個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

サマリー

このプロトコルは、個々のヒト末梢血単核細胞のサイトカイン分泌動態を定量的に測定するための高度なマイクロ流体プラットフォームを説明しています。このプラットフォームは、例としてリポ多糖で刺激された個々の細胞ごとに最大3つのサイトカイン(IL-6、TNFα、およびIL-1β)を並行して測定します。

要約

感染症、自己免疫疾患、治療に対する望ましい免疫学的反応および有害な免疫学的反応は、 in vivoで複雑で動的なサイトカイン応答を引き起こす可能性があります。この応答には、免疫反応を調整するためにさまざまなサイトカインを分泌する多数の免疫細胞が含まれます。しかし、さまざまな細胞サブタイプによるさまざまなサイトカインの分泌動態、量、および共起は、それらを研究するための適切なツールが不足しているため、まだ十分に理解されていません。ここでは、マイクロ流体液滴プラットフォームを使用して、単一細胞レベルで並行して複数のサイトカインの分泌動態を時間分解して定量的に測定できるプロトコールについて説明します。これは、個々の細胞をマイクロ流体液滴にカプセル化し、サイトカイン濃度を並行して定量するためのマルチプレックスイムノアッセイ、動的蛍光イメージングのための固定化、および分泌量とダイナミクスを導き出すためのそれぞれの画像の解析によって可能になります。このプロトコルは、官能基化磁性ナノ粒子の調製、キャリブレーション実験、細胞調製、およびリポ多糖刺激ヒト末梢血単核細胞の例を使用した蛍光イメージングおよびその後の画像およびデータ解析のための液滴への細胞およびナノ粒子のカプセル化について説明しています。提示されたプラットフォームは、単一細胞と共分泌細胞の異なるサイトカイン分泌挙動を同定し、測定された細胞サンプルで予想される表現型の不均一性を特徴付けました。さらに、このアッセイのモジュール性により、さまざまなタンパク質、サイトカイン、細胞サンプルの研究に適応し、応用することができ、異なる免疫細胞タイプ間の相互作用や、厳密に制御された免疫応答を形成するために動的に分泌される異なるサイトカインの役割について、より深い理解につながる可能性があります。これらの新たな知見は、免疫調節不全の研究や、治療や医薬品開発における標的集団の特定において、特に興味深いものとなる可能性があります。

概要

感染症は、自然免疫系と適応免疫系が関与する複雑な宿主反応を引き起こすことがよくあります^1,2。感染性病原体が感染または認識されると、宿主細胞は、重要なコミュニケーターとして知られ、^免疫系の調節因子として知られる小さなタンパク質である多様なケモカインおよびサイトカインを産生することができる3。炎症誘発性サイトカインは、感染すると早期に放出されて免疫応答を開始し、その後、組織の損傷やその後の慢性疾患または自己炎症性疾患を予防するために重要な抗炎症性サイトカインが放出されます。脅威の排除と組織保護との間のこのバランスは、感染中に異なる機能を発揮するサイトカインの広範なレパートリーとして現れ、応答の微調整を可能にする^4,5。この混合物内では、病原体とそれらが誘導するシグナル、組織の位置、およびそれらが由来する免疫細胞に応じて、独自のシグネチャーが観察されます。しかし、サイトカインの放出は、各細胞集団に特有の多機能な生物学的プロセスを構成し、分泌動態や個々の応答が多様であるようにも考えられます。この不均一性は、例えば、T細胞亜集団^6,7において、自己炎症性疾患および重度のCOVID-19感染の調査において、患者内および患者間で炎症マーカーの大きな機能的多様性が示された^8,9という文献で長年にわたって説明されてきた.最近、シングルセルシーケンシングの出現により、以前は明らかではなかった免疫微小環境内の亜集団間の高い可塑性とクロストークが浮き彫りになり、この不均一性を捕捉するためにシングルセル法が必要であることが示されています^10,11。トランスクリプトームを解析するための新しい方法が開発されていますが、表現型解析には、単一細胞レベルでのタンパク質分泌の同時、定量的、および時間分解的な測定が必要であるため、依然として困難です。このような測定により、レパートリーまたはサイトカインのパネルについて、分泌細胞の同一性、ダイナミクス、および分泌パターン(遅発性/速性、初期性/後期性、同時性/逐次性)を調査することができます。免疫応答中のサイトカイン放出の動態を定量的かつ時間的な分解能で研究できるようにすることで、得られた洞察により、細胞集団と誘導された応答の理解が可能になるかもしれません。

標準的なプロトコルでは、サイトカインは通常、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して細胞懸濁液および血清の上清で検出され、バルク分泌量が得られます。バルク測定では、各細胞が産生するサイトカイン量を定量化することはできませんが、これは特に不均一な細胞サンプルで強調される問題です。細胞内サイトカイン染色、酵素結合免疫スポット(ELISpot)アッセイ、またはマイクロ刻印アッセイ(Isoplexisなど)などの代替法は、個々の細胞によって発現されるサイトカインを検出しますが、エンドポイント測定は^12,13にとどまります。これは、インキュベーション時間中に細胞分泌パターンで発生する可能性のある分泌動態と変化が無視されることを意味します。さらに、エンドポイント測定では、同時サイトカイン分泌と連続サイトカイン分泌を区別することができないため、これらの方法を使用しても、サイトカイン分泌における免疫細胞の同時多機能性の真の程度は不明のままです。

単一細胞の分解能は、液滴マイクロ流体工学を使用してピコリットルサイズの物理コンパートメントを生成および処理し、免疫細胞のユニークなサイトカイン分泌表現型を単一細胞レベルで研究するために達成できます^14,15。これらのコンパートメントは、油中水型エマルジョンからなり、マイクロ流体チップ^16,17を用いて生成することができる。実際、液滴ベースのマイクロ流体アッセイは、シングルセルレベルでのさまざまな生物学的サンプルおよびレパートリーの分析を可能にし、それらをアップストリーム(細胞および試薬処理)およびダウンストリームプロセス(シングルセルソーティング、プロテオミクス、またはシーケンシング)と統合する上で非常に汎用性が高いことを実証しています18,19,20,21,22.特に、液滴固定化を可能にするセットアップは、単一細胞の機能を経時的に測定することを可能にし、これはタンパク質分泌の分析に有用です¹⁸。さらに、マルチプレックス化された定量アッセイを統合することで、共分泌や多機能免疫細胞の同定などのプロセスにおいて、以前はアクセスできなかった次元でのさらなる研究が容易になります^23,24。

このプロトコルでは、個々の細胞^17,23から並行して最大3つのサイトカインの分泌を検出、定量化、および時間的に測定するための固定化液滴ベースのシングルセルワークフローについて説明します。この技術は、20,000を超える細胞からのサイトカイン応答を並行して監視する機能を提供します。

提示されたワークフローは、単一の免疫細胞と官能基化されたナノ粒子を60 pLの油中水滴にマイクロ流体カプセル化することで構成されています。観察チャンバー内で>100,000個の液滴を固定化し、時間分解蛍光顕微鏡法により、各液滴および各サイトカイン内のサイトカイン分泌動態を測定できます(図1A)。液滴内の個々の細胞ごとに、サイトカイン分泌はサンドイッチイムノアッセイによって測定され、特異的捕捉抗体で官能基化された磁性ナノ粒子が分泌されたサイトカインに結合し、その後の蛍光標識検出抗体の再配置と結合につながります(図1B、C)。ビーズラインは、磁性ナノ粒子を整列させることによって形成され、サイトカインの存在下で蛍光再配置を定量化できます。ここで、蛍光再配置は、ビーズライン上に見られる平均蛍光強度を残りの液滴の平均蛍光強度で割ったものとして定義されます。このアッセイは、異なる官能基化されたナノ粒子バッチと、異なる蛍光チャネル²³で標識されたそれぞれの検出抗体を混合することにより、いくつかのサイトカインについてマルチプレックス化することができ、その結果、異なるチャネルにおける特異的な蛍光再配置がもたらされる。カスタマイズされた解析スクリプトの助けを借りて、蛍光転位値を抽出し、その画像を個々の細胞およびサイトカインの分泌動的プロファイルに変換することができます。したがって、結果として得られるデータセットは、経時的な分泌測定、共分泌亜集団の同定、分泌量、速度、サイトカインの組み合わせに応じた細胞の分布など、多数の読み取り結果をもたらします。

図1:ワークフローとアッセイの原理 (A)刺激後のサイトカイン分泌細胞を解析するためのワークフローの概要。シングルセル懸濁液および磁性ナノ粒子を調製し、容量の油/水エマルジョン(液滴)中で60pLにカプセル化します。液滴は固定化され、ナノ粒子は磁場内で整列し、30分ごとに最大4時間測定されます。最後に、画像が分析され、すべての液滴、時点、および蛍光チャネルのパラメーターが抽出されます。この数値は¹⁷から修正されています。(B)液滴サンドイッチバイオアッセイの原理。官能基化されたナノ粒子は分泌されたサイトカインに結合し、その結果、蛍光標識された検出抗体がナノ粒子に再移動します。この蛍光の再配置は、組換えサイトカインを用いて実施されたキャリブレーション実験により定量化され、検証されます。異なる官能基ナノ粒子を混合することで、最大3つのサイトカインを同時にマルチプレックス測定することができます。(C)細胞ベースの実験では、測定時間にわたって液滴を追跡し、ナノ粒子上の蛍光再配置の経時的な増加によって分泌細胞を同定します。回路図は縮尺に追いついていません。BioRender.com で作成したフィギュア。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべての実験は、倫理契約EK202-N-56に基づいて実施され、ETHチューリッヒの倫理委員会によって承認されました。ヒト細胞の取り扱いは、バイオセーフティレベル2の実験室に含まれる層流キャビネットで行われました。

注:次のセクションでは、単一細胞レベルで時間分解サイトカイン分泌を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。ここで概説する手順は、リポ多糖類(LPS)による末梢血単核細胞(PBMC)の刺激と、サイトカインIL-6、TNFα、およびIL-1βの並行測定に適用されます。ただし、必要に応じて、プロトコルを他の細胞タイプ、刺激剤、およびサイトカインに適合させることができます。

1. 観察室の製作

注:イメージング中の液滴の動きを避けるために、液滴の直径よりも約10%小さい高さの観察チャンバーが準備されています。

1. カッティング両面テープとトップスライドガラスの準備
   1. 切断ソフトウェアの[設計]タブで、チャンバーの切り欠きの目的のデザインを描画またはロードします。ここで使用する特定のディメンションについては、 図 2E を参照してください。
   2. 厚さ32μmの両面粘着テープを粘着カッティングマットにテープで固定し、カッティングマットを自動カッティングマシンに置きます。
   3. ステップ1.3で取り外しを容易にするために、チャンバーの長辺を同じ方向にカットするように注意しながら、テープからチャンバーデザインを切り取ります。
   4. テープの切り欠きは室温で保管し、長期保存してください。短期保存の場合は、-20°Cで保存し、ステップ1.3の直前にのみ取り出します。取り扱いが簡単です。
   5. 1つの標準的な顕微鏡スライド(76 mm x 26 mm x 1 mm)の中央に直径約1 mmの2つの穴を開け、2つの穴の間の距離は約3.5 cmです。
2. スライドガラスの洗浄とプラズマ活性化
   1. 穴の開いたスライドガラスと穴のないスライドガラスを石鹸で清掃します。蒸留水でよくすすぎ、糸くずの出ない精密ワイプで乾かします。
   2. スライドガラスをプラズマクリーナーに入れ、上面を55Wで10分間プラズマ処理します。スライドガラスを取り外し、手順1.3に進みます。
3. チャンバー組立
   1. 穴の開いたスライドガラスを、プラズマで活性化された面を上に向けて、活性化された表面に触れないように、きれいな表面に置きます。
   2. 両面粘着テープの片面から、切断と同じ方向に保護層をはがします。テープの切り欠きをスライドガラスの端とドリルで開けた穴に触れずに合わせ、テープを短辺から始めてゆっくりとスライドガラスに接触させます。
      注意: テープに伸びや折り目が生じないように注意してください。これにより、チャンバーの高さが正しくなくなります。このステップはエラーが発生しやすく、ある程度の実務経験が必要なため、複数のスライドガラスを並行して準備することをお勧めします。
   3. テープから2番目の保護層を再び切断方向に取り除き、アクティブ化された表面を下に向けて穴のない2番目のスライドガラスを置きます。平らな板を上に置き、上半身の力で約10秒間押し下げて、2つのスライドガラスの全面を一緒に押します。
   4. 2つのスライドガラスを組み立てた後、2つの穴が手前を向くようにチャンバーを反転させます。ポートの下のリングに少量のUV硬化型接着剤を入れ、スライドガラスの穴の上にポートを配置して、ナノポートを2つの穴に接着します。ポートの周りにUV硬化性接着剤のリングを追加し、UVランプで接着剤を硬化させます。チャンバーは 図2Eのようになります。すぐに手順 1.4 に進みます。
      注意: 紫外線は目や肌に損傷を与える可能性があります。適切な保護具を着用してください。
4. チャンバー表面の親蛍光コーティング
   注:このステップは、良好なコーティング効率を確保するために、スライドガラスのプラズマ処理(ステップ1.2.2)後1時間以内に行う必要があります。
   1. フッ素系油(HFE-7500)に1%フルオロシラン溶液(1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシルトリクロロシラン)を1mL新たに調製し、シリンジに充填します。コーティング溶液をPTFEシリンジフィルターと0.3 mm x 0.76 mm PTFEマイクロチューブに接続された27G x 0.75インチの針に通して観察チャンバーに押し込みます。
   2. 1分間のインキュベーション後、ヒュームフードの下で窒素圧を使用してコーティング溶液をチャンバーから洗い流します。別のシリンジアセンブリを使用して、チャンバーをフッ素化オイル(HFE-7500のみ)ですすいでください。
   3. フッ素系オイルを充填したチャンバーを、入口を閉じた状態で室温(RT)で保管してください。各実験の後、細胞と液滴を直接洗い流して、コーティングが良好に保存されるようにします。
      注:プロトコールはここで一時停止でき、チャンバーは数ヶ月間保管して再利用できます。
5. マグネット付きチャンバーホルダー
   1. 磁性ナノ粒子の整列のために、液滴のカプセル化およびイメージング中に観察チャンバーに静磁場を印加します。このためには、チャンバーをカスタム3Dプリント顕微鏡ホルダー( 図2D、およびBounab et ^al.17 補足データ4にあるファイルを参照)に入れ、チャンバーの長辺に沿って2つのネオジム磁石を保持します。

2. ナノ粒子の機能化

注:ナノ粒子の機能化のプロセスは、各サイトカインで類似していますが、唯一の違いは、サイトカイン特異的な捕捉抗体の添加です。各サイトカインの機能化は、異なる個々の反応チューブで並行して行われます。このプロトコールに先立ち、TNFα捕捉抗体とIL-1β検出抗体は、それぞれビオチンとAlexa Fluor 647で社内で標識されていました。標識は、ベンダーのウェブサイト( 材料表のリンクを参照)に記載されているメーカーのプロトコールに従って行い、抗体を分注して-20°Cで保存しました。

1. TNFα検出用のチューブにストレプトアビジン官能基化ナノ粒子50μL(直径(Ø)300nm)、IL-1β用50μL、IL-6用100μLを添加します。ナノ粒子溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1(v / v)に希釈します。
2. 各チューブに、それぞれの容量のビオチン化捕捉抗体(ストック濃度0.5 mg/mL)を1/20(v/v)加え、室温で30分間インキュベートします。
   注:ナノ粒子溶液に少量を添加する場合は、チューブの上部にボリュームを堆積させ、溶液の大部分で複数回洗い流します。これにより、適切な混合が保証され、骨材の形成が防止されます。
3. 1 mM D-ビオチン溶液の1/100(v/v)をチューブに加え、室温で5分間インキュベートします。これにより、最終的なビオチン濃度は10 μMになります。
   注:過剰なビオチンは、ナノ粒子上の自由結合面をブロックし、不要な凝集体の形成を減少させます。
4. ネオジム磁石をチューブに近づけて粒子を収集します。上清が透明になるまで待ってから、上清を捨てます。
   注:アッセイ全体で使用される磁石は非常に強い引力を示し、2つの磁石が誤って一緒に折れると物理的な害を及ぼす可能性があります。
5. ナノ粒子表面への非特異的吸着を低減するために、ナノ粒子をPluronic F-127のステップ2.1の最終体積の0.5倍(10%)およびPBSの0.5倍に直ちに再懸濁します。溶液をRTで30分間インキュベートします。
6. 磁石を使用して粒子を収集し、上清を捨て、保存バッファーの1倍の量に再懸濁します(RPMI 1640、5%ノックアウト血清置換、1%ペン/連鎖球菌、1%組換えヒト血清アルブミン(HSA)、25 mM HEPES、0.1%プルロンF-127)。溶液をRTで30分間インキュベートします。
   注:ここでプロトコールを一時停止することができ、粒子は4°Cで最大1週間保存することができます。
7. カプセル化の直前に、ピペッティングで粒子を再懸濁し、結合したナノ粒子をIL-6:TNFα:IL-1βに対してそれぞれ2:1:1(v / v)の比率で混合します。
   注:官能基化ナノ粒子の異なる比率は、各サイトカインに使用される抗体ペアに依存し、最適なダイナミックレンジを得るためにキャリブレーションサンプルを通じて実験的に決定されています。

4. 7. 
      

1. 1. 
      
   2. 
      
   5. 
      
2. 7. 
      

1. 2. 
      
   3. 
      
2. 3. 
      
   4. 
      

4. &ドロップして
5. 2. 
      

2. 
   
10. 
    
    

3. 2. 
   3. 
6. 
   
7. 
   
10. 
    
11. 
    
12. 
    
    
    2. 
    3. 

結果

提示された機能的なシングルセルプラットフォームにより、いくつかのパラメータの測定が可能になりました。まず、標準的な手法と同様に、細胞を分泌する頻度を測定の最後に示します(図4A)。1 μg/mLのリポ多糖(LPS)を6時間の末梢血単核細胞(PBMC)で刺激した後、細胞の5.81%がIL-6(n = 1270)、4.55%TNFα(n = 995)、および6.06%IL-1β(n = 1326)を分泌しました。

サイトカイン分泌を定量するために、既知の濃度の組換えサイトカインを用いて検量線を作成しました(図 4B)。これらの検量線により、液滴内サイトカイン濃度を経時的に定量することができます。例示的に、LPS刺激PBMCでは、平均液滴内IL-6濃度は90分後にプラトーに達しましたが、平均液滴内IL-1βは90分からより急速に増加し、プラットフォームの動的分解能と特定のサイトカインを分泌する細胞亜集団を抽出する可能性を示しました(図4C)。測定ポイント間で濃度が変化するため、サイトカインあたりの動的分泌速度を計算できます。各サイトカインの平均分泌速度(図4D)を考慮すると、IL-6分泌細胞は平均分泌速度の一定の減少を示し、一方、TNFαおよびIL-1β分泌細胞はいずれも90分測定時間後に分泌速度の増加を示し、150分後には2回目の減少を示しました。

さらに、分泌されたサイトカインと共分泌されたサイトカインに応じて、細胞を亜集団にクラスター化することが可能です(図4E)。ここで、IL-6とTNFαは、IL-6またはTNFαを分泌する細胞の30.2%と26.4%が単分泌しているのに対し、単一分泌IL-1β細胞は全IL-1β分泌細胞の68.8%を占めています。さらに、分泌濃度および分泌速度に対する共分泌の影響を解決できる(図4F)。IL-6を分泌する細胞を見ると、細胞がTNFαまたはIL-1βを追加で産生した場合、異なる量のIL-6が分泌されました。同様に、測定値に対する平均分泌速度の分布は、IL-6のみを分泌する細胞とIL-6のみを分泌する細胞と、TNFα(高い分泌速度)とIL-1β(低いIL-6分泌速度)と並んで統計的に異なっていました。

図4:1μg/mL LPSによる6時間刺激後のPBMCを分泌するIL-6、TNFα、IL-1βの代表的な結果 (A)4時間測定終了時のIL-6、TNFα、IL-1βを分泌するPBMCの割合。(B)マルチプレックスサイトカイン検量線は、既知の濃度の組換えサイトカインで生成されます。これにより、リロケーション値から液滴内のサイトカイン濃度を計算することにより、細胞実験を定量化することができます。ポイントは、非線形一相関連曲線フィット、r² = 0.9926 (IL-6)、0.9901 (TNFα)、0.9990 (IL-1β) を使用してフィットしました。(C)4時間測定時間にわたってPBMCを分泌することにより放出されるIL-6、TNFα、およびIL-1βの平均分泌濃度。(D)4時間測定時間におけるIL-6、TNFα、IL-1βの平均分泌速度。(E)IL−6、TNFαまたはIL−1βおよびそれらの組み合わせを分泌する共分泌細胞の相対的割合。各サイトカインで検出されたすべての分泌細胞に正規化されます。(F)共分泌分解能(IL-6のみのn=383、IL-6 + TNFαのn=531、IL-6 + IL-1βのn=213、IL-6+TNFα+IL-1βのn=213)の測定時間および平均分泌速度(log)分布にわたるIL-6濃度の平均。分泌速度分布の統計的な差は、95%の信頼度で両側、不対応、ノンパラメトリックKolmogorov-Smirnov検定を使用して評価され、p値が表されます。** (p <0.002) および **** (p <0.0001)。完全な線は中央値を表し、点線は四分位数を表します。n_合計セル = 21 866。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

シングルセルレベルでの追加情報を抽出するために、各細胞およびサイトカインの濃度-時間点にS状結腸機能を適合させることができます(図5)。1つの細胞と対応するシグモイド近似の経時的な濃度データセットの例示を図 5Aに示します。ここで、最小二乗フィッティング手順では、曲線の上部プラトー値に対応するC、ゼロからの曲線の時間的シフトを定量化するt₅₀ 、測定全体で10%と90%の濃度値に達したシグモイド曲線の上昇部分の急勾配を表すヒルスロープmのパラメータが得られます。これらのフィットパラメータから、手順7.12で説明したように、一部の曲線記述子を抽出できます。C_max、データの最高濃度値、t_開始、上部プラトー濃度値の10%に達すると定義される分泌開始時間、およびSR_lin、曲線の上昇部分の間の分泌率。

細胞亜集団を分類するために、すべてのシングルセルフィットから得られた曲線記述子をそれぞれ3つのカテゴリーに分類しました:C_の最大値は、t_開始から初期、中、および遅いSR_リンへの低、中、および高にグループ化されました。この分類を説明するために、4つの例示的なシングルセル分泌曲線およびそれらに対応する曲線記述子が示され(図5A−D)、ここで、曲線Aは中速の早期低分泌因子の特性を示し、曲線Bは早期、低速、および高分泌物、曲線Cは早期の高速高分泌物、および曲線Dは後期低分泌物を示す。これらの基準のカットオフは、細胞、サイトカイン、およびアッセイのパラメータ固有であり、各研究課題に適合させる必要があることに注意することが重要です。さらに、ここでは、1 μg/mL LPS刺激後のPBMCのIL-6分泌のみが考慮されており、ほとんどの細胞がそれぞれ80%と79%の早期分泌物質と高分泌物質であったことを意味します(図5E-F)。分泌率に関しては、IL-6分泌細胞の55%が遅い分泌細胞であり、39%が速い分泌細胞であるという双極応答が観察されました(図5G)。

分泌挙動をさらに特徴付けるために、各細胞の曲線記述子を互いにプロットし、異なるクラスターを抽出しました(図5H-J)。t_開始とC_maxとの間に明確な相関関係は与えられていない(図5H):最大の2つの集団は、分泌開始とは無関係に初期の低分泌者と高分泌者であった。t_startとSR_lin(図5I)の関係を考慮すると、ほとんどの細胞は初期の遅い分泌物であり、初期の高分泌物の明確な集団と、遅い/中程度から遅い分泌物はほとんどありませんでした。SR_lin と C_max の相関関係に関しては、高速低分泌分泌物から中分泌分泌物はほとんど存在せず、高速低分泌分泌物の集団が多かっただけです。さらに、最大測定濃度に依存しない高速分泌物の大規模な集団と、低速または高速分泌の2つの高分泌物集団がありました。要約すると、個々の細胞の曲線記述子間の関係を調査すると、はるかに詳細な分析が得られ、単一細胞分泌測定から新しい生物学的知見を抽出できる可能性があると結論付けることができます。

上記で紹介した解析により、共分泌細胞の分泌動態を抽出しました(図6)。2つの例の曲線は、両方のサイトカインが同時に開始する(図6A)か、またはIL-6が最初に分泌される(図6B)逐次分泌開始を持つ2つの単一細胞からのIL-6およびTNFαの共分泌の異なるダイナミクスを示しています。すべての共分泌細胞を分類するために、60分の分泌遅延が定義され、この範囲内で分泌を開始するすべての細胞は同時分泌因子と見なされ、遅延が長いすべての細胞は逐次分泌因子と見なされます。この分析により、どのサイトカインが最初に分泌されたかを観察することも可能になりました。IL-6とTNFαでは、主に同時共分泌が細胞の76%で観察され(図6C)、IL-6とIL-1βでは、細胞の86%で連続的な共分泌が観察され、IL-6はほとんどの場合最初に分泌されるサイトカインでした(図6D)。

すべての個々の共分泌細胞の異なるサイトカインの分泌開始時間を見ると、実施された実験では分泌開始時間の間に明確な相関関係は観察されませんでした。IL-6とTNFαの共分泌(図6E)では、0分前後のより大きな垂直クラスターが存在し、これはIL-6から始まる共分泌細胞に対応していました。IL-6とIL-1βの共分泌(図6F)では、ほとんどの細胞が測定開始前後にIL-6を分泌し始め、IL-1βは主に後で分泌されました。要約すると、ここで紹介した解析により、異なる分泌因子亜集団と複雑なサイトカイン共分泌動態の同定が可能になりました。

図5:単一のIL-6分泌細胞曲線のさまざまな分泌動的パターンの詳細な分析(A)適合したS状結腸曲線と抽出されたパラメータを使用した測定時間にわたる代表的な単一細胞サイトカイン濃度データ。(B-D)LPS刺激後のIL−6分泌について見出される異なるサイトカイン分泌型についての3つの例示的な単一細胞サイトカイン濃度曲線。(E-G)IL-6分泌細胞の割合は、以下の基準で異なる分泌型に分類される：E.C_最大：低<5nM、高>19.5nM、F.t_開始:早<30分、遅>120分、G.SR_リン:遅い<250分子/秒、速い>750分子/秒）(H-J)3つの分泌曲線記述子間の関係C_max、 t_開始と SR_lin は個々のセルごとに (n=633)。C_max=20nMの大きな集団は、アッセイの検出上限に達した結果です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:単一細胞濃度曲線からの共分泌パターンの抽出 (A-B) IL-6およびTNFαをそれぞれ同時に、(B)連続して共分泌する単一細胞の代表的な濃度曲線。(C-D)IL-6とTNFα(n = 249)、またはIL-6とIL-1β(n = 72)の同時および連続的な共分泌を示す細胞の割合。逐次分泌は、サイトカイン分泌開始間の遅延が60分を超えることで定義されます。色は、どのサイトカインが最初に分泌を開始したかを示します。(E-F)各分泌細胞の異なるサイトカインの分泌開始時間との関係(n_IL6-TNFα=249、n_IL6-IL1β=72)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

サイトカインの放出と分泌は、免疫学や臨床医学で頻繁に研究されています³。サイトカイン分泌の不均衡は、感染症に苦しむ患者だけでなく、神経疾患、炎症、または癌にも有害な影響を与える可能性があります26,27,28。サイトカインが健康や疾患において重要であるにもかかわらず、現在の方法論では、単一細胞に由来するサイトカインを時間分解的に正確に検出および定量することができないため、サイトカインとその分泌細胞の研究は依然として困難です。ここで紹介するワークフローでは、PBMCによる確立された刺激プロトコルを使用し、IL-6、TNF-α、およびIL-1βの分泌を測定しました。個々の精製された亜集団の代わりにPBMCを使用するという選択は、IL-6、TNF-α、IL-1β29などの炎症誘発性サイトカインの血漿濃度が高いことを特徴とする状態であるサイトカイン放出症候群(CRS)²³を調査するための以前のアプリケーションから生じました。CRSは通常、1つの集団だけに関連しているわけではないため、PBMCはin vivoに存在するため、PBMCを使用しました。しかし、科学的な問題がこのステップを必要とする場合、細胞の亜集団を個別に精製して評価することができます。インキュベーション時間、刺激条件、および動的アッセイ範囲は、目的の3つのサイトカインの分泌を測定するために最適化されました。ここで紹介するワークフローとデータは、複数のサイトカインの時間分解シングルセル分泌を設定、キャリブレーション、定量、測定、および解析する方法を示しています。このプロトコールは、サイトカイン分泌の多機能解析により、患者に分泌されるサイトカインの大きな機能的および動的多様性をどのように可能にするかについての青写真を提供します。

記載されているアッセイプロトコルのいくつかの重要な側面により、独自の生物学的読み出しが可能になります。まず、マイクロ流体液滴にシングルセルをカプセル化することで、個々の細胞のデータを抽出することができました。複数の細胞カプセル化のイベントを検出し、研究課題に応じて画像解析によって分類または分類することができます。第二に、いくつかの独立した液滴内蛍光免疫測定法を組み込み、官能基化されたナノ粒子を整列させることで、最大3つのサイトカイン濃度を並行して定量的に測定することが可能になりました。このマルチプレックス化により、単一細胞レベルでのサイトカイン共分泌パターンの解析が可能になりました。第三に、液滴の固定化により、各分泌細胞のサイトカイン分泌の時間的な測定と相関が可能になり、同時分泌と逐次分泌を区別することができました。時間分解能は、さまざまな分泌型タイプの分泌パターンと亜集団に関するデータを独自に提供しました。最後に、並列化された画像解析により、20,000を超える個々の細胞を使用した測定値から大量のデータを効率的に抽出および追跡することが可能になりました。単一分泌曲線からの抽出により、表現型の亜集団および機能の発見がさらに可能になった。

そのユニークな読み出しに加えて、このアッセイには標準的なサイトカイン分析よりも技術的な利点があります。カプセル化コンパートメントのサイズが約60 pLと小さいため、分泌されたサイトカインの絶対量を生物学的ソースから直接検出でき、検出限界は細胞分泌に適合します。また、アッセイの小型化では、高価なバイオ試薬を少量使用します。さらに、このセットアップには特殊な機器がほとんど必要なく、多くの場合、生物学や生物工学の研究室ですでに利用可能です。蛍光顕微鏡は広く利用可能であり、シリンジポンプはバイオエンジニアリング研究所で頻繁に使用されるか、比較的低コストで購入できます。細胞培養が存在する場合、実験の実行に必要な全装置の費用は約148,000ユーロで、その大部分は全自動落射蛍光顕微鏡(130,000ユーロ)によるものです。ただし、このような機器は生物学研究所でよく見られ、残りの費用はシリンジポンプ(13,000ユーロですが、より安価な代替品が利用可能です)とより小さな機器に分配されます。液滴チップと観察チャンバーの製造は非常によく説明されており¹⁷ 、ほとんどのバイオエンジニアリングラボに存在するオーブンやプラズマクリーナーなどの必要なインフラストラクチャを備えたクリーンルーム環境の外で実行できます。あるいは、関心のあるラボに液滴発生器チップを供給するために、さまざまなサプライヤーが利用可能です。必要な量が小さいため、アッセイは費用対効果が高く、セットアップも簡単です。

最高度の再現性を確保するために、プロトコルの成功のためのいくつかの重要なステップを特定しました。初めてのユーザーにとって一般的な問題は、測定中の液滴の動きです。解析ソフトウェアは個々の液滴をある程度追跡できますが、過度の動きは単一細胞の分解能の低下と不正確な結果につながります。動きは、適切な気密測定チャンバーを使用し、液滴サイズとチャンバーサイズを修正し、測定を開始する前に短い平衡化期間を設け、界面活性剤を適切な濃度にすることで回避できます。もう1つの重要なステップは、測定を開始する前に正確なピントを合わせることです。焦点が適切でないと、蛍光再配置値が大幅に低下し、分泌されるサイトカインの量が過小評価されます。最後に、手元にある問題とプロトコルにもよりますが、再現性のためには、異なるステップ間の正しいタイミングが最も重要です。特に、チャンバーへの充填から測定開始までの待ち時間は一定である必要があり、そうしないと、分泌されたサイトカインの測定ウィンドウを逃す可能性があります。

提示された技術の限界には、カプセル化後に細胞をさらに操作する能力が制限されることが含まれる。したがって、現在、覚醒剤、抗体、または追加の試薬を追加または除去することはできません。さらに、細胞は単離されたバイオリアクターにカプセル化されているため、測定中に細胞間の相互作用(接触ベースまたはパラクリンシグナル伝達)は起こりません。この制限は、事前にバルクインキュベーションを行うことで部分的に克服できます。さらに、分泌されたサイトカインによる自己分泌効果の増強も可能であり、抗体が検出した分泌サイトカインのみが測定されるため、これらの影響を確実に定量化または排除することはできません。したがって、サイトカイン分泌に関する孤立した見解は、常に対応する問題とアプリケーションの文脈で説明する必要があります。ただし、この制限は、カプセル化された倍数、ダブレット、および関心のある場合は 3 倍子の詳細な研究にも使用できます。これは、細胞間接触やパラクリンベースの問題を調査するのに役立つ興味深い設定を提供します。最後に、アッセイのダイナミックレンジも限られており、特定のアプリケーションに適応する必要があります。ここでは、アッセイのダイナミックレンジを、測定されたサイトカインの予想される分泌量に適合させました。

アッセイの能力と適用性をさらに向上させるために、将来的には、生物学的、技術的、およびデータ分析の面でいくつかの開発に取り組むことができます。生物学的な側面では、アッセイを適応させることにより、追加のサイトカイン、他の分泌タンパク質、代謝マーカーまたは細胞表面マーカーの測定を統合できます。さらに、このアッセイは、他の細胞ベースのアッセイと並行してワークフローに統合し、リードアウトの幅を広げることができます(例:フローサイトメトリー染色やシーケンシング)。さらに、液滴の生成と観察のための統合マイクロ流体チップを作成するなど、アッセイの使いやすさを簡素化できるため、臨床現場のバイオエンジニアリング研究室の外部でより広範なアプリケーションを実現できる可能性があります。データ解析に関しては、自動化を強化し、機械学習アプローチを使用して、蛍光標識なしで各液滴中の細胞とビーズラインの存在と位置を検出することにより、画像からの情報の抽出と追跡を拡張することができます。そうすることで、イムノアッセイに使用できる追加の蛍光チャンネルが開き、さらに多くのサイトカインを並行して測定できるようになります。

提示されたアッセイおよび関連するプロトコルおよび分析は、サイトカイン分泌ダイナミクスに関連する多様な潜在的なユースケースに適用できます。具体的には、このアッセイは、細胞タイプおよび活性化特異的なサイトカイン分泌プロファイルの同定、サイトカイン分泌細胞の多機能性、サイトカインバランスの時間性および維持メカニズムなどの基本的な免疫学的問題に対処できる可能性があります。さらに、臨床応用では、このプラットフォームは、COVID-19で観察されたように、活動的または慢性的な炎症反応中のサイトカインの役割を解明することを可能にしたり、自己炎症³¹などのユニークなシグネチャに基づいて患者を層別化し、治療を個別化するためのツールを提供する可能性があります。結論として、単一細胞からのサイトカイン分泌の定量的な時間分解評価は、特定の薬物、感染、遺伝子改変、またはex vivo刺激が特定の応答をどのように誘導するかを解明するため、非常に必要な方法です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
008-フルオロ界面活性剤	RAN Biotechnologies	008-フルオロ界面活性剤-10G
2-ストリームフローフォーカシング液滴メーカー、30 & マイクロ;mノズル、PFOS疎水性表面処理	Wunderliチップ、
Alexa Fluor 647、NHSエステル	サーモフィ	ッシャーA20006	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html
アンチヒューマンIL-1&ベータ;(モノクローナルマウス)、AF647ラベル付き	PeproTech	500-M01B
ARcare92524両面粘着テープ	Adhesvies Reasearch	ARcare92524
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm	Ademtech	Cat#03233
Biotinylated Goat Anti-Human IL-1β	PeproTech	500-P21BGBT
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059
Cell Scraper	TPP	99002
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34557	細胞染色液
Chromafil Xtra PTFE-45/25 シリンジフィルター	Macherey-Nagel	729205
Costar 6-well Clear Flat底部 超低アタッチメント	Corning	3471
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D-Biotin	Fluorochem	M02926
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14196-094
EPT.I.P.S. 標準2-200&マイクロ;l	エッペンドルフ	30000889
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液	Sigma-Aldrich	3690
EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin	ThermoFisher	A39259	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217
FcR ブロッキング試薬、ヒト	Miltenyi Biotec	130-059-901
ウシ胎児血清	Gibco	10270-106
ハンディ食器用洗剤	Migros	5.01002E + 11
HEPES(1 M)	Gibco	15630-080
HFE-7500 Oil 3M TM Novec	Fluorochem	B40045191
Idex F-120 フィンガータイト ワンピース フィッティング、標準ローレット、天然 PEEK、1/16" OD チューブ、10-32 コーン	コール パーマー	GZ-02014-15
IL-6 モノクローナル抗体 (MQ2-13A5 - ラット)、FITC	ThermoFisher	11-7069-81
IL-6 モノクローナル抗体 (MQ2-39C3)、ビオチン	サーモフィ	ッシャー13-7068-85
ノックアウト血清交換	サーモフィ	ッシャー10828-010
ロックタイトAA3491硬化型UV接着剤	ヘンケルAG&Co	3491
顕微鏡スライド(76x26x1mm、クリアホワイト)	Menzel Gläser
鉱物油ライト	Sigma-Aldrich	330779
NanoPortアセンブリヘッドレス、10-32コーン、1/16インチOD	Idex	N-333
ネオジムブロックマグネット	K&J Magnetics	BZX082
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS	Braun	9161406V
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	P4417
Pluronic F-127, 0.2 µm フィルター (水溶液 10%)	サーモフィッシャー	P6866
精密ワイプ	Kimtech Science	5511
PTFE マイクロチューブ 0.30 × 0.76 mm	FisherScientific	1191-9445
PTFE マイクロチューブ 0.56 × 1.07 mm	FisherScientific	1192-9445
組換えヒト IL-1&β;	Peprotech	Cat#200-01B
組換えヒト IL-6	Peprotech	Cat#200-06
組換えヒト血清アルブミン (HSA)	Sigma-Aldrich	A9731
組換えヒト TNF-α	Peprotech	Cat#300-01A
再利用可能な生検パンチ 直径 0.75 mm および 6 mm	スティーフェル	504529 and 504532
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11835-030
Standard LPS, E. coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
ステリカン針 23 G 直径0.56 mmのマイクロチューブ	FisherScientific	15351547
ステリカン針 27 G 直径0.30mmのマイクロチューブ用	FisherScientific	15341557
TNF alpha モノクローナル抗体 (MAb11)、PE	ThermoFisher	12-7349-81
TNF-alpha モノクローナル抗体 (MAb1)、ビオチン化	ThermoFisher	14-7348-85
トリパン ブルー ステイン (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	T10282
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99500
Devices
Cameo 4 自動切断機	シルエット
Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS 低圧シリンジポンプ	Cetoni	NEM-B101-03 A
Countess II 全自動セルカウンター	サーモフィッシャー
倒立型落射蛍光顕微鏡 Ti2	ニコン	ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1
OKO ラボケージインキュベーター、ダークパネル	OKO Lab
ORCA-Fusion デジタルCMOSカメラ	ハマツ	C14440
SOLA ライトエンジン	ルーメンコール	sola 80-10247