本プロトコールは、ヒト骨肉腫組織を用いて患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルを確立する方法を記載している。
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方法論記事
ヒト骨肉腫組織を用いた患者由来異種移植マウスモデルの樹立
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
骨肉腫は、小児および青年期に最もよくみられる原発性悪性骨腫瘍です。近年、新たな治療計画が策定されているにもかかわらず、骨肉腫患者の予後は大きく改善していません。したがって、忠実度の高い堅牢な前臨床モデルを確立することが重要です。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存します。その結果、PDXモデルは、形質転換研究におけるさまざまながんを研究するための本物の in vivo モデルと見なされています。この記事では、ヒト骨肉腫の形態学的特徴を正確に反映したPDXマウスモデルを作成および維持するための包括的なプロトコルを紹介します。これには、新たに切除されたヒト骨肉腫組織を免疫不全マウスに直ちに移植し、その後、連続的に継代することが含まれます。記載されているモデルは、骨肉腫の成長、薬剤耐性、再発、および転移を研究するためのプラットフォームとして機能します。さらに、標的治療薬のスクリーニングと個別化治療スキームの確立を支援します。
概要
骨肉腫は、骨間葉細胞に由来する原発性骨悪性腫瘍であり、青年および小児に最も多くみられます。これはしばしば長骨幹の骨端に発生し、悪性度が高く、早期転移、予後不良を特徴としています1,2。肺転移は、骨肉腫患者の主な死因です。非転移性骨肉腫患者の5年生存率は65%-70%3です。しかし、過去40年間で、転移性骨肉腫患者の5年生存率(わずか20%)は有意に改善しておらず、骨肉腫患者の25%が診断時に転移を持っています4。現在、骨肉腫治療の第一選択薬はコンセンサスに達していますが、化学療法のレジメンと治療時間には依然として大きな違いがあります5。より効果的な化学療法レジメンを得るためには、適切な動物モデルに基づく前臨床試験を行うことが重要です。
現在、骨肉腫の前臨床実験に一般的に使用されるモデルには、細胞株ベースのin vitro細胞培養およびin vivo細胞由来異種移植片(CDX)、および患者由来異種移植片(PDX)6,7が含まれます。
これらの細胞株は、培養やin vitro研究での使用、または免疫不全マウスへの移植によるCDXモデル8の確立に便利です。しかし、in vitroで培養した細胞株は、継代を繰り返す間にin vitro培養環境に適応するために生じる可能性のある突然変異により、悪性腫瘍の不均一性や患者の個々の特性を正確に反映できない場合があります。さらに、in vivoでの腫瘍の成長と発生に必要な微小環境と免疫系を欠いています。CDXモデルはin vitro細胞培養に比べていくつかの利点がありますが、CDXモデルから得られた腫瘍組織は、in vitroで培養された細胞株と比較して腫瘍内の不均一性および免疫系の表現が限られているにもかかわらず、骨肉腫患者の個々の特性を完全に反映していない可能性があります9。そのため、忠実度の高い前臨床モデルを確立することが重要です。
PDXモデルでは、切除したばかりのヒトがん組織を免疫不全マウスに直ちに移植します。この方法により、マウスで連続的に経過した後でも、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存することができます。さらに、PDXモデルは、その後の臨床転帰10を正確に予測することが知られており、個別化された治療法を作成し、精密医療研究を前進させるための貴重なツールとなっています11。
この研究では、ヒト骨肉腫組織を移植することにより、免疫不全マウスにPDXモデルを確立する手順について説明します。このようなモデルは、骨肉腫の前臨床実験を実施するためのプラットフォームとして機能します。
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プロトコル
ヒト組織を対象としたすべての研究は、上海中医薬大学(中国・上海)傘下の龍華病院の制度倫理審査委員会によって承認されており(2013LC52)、ヘルシンキ宣言に基づき、患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。この動物実験のIACUC番号はPZSHUTCM221017013です。4週齢の雄 CAnN.Cg-Foxn1nu/Cllマウスに、ダブルライオン照射げっ歯類食GB 14924.3と滅菌水を与え、12時間の明暗サイクルのSPF条件下で、ケージあたり5匹のマウスをIVCマウスケージに収容しました。 材料表 には、このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関する詳細情報が含まれています。
1. ヒト骨肉腫組織の調製
注:この研究では、化学療法の前に15歳の骨肉腫患者の大腿骨病変からヒト骨肉腫組織12 を切除しました。
- 切除したばかりの骨肉腫組織を直ちに組織保護溶液に保管し、滅菌生理食塩水ですすいだ後、骨肉腫細胞の活性化を最大限に保存します。
注:切除したばかりの骨肉腫組織は、できるだけ早くマウスに移植する必要があります。それらは、移植前に最大24時間組織保護溶液に保存できます。モデリングに使用する骨肉腫組織は、化学療法を受けていない患者からのものでなければなりません。化学療法を受けた患者の腫瘍細胞の活性は悪くなり、モデル確立の失敗と高い忠実度の喪失につながります。 - 組織保護液に保存されている切除したばかりの骨肉腫組織をできるだけ早く検査室に移します。.
- PDXモデルを確立するための実験器具と材料を準備します:メス(図1A)。眼科用ピンセット(図1B、C);眼科用ハサミ(図1D);縫合針(図1E);縫合線(図1F);ストレートニードルホルダー(図1G);マーキングペン(図1H)。
注:使用前に、すべての手術器具がオートクレーブ滅菌されていることを確認してください。 - 滅菌フード内で、予冷した滅菌生理食塩水で骨肉腫組織を2回すすぎます。
- 出血や壊死のある骨肉腫組織の領域を切除します。
- 洗浄した骨肉腫組織を、予冷した滅菌生理食塩水を入れた培養皿にメスを入れて3mm3 等分に切り、氷上に保ちます。
2. マウス脇腹領域における骨肉腫組織移植によるPDXモデルの確立
- メロキシカム(5 mg / kg / 24時間)の術前鎮痛をマウスの皮下注射で投与し、ヌードマウスを滅菌外科用ドレープに置きます。.手順全体を通して熱サポートを提供します。
- マウスを3%イソフルランと97%酸素に曝露することにより、マウスに麻酔を誘発します。マウスを完全に麻酔した後、マウスをノーズコーンに移し、1.5%イソフルランと98.5%酸素で麻酔を維持します。
- つま先をつまんでマウスが完全に麻酔をかけられていることを確認し、まだけいれんやけいれん反応がある場合は長く待ちます。
注:すべての手順は、滅菌フード内の滅菌機器を使用して実行する必要があります。麻酔中のマウスの乾燥を避けるために、眼科用軟膏をマウスの目に塗布します。. - マウスを横方向の褥瘡位置に固定します(図2A)。骨肉腫組織移植のためにマウスの脇腹領域の片側を、ポビドンヨードと70%エタノール消毒剤のコットンボールを交互に3回消毒します。
注:外科的消毒は、中央から始まり外側にらせん状に円形のパターンで行われます。 - マーカーペンで皮膚の外科的切開部位に印を付けます。
- メスで皮膚から皮下組織まで5mmの切開を行います(図2B)。
- 左手の眼科用ピンセットで切開縁の上側の皮膚を持ち上げ、右手のまっすぐな針ホルダーでマウスの真皮の下を上向きに鈍的解剖します(図2C)。
- 左手の眼科用ピンセットで切開部の上側の皮膚を押さえ、右手で眼科用ピンセットで切開縁の約5mm上の皮下に骨肉腫組織を移植します(図2C)。
注:骨肉腫組織が皮膚の真皮のすぐ下に移植されていることを確認してください。鈍的解剖は、マウスの皮膚の真皮層を見つけながらマウスの胸腔を貫通するのを避けるために、まっすぐな針ホルダーなどのまっすぐで鈍い解剖鉗子を使用して行われます。 - 5 mm の切開に対して 2-3 針の吸収性縫合糸を使用して切開部を縫合します (図 2D)。
- マウスを清潔なケージに戻し、麻酔から完全に回復するまでマウスを監視します。
注:ヒト骨肉腫組織を移植して確立したPDXは継代0(P0)と指定し、P0にPDX組織を移植して確立したPDXは継代1(P1)と指定し、その後にP2とP3を示します。
3. PDX腫瘍組織の採取
- 週に一度、腫瘍の体積を測定します。腫瘍サイズが1500 mm3に達したら、CO2 吸入後に子宮頸部脱臼法を使用してマウスを安楽死させます。人道的なエンドポイントには、腫瘍潰瘍形成や前肢の可動性の問題が含まれます。
注:キャリパーを使用して、腫瘍の長径(a)と短径(b)を測定します。式を使用して腫瘍体積(V)を計算します:V = 1/2 × a × b2。 - マウスを横向きにして腫瘍を露出させ、アルコールに浸したコットンボールで腫瘍部位の皮膚を消毒します。
- 眼科用ハサミを使用して腫瘍全体を分離します。電子スケールを使用して腫瘍塊を計量します。
4. 原発性臨床組織およびPDX腫瘍組織の病理学的検査
- 腫瘍組織13 を、30mLの10%中性緩衝ホルマリン溶液を含む50mLチューブに24時間固定する。腫瘍組織を流水で十分にすすぎ、固定剤を取り除きます。
- 腫瘍組織を脱水し、パラフィン14に埋め込みます。
- 腫瘍組織をスライスし、定期的な組織学的検査を実施します15。
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結果
このプロトコルは、PDXマウスモデルを確立するための詳細な手順を説明し、新たに切除されたヒト骨肉腫組織の即時移植とマウスでの連続継代後のヒト骨肉腫の形態学的特徴を保存します。今回、ヒト骨肉腫組織を用いてPDXマウスモデルを確立することに成功しました。
図3A は、15歳の患者から大腿骨肉腫組織を移植した2ヵ月後のP0におけるPDXの代表的なマウスを示しています。 図3B は、P0にPDX組織を移植してから1ヶ月後のP1にPDXの代表的なマウスを示しています。 図3C は、PDX組織をP1に移植してから1ヶ月後のP2におけるPDXの代表マウスを示しています。 図3D は、P2にPDX組織を移植してから1ヶ月後のP3にPDXの代表マウスを示しています。
腫瘍サイズが1,500 mm3<...
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ディスカッション
PDXモデルは、ヒトの癌の特性をシミュレートし、遺伝的およびゲノム的変化、組織型、不均一性、および遺伝子発現プロファイル16,17,18,19を含む原発腫瘍との類似性をより保持することができる。したがって、彼らは癌患者の分子表現型と遺伝子型を保存し、生物学を研究し、潜在的な治療法を評価するための革新的なアプローチを提供します。これらのアプローチには、実際の臨床反応と非常に類似した反応を示す新規抗がん剤の前臨床スクリーニング、薬剤耐性バイオマーカーの検出、個別化された臨床治療レジメン選択における感受性薬物のスクリーニング、および患者の転帰の予測が含まれます20。さらに、PDXモデルの確立プロセスは比較的簡単で、特別な機器は必要ありません。
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開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
この研究は、(1)国立自然科学財団(81973877および82174408)からの助成金によってサポートされています。(2)上海最優先研究センター建設プロジェクト(2022ZZ01009);(3)中国の国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600);(4)上海コラボレーティブイノベーションセンター、病院TCM準備の産業変革、および(5)上海伝統中国医学大学の予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10%ホルマリン中性溶液 | 武漢Saiweierバイオテクノロジー株式会社 | G1101-500ml | 組織を固定するオート |
| クレーブ | ジャパンヒルヤマ | カンパニーHVE-50 | 手術器具 |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | 上海SLAC実験動物有限公司。 | / | アニマル |
| キャリパー | 煙台グリーンフォレストツール株式会社 | 034180A | 腫瘍の容積を測定する |
| 皿(60mm) | 上海NianYueバイオテクノロジーCo.、株式会社 | 430166、移植 | 中のコーニングサンプル配置 |
| 剤綿球上海 | Honglong工業株式会社 | 20230627 | マウスの皮膚を消毒 |
| 使い捨て滅菌手袋 | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | 滅菌操作 |
| ダブルライオン照射げっ歯類ダイエット | 蘇州双石実験動物飼料技術有限公司 | GB 14924.3 | 動物飼料 |
| 電子スケール | 上海NianYueバイオテクノロジー株式会社 | 1-2000 | |
| Eosin | 上海Gengyunバイオテクノロジー株式会社 | E4009-25G | ヘマトキシリンeosin汚れ |
| ヘマトキシリン | 上海Gengyunバイオテクノロジー株式会社 | H3136-25G | ヘマトキシリンエオシン汚れ |
| イソフルラン | 深センRWDライフTechnology Co., Ltd | VETEASY | マウス麻酔 |
| IVCsマウスケージ | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | アニマルバリア |
| マークペン | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | 手術切開をマークする |
| オリンパス光学顕微鏡 | 日本のオリンパス会社 | BH20 | スキャン組織スライス |
| 眼科軟膏 | 上海 Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | 麻酔中のマウスのドライアイを避ける |
| 眼科用ハサミ | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | 皮膚を切る |
| 眼科用ピンセット | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Hold osteosarcoma tissues during transplantation |
| パラフィン | 江蘇省泰実験装置有限公司 | 80200-0015 | 埋没骨肉腫組織 |
| パラフィンスライサーLyca | Microsystem(上海)貿易有限公司 | RM2235 | 骨肉腫組織切片 |
| 生理食塩水 | 広州Jinshengバイオテクノロジー株式会社 | 605-004057 | 骨肉腫組織のすすぎと一時保管 |
| メス | 手術器具工場 上海医療機器(グループ)有限公司 | J11010-10# JZ | 骨肉腫組織の分離と外科的切開 |
| 滅菌フード | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | 外科手術台 |
| 滅菌外科用ドレープ | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | 無菌手術エリアを提供 |
| ストレートニードルホルダー | 上海 Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | 創傷 |
| 縫合糸ライン | 上海浦東金環医療製品有限公司 | F3124 | 創傷 |
| 縫合針 | 上海浦東金環医療製品有限公司 | F3124 | 創傷 |
| 組織保護液を縫合 | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., Ltd | BC-CFM-03 | 組織細胞の活動を維持する |
| チューブ (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | ホルマリン固定液のインストール |
参考文献
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