 p <0.051。これは、ヒトでの薬物の使用における重大な危険因子を示しています。実験的には、これらの用量の薬物は、形成血栓の超微細構造に有意な影響を及ぼします。

形成穿刺創血栓における血小板活性化状態の評価
WA-TEMアプローチは、低倍率で見た場合の単一平面内の創傷領域の概要と、高倍率での多くの詳細の両方を提供します(図5)。取得した詳細は、概要のコンテキスト内に直接配置できます。このアプローチを使用して、形成穿刺創血栓への円盤状血小板の動員を評価しました。循環血小板は円盤状であるため、その名前が付けられており、分泌顆粒のフルセットが含まれています。重要な問題は、循環血小板を、残りの血小板の自由流動性を乱すことなく、成長する血栓にどのように動員できるかということでした。私たちの研究は、循環血小板が細胞小器官のフルセットを含む円盤状血小板としてテザリングプロセスを通じて血栓に1つずつ動員されるというテザーと活性化の仮説を指し示しています2。これの証拠は、穿刺の 1 分後の頸静脈血栓の WA-TEM から来ています。まだ出血している創傷の中央から完全な血栓スライスを生成するための切片化に続いて、自動ステージおよびSerialEMソフトウェア10を使用した透過型電子顕微鏡を使用して、断面の血栓の全寸法を横切る長方形のXYラスターグリッドで500〜800フレーム、4,000 x 4,000ピクセル、3.185 nmピクセルサイズを画像化しました。次に、IMODプログラムスイート11の一部であるeTomoソフトウェアを使用してフレームをつなぎ合わせました。これにより、120,000 x 90,000 ピクセルのさまざまなサイズの 1 つの画像が生成され、3DMOD ソフトウェアを使用して、低ズーム (0.02) で全画面表示、または高ズーム (0.25 から 1.0) で詳細に表示される (これも IMOD プログラム スイートの一部) (図 5) 。正味では、ソフトウェア主導の分析により、穿刺穴内の末梢に結合した血栓関連円板状血小板が、ひも上のビーズのように間隔を空けていることがわかりました。血栓内の短い距離では、円盤状の形状はそれほど明確ではなく、血小板は互いにより密接に関連していました。血栓のより深いところでは、血小板は丸みを帯び、密集し、部分的に脱顆粒されていました。一連の形態は、血小板が長いテザー分子(おそらくフォン・ヴィレブランド因子)を介して血栓に最初に結合したこと、およびそれ以上の血小板活性化ステップは形成血栓の内部に限定されていることを示唆していた。したがって、血栓への血小板動員は、頸静脈内の血液循環を妨げることなく発生する可能性があります。

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図1:頸静脈/大腿動脈穿刺創血栓実験を実施するための外科的セットアップ。 手術器具(A)と器具(B)は、実験中にタイミングが重要であるため、動きの効率のために慎重に配置されています。(C)灌流固定後、穿刺創血栓を含む血管の部分を、光学顕微鏡で観察しながら、35mm培養皿のシリコンマットに固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:血管からプラスチックに包埋されたサンプルに移動し、WA-TEMまたはSBF-SEMのいずれかで切片化されます。 (A)穿刺創があり、血管外血栓形成が蓄積している大腿動脈(円と矢印)が示されています。(B)血栓(円と矢印)をプラスチックに埋め込んで、WA-TEMの切片化を行い、その後の2Dイメージングのためにミクロトームを装着します。(C)血栓(円と矢印)をプラスチックに埋め込み、トリミングして1mm未満の短いスティックを作り、SBF-SEMイメージングチャンバー内のピンに取り付けます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:穿刺創から血栓形成まで: 穿刺創(A)から穿刺後1分間の頸静脈血栓(B)の画像スライスへの準備の流れの概略図。画像スライスでは血管壁に青色でラベル付けされ、血管壁付近の小さな黒い点は赤血球、血栓血小板凝集体は濃い灰色の領域として表示されています。この数値は1から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:頸静脈穿刺創傷実験で生成されたデータの例(グラフィック形式)。ダビガトランの用量反応出血曲線が示されています。.この数値は1から修正されています。ダビガトランのさまざまな濃度での出血時間平均が、プラスまたはマイナスの標準偏差を示すエラーバーとともに表示されます。 学生のt検定を使用した統計分析では、p値が<0.05であることが示されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:スライスをつなぎ合わせてモンタージュを形成したWA-TEM画像 (A)個々の高解像度フレームが収集され、より大きなコンテキストに特徴を配置する目的でつなぎ合わされます。(B)ズームアップすることで、重要な詳細を文脈で引き出すことができます(poly:多形核白血球、endo:内皮、col:コラーゲン繊維)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

頸静脈および大腿動脈で止血血栓を産生するための詳細な穿刺創傷手順、それらの in situ 灌流固定、およびモンタージュされた広域透過型電子顕微鏡法のサンプル処理について紹介します。全体的な手順は、超微細構造分析のための止血血栓の生成や、実験マウス、たとえば、異なる種類と投与量の医薬品で治療されたマウスの出血時間の比較に役立ちます。また、対照野生型マウスの出血時間とノックアウトマウスの出血時間(すなわち、接着性リガンドと相互作用する血小板中のさまざまな糖タンパク質のノックアウト)やその後の高分解能電子顕微鏡法と比較するのにも有用です。このプロトコルは、電子顕微鏡法を強力な選択肢とする特徴が失われているため、一次読み取りとして免疫蛍光分析に容易に適合させることができます。一方、免疫蛍光法は、構造内のタンパク質を特定するための主要なツールです。他の技術プロトコルと同様に、他のステップよりも重要なステップがあり、プロトコル内には、その後の分析に重要な選択ポイントとして扱うことができるステップがあります。

重要な手順、後続の分析のための選択ポイント、および制限について、以下に説明します。実際の針の穿刺ステップ:穿刺創は、静脈または動脈に対して25°の角度で保持されたシリンジ針で作られます。これにより、静脈や動脈の両側に穿刺される可能性が最小限に抑えられます。一方、90°の角度は、血管内皮層を削ったり、血管の外側の血管外コラーゲンマトリックスを損傷したりしない可能性を最大化しますが、静脈や動脈の両側に穴を開けるリスクが高くなります。選択は、経験、手、そして自信のいずれかです。

ここでの主な固定は、単一の反応性アルデヒド基を含む小分子である灌流パラホルムアルデヒドを用いて行われます。パラホルムアルデヒドは単一の化学反応性基を含んでいるため、細胞成分を架橋する傾向がほとんどなく、抗原性を破壊する傾向がほとんどなく、したがって、電子顕微鏡の一般的な固定剤であるグルタルアルデヒドに対する比較的弱い固定剤であると考えられており、これは2つの反応性アルデヒドを含み、したがってはるかに多くの分子架橋を産生する13。これは、構造を保存するために設計された 現場 ステップです。灌流ステップにより、血栓トラップされていない赤血球が製剤から除去されます。これにより、ほとんどの赤血球を含まない製剤が得られ、血小板の特性に焦点を当てやすくなります。私たちは、グルタルアルデヒド/パラホルムアルデヒド混合物を血管外に適用した in situ 固定の使用を検討しました。この手順は、特に高流量/高圧の状況で効果的です。ただし、循環する赤血球を所定の位置に固定します。これにより、穿刺創血栓を形成する血小板凝集体の形状と組成に関する電子顕微鏡写真のその後のセグメンテーション分析が複雑になる可能性があります。グルタルアルデヒドの使用は、固定剤によって生成される高レベルの自家蛍光のために、代替の免疫蛍光法を非常に複雑にします。

シリコンパッド上の固定血管のピン留め/拡射は、埋込み目的で血栓の位置を特定するために重要です。このステップでは、血流に対するサンプルの向きが追跡され、後続のステップで認識されます。穿刺孔と形成された血栓は、開いた血管に容易に位置付けることができます。対照的に、血栓は切除された無傷の血管で見つけるのが困難です。これは、固定循環赤血球が豊富なサンプルに特に当てはまります。干し草の山の針がどこにあるかを追跡できることは非常に重要です。

血管を広げて開き、形成された血栓、穿刺穴が位置する場所を撮影すると、選択ポイントが得られます。全体的なプロトコルでは、提示された後続のステップは、WA-TEM用のサンプル調製に固有のものです。このステップでは、他のプロトコルの選択を行うことができます。一方では、サンプルは電子顕微鏡ではなく免疫蛍光顕微鏡で処理できます。一方、サンプルは、WA-TEMの代わりにシリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBF-SEMまたは別の体積電子顕微鏡法)で処理できます。SBF-SEMのプロセッシングステップは、この手順に備えるために、電子顕微鏡法のすべての重金属染色ステップをプレエンベッド4で行う必要があるため、明らかに異なります。

このプロトコールの重金属染色ステップは、核酸が豊富な生物学的複合体であるリボソームや染色体に対して膜を強調するように設計されています。他の重金属染色プロトコル、例えば、StorrieおよびAttardi14 およびLiu et al.15を使用することができる。

静脈や動脈の違いに注意することが重要です。動脈と静脈のより高い圧力を相殺する必要があります16,17。例えば、大腿動脈創傷と頸静脈創傷を生じさせるために、より小さな直径の針が用いられる。これにより、より高い圧力が補われ、出血停止時間がほぼ等しくなります。頸静脈穿刺創傷の手技では、パラホルムアルデヒドは小さな単一のアルデヒド含有固定剤として迅速に作用しますが、抗原性を損なわない傾向がある弱い固定剤であるため、高張条件下での固定剤としてパラホルムアルデヒドを使用することが優先されます。つまり、ここで述べるプロトコールは、光顕微鏡または電子顕微鏡レベル18,19のいずれかでの抗体媒介ローカリゼーション研究によって補完することができる。大腿動脈穿刺創の場合、より強力な架橋固定剤であるグルタルアルデヒドをパラホルムアルデヒドと組み合わせて使用 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)で使用し、動脈血栓を安定させ固定します。この変更は、動脈と静脈のより高い血圧を相殺するために必要です。動脈の場合、カコジル酸ナトリウム濃度は、頸静脈血栓の固定液に使用される濃度の半分です。

ここで紹介する電子顕微鏡のサンプル処理手順は、WA-TEMに合わせて調整されており、限られた量の電子顕微鏡情報を提供します。WA-TEMは、フロー1に平行または垂直な全血栓断面積にわたって、3.185nmピクセルサイズ以下の高解像度画像を限定的に生成します。ガラスとダイヤモンドナイフの組み合わせを使用して、血栓の推定10%、25%、50%、75%、および90%の一連の断面を手動で製造します。完全な血栓断面積を実現するには、4,000 x 4,000ピクセルの電子顕微鏡品質のカメラで数百のフレームをイメージングする必要があります。その後、フレームをつなぎ合わせます。完全な断面画像を実現するには、約400〜800フレームが必要です。WA-TEMはSBF-SEMで補完することができます。SBF-SEMは、SEMイメージングチャンバー1の真空内に封入されたダイヤモンドナイフを使用して、ブロック面を小さなステップで徐々に切り取るときに、ブロック面の一連の連続画像を生成します。これらの画像をまとめると、形成血栓の完全な3次元レンダリングが得られます。ミクロトームはSEMイメージングチャンバー内にあるため、SBF-SEMのすべての染色ステップは事前に埋め込む必要があります。これら2つの電子顕微鏡アプローチの組み合わせにより、限られた数の断面(WA-TEM)またはミリメートルサイズに近い穿刺創血栓(SBF-SEM)の全深度にわたって~3nm以上の分解能でイメージングすることができます。ステッチされたWA-TEM画像を3DMODソフトウェア10 で表示すると、さまざまなズームレベル間で迅速に操作できるため、高解像度のビューでも血栓幅の断面全体にコンテキストを配置できます。

結論として、マウスで穿刺創血栓を作製し、それらを その場で固定し、血栓が静脈または動脈内に容易に位置し、血流に対してその向きを追跡できる方法で電子顕微鏡用に処理するための実証済みのプロトコルを提示します。さまざまな決定ポイントが示されているため、ユーザーはサンプルの分析方法を選択できます。私たちは、細胞内の他の成分に対して膜を強調する電子顕微鏡法の準備に焦点を当てています。結局のところ、他の研究にとって最も一般的なプロトコルの部分は、広域透過型電子顕微鏡(WA-TEM)が、細胞、すなわちミリメートルサイズに近い大きな構造内の血小板、ここでは形成血栓のナノスケールの知識をサポートするモンテーションアプローチであるという著者による認識です。その結果、全体的なコンテキスト内に詳細を配置する能力が、さまざまなステップを完全な手順に組み合わせることの中心的な強みです。

開示事項

著者らは、この研究に関連する利益相反はありません。

謝辞

著者らは、アーカンソー医科学大学(Jerry Ware氏とSung W. Rhee氏)、ペンシルベニア大学(Tim Stalker氏とLawrence Brass氏)、ケンタッキー大学(Sidney W. Whiteheart氏とSmita Joshi氏)、国立衛生研究所の国立バイオイメージング・バイオエンジニアリング研究所(Richard D. Leapman氏とMaria A. Aronova氏)の同僚に感謝の意を表します。著者らは、米国心臓協会および国立衛生研究所の国立心肺血液研究所(R01 HL119393、R56 HL119393、R01 155519からBSまで、およびNIHからのサブアワードからR01 HL146373およびR35 HL150818)の財政支援に感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 生理食塩水MedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint 頭皮静脈セットMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint 皮下注射針MedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint 特殊皮下注射針MedlineNDA26393
50 mL コニカルチューブフィッシャーサイエンティフィック06-443-20
アルコール調製パッド(70%イソプロピルアルコール)MedlineMDS090670Z
アルミホイル フィッシャーサイエンティフィック01-213-100
アニマルヒーティングプレートPhysitemp InstrumentsHP-1M
アラルダイト GY 502電子顕微鏡 科学10900
アクシオカム 305 カラーR2顕微鏡 カメラカールツァイス顕微鏡426560-9031-000
BD Luer-Lokシリンジ、20 mLMedlineB-D303310Z
塩化カルシウムFisher ScientificC79-500
細胞培養皿 35mm x 10mmCorning Inc.
コットンチップ アプリケーターMedlineMDS202055H
DMP-30 アクチベーター電子顕微鏡 科学13600
ドデセニル無水コハク酸/ DDSA電子顕微鏡 科学13700
ドレッシング鉗子、5インチ、湾曲、鋸歯状、狭い先端インテグラ ミルテックス6-100
ドレッシング鉗子、5インチ、標準、鋸歯状Integra Miltex6-6
EMBED 812 樹脂電子顕微鏡科学 14900
エチルアルコール、無水 200 プルーフ電子顕微鏡 科学15055
フィッシャーブランド 4 ウェイチューブラックフィッシャーサイエンティフィ03-448-17
フィッシャーブランド デジタルタイマーフィッシャーサイエンティフィ14-649-17
フィッシャーブランド シングルシリンジ輸液ポンプフィッシャーサイエンティフィック7801001
ガーゼスポンジ 2インチ x 2インチ - 4 プライメドラインNON26224H
グルタルアルデヒド (10% 溶液)電子顕微鏡科学16120
イソフルラン液体吸入麻酔、100 mLメドライン66794-017-10
ジュエラースタイル マイクロファイン鉗子、スタイル5Fインテグラミルテックス17-3052ペアが必要です。
L/S ポンプ チューブ、シリコン、L/S 15; 25 フィートVWRMFLX96410-15
L-アスパラギン酸Fisher ScientificBP374-100
硝酸鉛Fisher ScientificL-62
Malachite Green 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II ポンプ ヘッドVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S 可変速デジタル ドライブVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" ワイヤー カッターフィッシャー サイエンティフィック50-191-9855
四酸化オスミウム 4% 水溶液電子顕微鏡科学19150
パラホルムアルデヒド (16% 溶液)電子顕微鏡科学15710
Physitemp 温度調節器Physitemp InstrumentsTCAT-2LV
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene Oxide, ACS ReagentElectron Microscopy Sciences20401
Pyrex Glass BeakersFisher Scientific02-555-25B
Rectal Temperature Probe for MicePhysitemp InstrumentsRET-3
スコッチマジックインビジブルテープ、3/4 "x 1000"3M会社305289
カコジル酸ナトリウムバッファー0.2M、pH 7.4電子顕微鏡科学11623
SomnoFlo低流量電子気化器ケントサイエンティフィックSF-01
マウス用ソムノフロースターターキットケントサイエンティフィックSF-MSEKIT
ステンレス鋼 微細ピンファインサイエンスツール26002-10
実体顕微鏡 steREO Discovery.V12カールツァイス顕微鏡495015-9880-010
シルガード 184 シリコーンエラストマーワールド精密機器SYLG184シリコーンマット
タンニン酸電子顕微鏡 科学21700
チオカルボヒドラジド (TCH)Sigma-Aldrich88535
ウラニルアセテート電子顕微鏡科学22400
ヴァンナススプリングマイクロはさみファインサイエンスツール15000-08
グレーフアイドレッシング鉗子、2.75インチ、湾曲、鋸歯状インテグラミルテックス18-8182が必要です。
ワーグナーはさみファインサイエンスツール14068-12
MiniFigura動物トリマーBraintree科学CLP-9868
禅Liteソフトウェアカールツァイス顕微鏡410135-1001-000
430165ック ック フォンペアウォール

参考文献

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穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備
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