この記事では、微好気性条件下でのヒト宿主と生きた膣マイクロバイオームとの相互作用の研究を可能にするマイクロ流体膣オンチップ(膣チップ)培養デバイスを作成するためのプロトコルについて説明します。このチップは、膣疾患を調査するためのツールとしてだけでなく、潜在的な治療対策を開発およびテストするためのツールとして使用できます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
女性の健康、特に女性の生殖管(FRT)の疾患は、不健康な生殖器系が生命を脅かす病気、不妊症、または妊娠中の有害な結果につながる可能性があるにもかかわらず、彼女たちにふさわしい注意を払われていません。この分野の障壁の1つは、FRTの生理学と病態生理学を忠実に模倣する前臨床の実験モデルが不足していることです。組織間界面、血管灌流、間質液の流れ、およびヒト臓器の主要なサブユニットの物理的微小環境を模倣できるOrgan-on-a-Chip(Organ Chip)マイクロ流体培養技術の出現は、この問題の解決策として役立つ可能性があります。最近、ヒト膣微生物コンソーシアムと、膣間質とも接種され、動的な流体の流れを経験する一次ヒト膣上皮との共培養をサポートするヒト膣チップが開発されました。このチップは、健康で腸内細菌叢の異常性に対するヒト膣の生理学的反応を再現します。人間の膣チップを作成するための詳細なプロトコルは、この記事で説明されています。
概要
酸性微小環境の維持に役立つ乳酸桿菌属が優勢な膣内細菌叢は、女性のリプロダクティブヘルスの維持に重要な役割を果たしています1。ただし、マイクロバイオームを構成する微生物群集の構成が変化し、膣内細菌の多様性が増加する場合があります。これらの嚥下障害の変化は、乳酸桿菌が優勢な状態から、より多様な嫌気性細菌種(ガードネレラ膣など)が優勢な状態への切り替えをもたらすことが多く、細菌性膣炎、萎縮性膣炎、尿路感染症、外陰膣カンジダ症、尿道炎、絨毛膜羊膜炎などの生殖器系のさまざまな疾患に関連しています2,3,4,5 .これらの疾患は、次に、女性が性感染症や骨盤内炎症性疾患にかかる可能性を高めます6,7,8,9。また、妊婦の早産や流産のリスクも高く、10,11,12
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
この研究は、ヒト細胞の使用に関する機関のガイドラインに準拠して実施されました。細胞は商業的に入手した( 資料表参照)。すべてのステップは、バイオセーフティキャビネット(BSC)で無菌的に実行する必要があります。このプロトコルには、フィルター(またはバリア)ピペットチップのみを使用してください。
1. ヒト膣上皮細胞の培養
- 50 mLの ?? 上皮培地(VEM、 材料の表を参照)を37°Cに温めます。.
- 9 mLのVEMを15 mLチューブに分注します。.次に、ヒト膣上皮細胞(HVEC)のバイアルを解凍し、VEMを含むチューブに加えます。
- 15 mLチューブを300 x g で室温(RT)で5分間遠心分離し、上清を吸引してペレットを残します。
- ペレットを2 mLのVEMに穏やかに再懸濁し、14 mLのVEMを含む2つのT75フラスコのそれぞれに1 mLを加えます。
- フラスコを37°Cで5%CO2 とインキュベートします。HVECが約70%コンフルエントになるまで(約5日)2日ごとにVEMを交換します。
2. ヒト子宮線維芽細胞の培養
<....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
人間の膣は、線維芽細胞に富むコラーゲン間質を覆う層状上皮によって裏打ちされています。これをモデル化するために、2チャンネルのマイクロ流体臓器チップデバイス内で、一般的な多孔質膜の反対側にある初代ヒト膣上皮と線維芽細胞を培養することにより、組織界面を作成しました。膣上皮の形成は、明視野顕微鏡イメージングを用いてモニターされ、複数の細胞層を徐々に形成する連続した細胞シートの形成が明らかになる(図2A)。以前の報告では、この形態は、断面29で見た場合、完全に層状になった上皮の発達と相関していることが確認されました。ただし、上皮層が斑状で不連続に見える場合(図2B)、膣チップは実験での使用に適していない可能性があります。
図3は、Vagina Chipの生成の概略図を示しています。Vagina Chipの機能を検証するために、チップに L. crispatu.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ヒト膣の過去のin vitroモデルは、膣組織の構造、体液の流れ、および宿主と病原体の相互作用を忠実に再現していません19,22。動物モデルは、マイクロバイオームの種間変動や発情周期または月経周期の違いによっても制限されます19,22。この原稿では、健康で嚥下障害のある微生物群集に対する人間の反応を効果的に模倣できる、ヒト膣の臓器チップモデルを作成するためのプロトコルについて説明します。
このプロトコルは、市販されている2チャンネルの臓器チップデバイス( 材料の表を参照)で平行なマイクロチャネルを分離する共有多孔質膜の反対側に膣上皮細胞と線維芽細胞を播種することを含む。多孔質膜は、成長因子やその他の形態の細胞間コミュニケーションの移動を可能にします。しかし、コラーゲンのコーティングと細胞単層の存在に.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
Donald Ingberは、Emulateの創設者、取締役、科学諮問委員会の議長、および株主です。他の著者は、競合する利害関係はないと宣言しています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 & micro;m ステリフリップ | ミリポール | SCGP00525 | メディアを脱油するために |
| 2チャンネルチップ | 模倣して | BRK-S1-WER-24 | 2チャンネルチップキットの一部 |
| 200 & mu;Lバリアチップ(またはフィルターチップ) | トーマス・サイエンティフィック、SHARP | 1159M40 | チップシーディングに使われるヒント |
| 活性化試薬1(またはER-1粉末) | 模倣して | チップS1 基礎研究キット-24PK | 2チャンネルのチップキットの一部である。保管温度は-20度、注記; |
| 活性化試薬2(またはER-2溶液) | 模倣して | チップS1 基礎研究キット-24PK | 2チャンネルのチップキットの一部である。保管温度4 & デグ;C |
| アデニン | シグマ・オルドリッチ | A2786 | 微分媒体の構成要素 |
| ブルセラ血液寒天プレート | VWRインターナショナル株式会社 | 89405-032 | ヘミンとビタミンK、ガードネレラ・ヴァギナリスの個体数のために |
| Ca2+およびMg2+遊離DPBS(DPBS(-/-) | サイエンセル | 303 | 洗浄セル用 |
| 塩化カルシウム | シグマ・オルドリッチ | C5670 | 微分媒体の構成要素 |
| 塩化カルシウム(無水) | シグマ・オルドリッチ | 499609 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| コラーゲン I | コーニング | 354236 | HVECのコーティング溶液について |
| コラーゲンIV | シグマ・オルドリッチ | C7521 | HVECのコーティング溶液について |
| コラーゲナーゼIV | ギブコ | 17104019 | 膣チップからの細胞の解離のために |
| 完全な線維芽細胞培地 | サイエンセル | 2301 | HUF文化のためのメディア |
| 完全な膣上皮培地 | ライフライン | LL-0068 | HVEC文化のためのメディア |
| D-グルコース(デキストロース) | シグマ・オルドリッチ | 158968 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| DMEM(低血糖) | サーモフィッシャー | 12320-032 | 微分媒体の構成要素 |
| ダイナミックフローモジュール(またはZoë) | 模倣して | Zoë-CM1 | チップの流量を調整します |
| ハムのF12 | サーモフィッシャー | 11765-054 | 微分媒体の構成要素 |
| 加熱で不活性化されたFBS | サーモフィッシャー | 10438018 | 微分媒体の構成要素 |
| ヒト子宮線維芽細胞 | サイエンセル | 7040 | HUF |
| 人間の膣上皮細胞 | ライフライン | FC-0083 | HVEC |
| ヒドロコルチゾン | シグマ・オルドリッチ | H0396 | 微分媒体の構成要素 |
| ITES | ロンザ | 17-839Z | 微分媒体の構成要素 |
| L-グルタミン | サーモフィッシャー | 25030081 | 微分媒体の構成要素 |
| 塩化マグネシウム六水和物 | シグマ・オルドリッチ | M2393 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| 硫酸マグネシウム・ヘプタハイドレート | シグマ・オルドリッチ | M1880 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| MRS寒天プレート | VWRインターナショナル株式会社 | 89407-214 | ラクトバチルスの列挙について |
| O-ホスホリルエタノールアミン | シグマ・オルドリッチ | P0503 | 微分媒体の構成要素 |
| ペン/溶連菌 | サーモフィッシャー | 15070063 | 微分媒体の構成要素 |
| pHストリップ | フィッシャー・サイエンティフィック | 13-640-520 | pHおよびnbspの測定のために; |
| ポッド(1/チップ) | 模倣して | BRK-S1-WER-24 | 2チャンネルチップキットの一部 |
| ポリLリジン | サイエンセル | 403 | HUFのコーティング溶液について |
| 塩化カリウム | シグマ・オルドリッチ | P3911 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| リン酸カリウム一塩基性 | シグマ・オルドリッチ | P0662 | HBSSの構成要素(LB/+G) |
| 滅菌80%グリセロール | 国会議員 バイオメディカル | 113055034 | 細菌サンプルの凍結用 |
| トリイオドチロニン | シグマ・オルドリッチ | T6397 | 微分媒体の構成要素 |
| トリパンブルー溶液(0.4%)およびnbsp; | シグマ・オルドリッチ | T8154 | 生きている細胞と死んだ細胞を数えるために |
| TrypLEエクスプレス | サーモフィッシャー | 12605010 | 膣チップからの細胞の解離のために |
| トリプシン中和溶液(TNS) | サイエンセル | 113 | トリプシンの中和のために |
| トリプシン/EDTAソルチオム(0.25%) | サイエンセル | 103 | 細胞解離についてnbsp; |
| β-エストラジオール | シグマ・オルドリッチ | E2257 | 分化培地のホルモン |
参考文献
- Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
- Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
- Ralph, S. G., Rutherf....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
