方法論記事

抗疲労煎じ薬が中央疲労ラットモデルの行動と血清学的指標に及ぼす影響

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DOI:

10.3791/66481

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2024年4月12日

 ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、修正マルチプラットホーム法(MMPM)によってモデル化されたラットの中枢疲労に対する抗疲労煎じ薬(AFD)の効果を評価するためのプロトコルを紹介します。

要約

この研究は、薬物介入後の修正マルチプラットホーム法(MMPM)によってモデル化されたラットの行動と血清学的指標を観察することにより、中枢疲労に対する抗疲労煎じ薬(AFD)の効果を評価することを目的としています。握力測定は、ラットの筋力を評価するために使用されました。オープンフィールドテストは不安様行動の評価に、モリス水迷路テストはラットの記憶機能の評価に利用されました。行動評価に続いて、ラットの血清サンプルを採取して、コルチコステロン(CORT)と乳酸(LAC)の濃度を測定しました。LACの濃度は比色法を使用して決定し、CORTの濃度は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法を使用して測定しました。ブランクコントロール群と比較して、MMPMモデリング後、ラットは握力の大幅な低下と記憶能力の障害を示しました。血清分析により、モデル群ラットのLACおよびCORTレベルの増加が明らかになった。AFDは、これらの悪影響をある程度顕著に逆転させることができます。これらの知見は、AFDとコエンザイムQ10が、中枢疲労ラットの身体的および認知的能力と血清バイオマーカーレベルの変化に対するプラスの効果を強調しています。

概要

疲労は多面的で非特異的な現象であり、通常は疲労感と機能能力の低下を特徴としています1。これは、筋肉レベルで発生する末梢疲労、または中枢神経系に由来する中枢疲労のいずれかに分類できます3,4。中枢性疲労の長期化は、不安、うつ病、心理的苦痛、記憶障害などの心理的問題に大きく寄与する可能性があります5,6。重大な苦痛を引き起こしているにもかかわらず、中枢性疲労を標的とする特定の薬は不足しています7。中枢神経系の刺激剤であるメチルフェニデートは一時的な緩和をもたらすことができますが、不眠症や動悸などの副作用が状態を悪化させる可能性があります8,9。

これまでの臨床応用では、伝統的な中国医学は、経口煎じ薬、鍼治療、太極拳10,11,12などのアプローチを取り入れて、中枢性疲労の治療に有望な結果を示しています。抗疲労煎じ薬(AFD)は、広範な臨床経験に基づいてLi Feng教授によって開発された効果的な処方であり、積極的な治療効果が実証されています。Astragalus membranaceus(Huangqi)、Fructus aurantii(Zhiqiao)、Fructus crataegi(Shanzha)、Schisandra chinensis(Wuweizi)、Angelica sinensis(Danggui)、およびDendrobium officinale(Shihu)で構成され、15:15:10:5:7:8の比率です。AFD煎じ薬は、10倍の量の脱イオン水で1時間3回煮沸した後、110mLに濃縮した。先行研究では、MMPM(Modified Multiple Platform Method)を用いて中枢性疲労の動物モデルを確立し、行動神経伝達物質および中枢神経系神経伝達物質の評価を通じて中枢性疲労の発現を確認した13。本研究では、中枢疲労の動物モデルにおけるAFD介入を活用し、行動評価を通じてその薬理学的効果を評価した。

プロトコル

この研究活動は、動物福祉に関する倫理ガイドラインに準拠しています。動物の健康と福祉を確保するために、適切なケアと住居の条件が維持され、すべての手続きは北京中医薬大学の施設内動物ケアおよび使用委員会(BUCM-4-2019041504-2094)によって承認されました。

1. 動物の飼育とグループ化

注:研究全体を通じて、動物福祉は3R(Reduction、Refinement、およびReplacement)の原則に従って維持されました。

  1. この研究では、体重が 210 g ± 10 g の 6 週齢の 54 匹の特定の病原体を含まない (SPF) Wistar ラットを選択します。
  2. 制御された条件下で動物施設にラットを収容します:温度23±2°C、相対湿度50%、および12時間/12時間の明暗サイクル。実験の3日間前に動物が順応するのを待ちます。
  3. ラットを空白の対照群(図の「a」と表示)、モデルグループ(図の「b」と表示)、AFD低用量(AFD-L、図の「c」と表示)グループ、AFD中用量(AFD-M、図の「d」と表示)グループ、AFD高用量(AFD-H、図の「e」と表示)グループにランダムに分けます。 コエンザイムQ10(CoQ10;図では「f」と表示)グループ、各グループに9匹のラット、乱数表法を使用。

2. モデリングと介入

注:このモデルの確立は、以前の文献13に基づいていました。

  1. 自作のモデリングボックス(北京中医薬大学の神経免疫学研究室から提供)を使用します。
    注:モデリングボックスの長さは110 cm、幅は60 cm、高さは40 cmです。底部は15個の円形プラットフォーム(直径6.5cm、高さ8cm)で固定されています。2つのプラットフォーム間の水平方向の間隔は13cm、垂直方向の間隔は10cmです。オープンフィールドボックスの長さは100cm、幅は100cm、高さは35cmです。底面は黒、壁は紺色です。オープンフィールドボックスの底部は、寸法が25cmの25の正方形に分割されており、中央の9つの正方形が中央ゾーン、外側の16の正方形が周辺ゾーンに指定されています。
  2. プール内の水位がプラットフォームから約1cm上にあり、水温が23°C±2°Cに維持されていることを確認してください。
  3. 実験が始まったら、表面に金網で覆われた箱にネズミを入れ、動物が逃げないように重りで押し下げます。金網の下に十分な食物を吊り下げ、きれいな飲料水を提供します。
  4. モデル群のネズミを毎日18:00に箱に入れ、翌日8:00に取り出します。各モデリングセッションの後、ラットを乾燥させ、清潔なケージに戻します。モデリングを 21 日間連続して実行します。
  5. 実験中は、箱を掃除し、毎日水を交換し、十分な餌を与えてください。
  6. モデリングの 15日目 に、毎日午前 10:00 に胃洗浄を介して薬剤を 7 日間連続して投与します。
    1. AFD-L群を3.24 g / kg / d、AFD-M群を6.48 g / kg / d、AFD-H群を12.96 g / kg / dの用量で投与します。.コエンザイムQ10を10 mg / kg / dの投与量で投与します。.
    2. 胃洗浄を介して薬剤を投与する場合は、蒸留水に必要な用量を混合して懸 ?? 液を調製します。.各グループの投与量は10mL / kgです。.ブランクグループとモデルグループに同量の蒸留水を与えます。
      注:ラットに投与された投与量は、体表面積(BSA)法を用いて計算され、ヒトの通常の治療用量に従って変換された14。

3. 行動評価

  1. ラットの握力
    1. ラットの尻尾をつかみ、握力計にそっと置きます。
    2. ラットを均一な力で後方に引っ張りながら、コンピューターシステムがデータを正しく記録することを確認します。
      注:実験の前に、技術者はラットを一貫して力を加えるように扱うように訓練されていました。
    3. このプロセスを3回繰り返し、3つの測定値の平均を最終的な握力値として計算します。
      注:人的要因によるエラーを最小限に抑えるために、1人の人間に実験全体を行わせてください。
  2. ラットでのオープンフィールド試験
    1. 行動実験は、薄暗く静かな環境で行ってください。各実験を開始する前に、ラットを行動室に1時間配置して適応させます。
    2. 3人の実験者が操作に関与していることを確認し、ラットを配置したり誘導したりするときは黒い服を着用してください。実験全体を通して、実験者が体や腕で箱の境界を越えないようにしてください。
    3. 解析ソフトウェアを開きます。
      1. トップ メニューの [ファイル ] をクリックし、[ 新しい実験 ] を選択して新しいプロジェクトを作成します。 アリーナ設定で、ネズミが移動するアリーナに対応する形状を選択します。
      2. マウスを使用して、画面にアリーナを描きます。カメラをキャリブレーションし、アリーナ設定 を保存します 。
    4. 黒い服を着た2人目の実験者に、ネズミの背中をつかんで、指定されたエリアの中央に順番に置き、すぐに手を引っ込めます。
    5. 新しい録音を開始します。録画時間を5分に設定します。
    6. 5分間の観察時間の後、ラットを野外ボックスから迅速に取り出し、糞をきれいにします。75%アルコールを使用して、オープンフィールドボックスを清掃します。
    7. すべてのラットについてこのプロセスを繰り返します。
    8. (1)移動した合計距離、(2)中央ゾーンの交差回数:ラットの手足が中央のグリッドの正方形に交差した回数、および(3)中央ゾーンで費やされた時間、つまり、ラットが9つの中央のグリッドの正方形に費やした時間を観察して記録します。
  3. ラットのモリス水迷路
    1. 行動実験は、薄暗く静かな環境で行ってください。各実験を開始する前に、ラットを行動室に1時間配置して適応させます。
      注:ラットは4日間の訓練を受けました。5日目 から正式な実験が始まりました。
    2. プール内の水位がプラットフォームから約1cm上にあり、水温が23°C±2°Cに維持されていることを確認してください。
    3. 3人の実験者が操作に関与していることを確認し、ラットを配置したり誘導したりするときは黒い服を着用してください。
    4. 水プールを4つの象限に分割します。第 2 象限の中央にプラットフォームを固定します。各象限の壁の中央に、さまざまな色と形の紙を貼り付けます。
    5. 解析ソフトウェアを開きます。
      1. トップ メニューの [ファイル ] をクリックし、[ 新しい実験 ] を選択して新しいプロジェクトを作成します。 アリーナ設定で、ネズミが移動するアリーナに対応する形状を選択します。
      2. マウスを使用して、画面にアリーナを描きます。カメラをキャリブレーションし、アリーナ設定 を保存します 。
    6. 学習期間中、別の実験者に、各象限でラットをプールの壁に向けるように順番に配置させます。配置の順序は、次のように毎日異なります。
      1. 初日には、ラットを第1象限、第2象限、第3象限、第4象限の順序で配置します。
      2. 2日目に、ラットを次の順序で配置します:第2象限、第1象限、第4象限、第3象限。
      3. 3日目に、ラットを次の順序で配置します:第4象限、第3象限、第2象限、第1象限;
      4. 4日目に、ラットを次の順序で配置します:第3象限、第1象限、第4象限、第2象限。
    7. ラットが120秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、プラットフォームに誘導し、10秒間その上にとどまるのを待ちます。
    8. 毎日の実験が完了したら、3人目の実験者にタオルでラットの体から水分を拭き取り、ヘアドライヤーで乾かさせます。これは、ノイズの干渉を避けるために別の部屋で行ってください。
    9. 正式な実験では、プラットフォームを取り外し、ラットを第3象限に置きます。ラットの移動軌跡を120秒以内に記録します。
    10. (1)プラットフォームが配置された象限で費やされた時間、および(2)ラットが初めて水プールに入ってからプラットフォームに到達するのにかかる時間である脱出遅延を観察して記録します。

4. 血清生化学的解析

  1. サンプル処理
    注:採集の前日に、水ではなく食物の断食が許可されました。
    1. 2% (w/v) ペントバルビタールナトリウム溶液を使用して、0.5 mL/100 g 体重の腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます。
    2. 完全な麻酔後、採血器を使用して腹部大動脈から血液を採取します。
    3. 全血を室温(RT)で2時間置き、次いで4°C、1522.38× g で20分間遠心分離して血清を得る。分注し、血清を-80°Cで保存して、さらに使用してください。
  2. 乳酸(LAC)アッセイ
    注:LACの濃度は、比色法を使用して決定しました。
    1. 酵素予備溶液と酵素希釈液を1:100の体積比で混合して、酵素ワーキング溶液を調製します。
    2. キットの指示に従ってカラー現像液を準備します。
    3. ブランクチューブに20μLの蒸留水を加えます。
    4. 標準チューブに3 mmol/Lの標準溶液を加えます。
    5. 測定チューブに20μLのサンプルを加えます。
    6. 各チューブに1 mLの酵素ワーキング溶液と0.2 mLのカラー現像液を加えます。37°Cで10分間インキュベートし、次に2 mLの停止溶液を加えます。
    7. 200 μLの反応溶液を96ウェルELISAプレートに移します。530nmでOD値を測定します。OD値に基づいてLAC濃度を計算します。
      注:LAC濃度=(サンプルウェル外径値-ブランクウェル外径値)/(標準ウェル外径値-ブランクウェル外径値)x標準溶液濃度x希釈比係数。
  3. コルチコステロンアッセイ
    注:市販のELISAキットは、ラット血清中のコルチゾン濃度を測定するために使用されます。
    1. 実験に先立ち、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と洗浄液で標識した抗体を希釈し、作業溶液を作製します。濃度0 nmol/L、5 nmol/L、15 nmol/L、30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L、240 nmol/Lの標準サンプルを、20 μLの容量でコーティングプレートに加えます。
    2. 血清サンプル(20 μL)をそれぞれのウェルに加え、続いて200 μLの酵素コンジュゲートを添加します。プレートをよく振って、60分間インキュベートします。
    3. 反応液を廃棄し、プレートを洗浄液(各回400μL)で3回洗浄します。プレートを吸収紙で乾燥させた後、各ウェルに100μLの基材カラー試薬を加えます。
    4. プレートを室温で15分間インキュベートし、各ウェルに50 μLの停止溶液を加えます。
    5. 各ウェルの外径値を450nmで測定します。標準ウェルのOD値を使用して標準曲線を生成し、それを使用してサンプルウェルの濃度を計算します。

5. 統計分析

  1. 適切なソフトウェアアプリケーションを使用して統計分析を実行します。計測データを平均±標準偏差として表します。
  2. データが正規分布に従い、分散の均一性を示した場合は、独立したt検定を実行します。
  3. データが正規分布に従っているが、分散が等しくない場合は、近似t検定を実行します。
  4. データが正規分布に従わなかった場合は、比較にノンパラメトリック検定を使用します。
  5. ピアソンのカイ二乗検定を列挙/カウントデータ分析に使用します。
    注:有意水準α = 0.05が選択され、P < 0.05は統計的に有意と呼ばれます。
  6. 適切なソフトウェアアプリケーションを使用して数値を生成します。

結果

対照群と比較して、モデル群のラットは握力の有意な低下を示しました。しかし、低用量、中用量、高用量でのAFDの投与は、 図1に示すように、すべて用量依存的にこの効果を逆転させることができました。同様に、ポジティブコントロール薬も握力の変化を逆転させる能力を示しました(図1)。

オープンフィールド試験では、モデル群ラットは、総移動距離、セントラルゾーン交差回数、およびセントラルゾーン滞留時間の短縮を示しました。低用量、中用量、および高用量でのAFDの投与は、 図2に示すように、用量依存的な方法でこれらの影響を逆転させることができました。同時に、ポジティブコントロール薬は症状を緩和することもできました(図2)。 図3では、各グループのオープンフィールド実験から重ね合わせた軌跡周波数を示すヒートマップを観察することができます。

モリス水迷路試験では、モデル群のラットは、ターゲット象限での脱出潜伏時間が長く、遊泳時間が短縮されたため、空間探索性が低いことが示されました。ポジティブコントロール薬であるコエンザイムQ10は、前述の変化を逆転させることができました。注目すべきは、図4に示すように、低用量、中用量、高用量のAFDは、長期のエスケープ潜時を逆転させたことです。図 5では、各群の水迷路実験におけるラットの軌跡の代表的なヒートマップを観察することができます。

血清レベルに関しては、モデルグループのラットはLACとCORTのレベルが上昇していました。しかし、低用量、中用量、高用量でのAFDの投与は、 図6に示すように、ポジティブコントロール薬と同様に用量依存的にこれらの変化を逆転させた。

figure-results-1
図1:各グループの握力の結果 a:対照群;b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。*P < 0.05 対対照群;#p < 0.05 対 モデル グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:オープンフィールド実験と自発運動レベルの測定(A)総移動距離。(B)中央ゾーンの交差点の数。(C)中央ゾーンの滞留期間。a:コントロールグループ。b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。*P < 0.05 対対照群;#p < 0.05 対 モデル グループ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:各グループのオープンフィールド実験からの重ね合わせ軌道周波数を示すヒートマップ。 a:対照グループ。b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:各グループにおけるモリス水迷路実験の結果。 (A) エスケープ遅延。(B)目標象限の遊泳時間。a:コントロールグループ。b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。*P < 0.05 対対照群;#p < 0.05 対 モデル グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:各グループのモリス水迷路実験におけるラットの軌跡の代表的なヒートマップ。 a:対照グループ。b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:各群におけるLACおよびCORTの血清レベルの結果(A)LACの血清レベル。(B)CORTの血清レベル。a:コントロールグループ。b: モデルグループ。c:AFD-Lグループ。d:AFD-Mグループ。e:AFD-Hグループ。f:CoQ10グループ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

AFDは 、Astragalus membranaceus (Huangqi)、 Fructus aurantii (Zhiqiao)、 Fructus crataegi (Shanzha)、 Schisandra chinensis (Wuweizi)、 Angelica sinensis (Danggui)、 およびDendrobium officinale (Shihu)で構成されており、脾臓を活性化し、停滞した肝臓のエネルギーを分散させる機能があると考えられています。また、これらのハーブはすべて、良好な安全性プロファイルを持っていると考えられており、したがって、中国では食品として一般的に使用されています。これまでの臨床診療では、AFD は中枢性疲労患者の治療に良好な有効性を示してきましたが、特定の治療メカニズムはまださらなる調査が必要です。そこで、AFDが中枢疲労の改善に効果があることを動物実験を通じて検証し、そのメカニズムをさらに解明することを目指しています。

薬理学的研究を行うためには、疾患の病因や臨床的特徴を正確に表現する動物モデルを確立することが不可欠である15。私たちのチームは以前に、睡眠不足による中枢疲労のラットモデルを確立しました。これにより、握力の低下、不安、記憶障害がもたらされます13。しかし、過去の研究では、関連する血清学的指標を検出することができませんでした。同時に、疲労に関連する血清バイオマーカーの有意な変化の観察は、この動物モデルが中枢疲労の信頼できる表現としての有効性を強化します。この研究では、中枢性疲労のラットモデルに介入するために、コエンザイムQ10(エネルギー代謝を促進することにより疲労を改善することが知られている薬)16をポジティブコントロールとして、さまざまな用量のAFDが使用されました。行動評価は、疲労関連の動物実験を研究する上で重要なステップです。したがって、研究者はこの手順17の精度を確保することが不可欠です。野外試験が実施されたとき、動物は閉じたプラットフォームに置かれ、関連する活動18,19を観察することによって彼らの気分の変化を評価することを目的としていた。モリス水迷路は、実験動物に泳がせ、水中に隠されたプラットフォームを見つけることを学ぶことを強制する一種の実験であり、主に学習能力と記憶能力を評価するために使用されます20,21。中枢疲労のモデルでは顕著な行動変化が見られたため、ラットの行動の変化を観察し評価するために2つのテストを採用しました。この結果は、MMPMモデルラットが顕著な不安様行動と学習能力と記憶能力の障害を示すことを示しており、これは以前の研究結果と一致しています13。

ストレスは、視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸の過剰な活性化につながり、グルココルチコイドの過剰産生をもたらす可能性がある22。コルチゾールの長期的な上昇は、ニューロンに不可逆的な損傷を与える可能性があり、これは不眠症、うつ病、および不安の発症に大きく寄与する要因です23,24。これらのプロセスは、中枢性疲労の発生と進行と密接に関連しているため、血清コルチゾールは疲労の程度と関連していると考えられています25。中枢性疲労の動物モデルでは、コルチコステロンレベルの顕著な上昇が示されており、これは関連する薬物による介入によって効果的に逆転させることができます26。この研究の結果は、AFDがストレス誘発性中枢疲労によって上昇する血清コルチコステロンの急増を効果的に抑制し、用量依存的な効果を示すことを示しています。この結果は、ラットの中枢疲労モデルでAFDが不安様行動を改善できる理由も部分的に説明しています。

乳酸はこれまで骨格筋の副産物と考えられてきました。運動強度が増加すると、エネルギー需要が有酸素能力を上回り、ATP産生のための嫌気性代謝への依存度が高まる27。乳酸の蓄積は、筋肉内の化学受容体を刺激する役割を担っており、この興奮は大脳に伝達され、痛みと疲労の信号となる28。いくつかの病理学的要因も乳酸の過剰産生を誘発し、それによってこの反射弓を活性化します。最近の臨床研究では、血清中の乳酸濃度と疲労度との間に密接な関係があることが説明されています29。私たちの前述の観察では、MMPMラットはブランクコントロールと比較して血清の有意な上昇を示し、小さなプラットフォームに立っている間に経験する乳酸レベルの上昇と筋肉疲労との間に強い相関関係があることを示している可能性があります。AFDの適用により、WMPVラットから採取した血清中の乳酸レベルをある程度著しく低下させることができ、疲労度を順次改善します。

結論として、この研究は、AFDがコルチコステロンレベルを低下させ、乳酸代謝を改善する能力を通じて、握力の低下を効果的に逆転させ、不安を軽減し、記憶を改善する可能性があることを示しました。この論文は、in vivo での中枢疲労に対する TCM の実験的研究のテンプレートを提供することが期待されます。この研究の限界は、関連する分子メカニズムの基盤を探求するための高度なステップがないことです。今後は、AFDが中枢神経系に及ぼす影響を探り、その関連メカニズムを調査していきます。

開示事項

著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。私たちは、私たちの研究に不適切な影響を与える可能性のある組織や個人と金銭的または個人的な関係を持っていません。

謝辞

著者一同、中国国家自然科学基金会(NO.81874428)および北京伝統中国医学大学の研究プロジェクト(NO.2023-JYB-JBZD-001)からの支援に感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コルチコステロンテストキットドイツのDRG会社EIA4164Step 4.3
Curve Expert 1.4 softwareCurveExpertProfessional Version 1.4コルチコステロンアッセイ
Ethovisionソフトウェアでの計算用 ノルダス情報技術、オランダバージョン15分析ソフトウェアおよびビデオ追跡システム
グリップ強度試験装置北京中市ディチュアン有限会社ZS-ZLステップ3.1
酸テストキット南京建城バイオエンジニアリング研究所A019-2-14.2
修正マルチプラットフォーム法北京中医薬大学の神経免疫学研究室なしステップ 2.1
モリス水迷路試験装置北京中石ディ荘有限会社ZS-Morrisステップ 3.3
オープンフィールド試験装置北京中紫ディ荘有限会社ZS-KCステップ 3.2
プリズムグラフパッド Verson 8数値を生成するため
SPSS 26.0IBMVerson 26.0統計分析 
ウィスターラット SiPeiFu(Beijing)Biotechnology Co.、Ltdライセンス番号:SCXK(Jing)2019-0010
乳ステップ

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