自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

Summary

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。

Abstract

シナプス接続により、ニューロン間の情報の交換と処理が可能になります。興奮性シナプスのシナプス後部位は、しばしば樹状突起棘上に形成されます。樹状突起スパインは、シナプス可塑性、神経発達、神経疾患、精神疾患を中心とした研究で非常に興味深い構造です。樹状突起スパインは、その生涯の間に構造的変化を受け、総スパイン数、樹状突起スパインのサイズ、形態学的に定義されたサブタイプなどの特性は、さまざまなプロセスに応じて変化します。樹状突起スパインのこれらの構造変化を制御する分子メカニズムを明らかにするには、形態学的測定が必要です。これにより、実験的証拠を提供するために、正確で再現性のある樹状突起スパイン分析が義務付けられています。本研究では、Neurolucida 360(自動三次元ニューロン再構成ソフトウェア)を使用した樹状突起脊椎の定量化と分類のための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルにより、総脊椎密度、脊椎頭容積、脊椎サブタイプへの分類などの主要な樹状突起スパイン特性の決定が可能になり、樹状突起スパインの構造表現型の効果的な分析が可能になります。

Introduction

樹状突起スパインは樹状突起の突起であり、しばしばグルタミン酸作動性シナプスのシナプス後部位を構成する^1,2。樹状突起スパインは、シナプス可塑性の分野で特に興味深いものです。棘は、シナプスの強度が変化するとしばしば変化し、長期のシナプス増強では大きくて強くなり、長期的なシナプス抑制では小さくて弱くなります3,4,5,6,7。シナプス可塑性を超えて、樹状突起スパインのプロファイルは生涯を通じて変化します。初期の発達では、樹状突起スパインの形成と成長の期間があり、その後、定常状態に達するまで樹状突起スパインの剪定が行われます^8,9,10。老化した脳では、脊椎の喪失は脳の萎縮と認知機能の低下を伴います¹¹。さらに、多くの神経学的、神経変性、および精神医学的障害は、異常な樹状突起棘によって特徴付けられます。統合失調症に罹患した個人の複数の脳領域は樹状突起棘が少なく、これはおそらくシナプス刈り込みの変化に起因する¹²。自閉症スペクトラム障害は、樹状突起脊椎の病状によっても特徴付けられます¹³。樹状突起脊椎の喪失は、アルツハイマー病とパーキンソン病の両方の特徴です^14,15。樹状突起スパインの特性の調査を含む幅広い研究トピックを考えると、正確なスパイン定量化の技術は最も重要です。

染色、すなわちゴルジ法、または色素充填または蛍光タンパク質の発現によるニューロンの標識は、樹状突起スパインの可視化のための一般的な方法である16,17,18。可視化されたスパインは、無料および市販のさまざまなソフトウェアクライアントで解析できます。分析の望ましい出力は、どのソフトウェアが最も使用されるかを決定する重要な要素です。フィジーは、樹状突起スパイン密度を中心とした問題に対する実行可能なソフトウェアオプションです。ただし、この手法は、バイアスの可能性をもたらす可能性のある時間のかかる手動カウントに大きく依存しています。SpineJなどの新しいプラグインでは、自動定量化が可能になり、さらにより正確な脊椎頸部分析が可能になります¹⁹。これらのアプローチの欠点は、SpineJが2次元の画像スタックに限定されているため、脊椎の体積を決定するための3次元分析が失われることです。さらに、これらのプロセスを介して脊椎のサブタイプ情報を取得することは困難になります。細い、キノコ、ずんぐりした、糸状足の4つの主要な脊椎サブタイプは、すべて個々の機能を暗示し、形態学²⁰によって大きく分類されます。細い棘は、細長い首と明確な頭²¹によって特徴付けられます。キノコの棘は、はるかに大きく、顕著な背骨の頭^{を持っています22}。ずんぐりした棘は短く、頭と首の間のばらつきがほとんどありません²³。糸状足は未熟な棘で、長くて細い首を持ち、明らかに観察できる頭はありません²⁴。分類は貴重な情報を提供しますが、スパインは連続した次元に存在します。カテゴリーへの分類は、形態学的測定の範囲に基づいています^25,26。分類のためにスパインを手動で測定すると、このアプローチでは研究者の物流上の負担が増します。

特に3次元樹状突起スパイン解析に焦点を当てた他のソフトウェアオプションは、スパインの体積とサブタイプの特性^{27、28、29、30、31}の調査に適しています。3次元解析では、z面の解像度の低さや汚れなどの困難さにもかかわらず、これらのソフトウェアオプションにより、ユーザーガイドによる半自動方式で樹状突起や樹状突起スパインの信頼性の高い3次元再構成が可能になります。同定されたスパインをそのサブタイプに自動的に分類することも、これらのスパイン解析ソフトウェアパッケージの一部に存在する機能です。これにより、潜在的なワークロードと実験バイアスの懸念を改善できます。Neurolucida 360は、信頼性と再現性のある3次元樹状突起脊椎の同定と分類を可能にする市販のソフトウェア1つです³²。ここでは、このソフトウェアを使用して固定組織を効果的に調製し、画像を取得し、最終的に樹状突起スパインを定量および分類するための包括的なプロトコルを紹介します。

Protocol

すべての動物用処置は、学内研究における動物の使用に関する米国国立衛生研究所ガイドラインに従い、国立精神衛生研究所の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.固定海馬スライスの調製

1. ケタミン/キシラジン(ケタミン:100 mg / kg;キシラジン:8 mg / kg)。.テールピンチで麻酔を検証し、マウスを灌流プレートに貼り付けます。
2. 大きな手術用ハサミを使用して、胸部の皮膚と被毛を取り除き、下にある胸郭の視覚化を容易にします。
3. 肝臓と横隔膜を避けて、胸郭の幅より下に水平に切り込みを入れます。細い鉗子を使用して、剣状突起を引き上げ、胸郭の両側を切断します。胸郭を首の領域まで跳ね上げ、止血鉗子を使用して所定の位置にクランプします。
4. 21 Gのバタフライ針を心臓の左心室に挿入し、室温の1x PBSで約5 mL /分で灌流を開始します。小さな手術用ハサミで右心房に小さな切り込みを入れます。心房を出る溶液が透明になるまでPBSで灌流します。
5. 灌流ポンプをオフにして、気泡がチューブに入らないようにします。PBSのチューブをPBS中の氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れます。動物が完全に硬化するまで、PFAを5 mL/分の速度で灌流します(約25 mL)。
   注:最適な固定のために、PFAが新鮮であることを確認してください(ストックが4°Cで保存されている場合は1週間以内)。
6. 小さな手術用ハサミで頭蓋骨の表面から皮膚を取り除きます。頭蓋骨の中央の亀裂に沿って小さな手術用ハサミで中矢状に切り込みを入れます。嗅球と小脳の上に横方向の切り傷を吻側に作ります。
7. 細かい鉗子で頭蓋骨を開き、脳を露出させます。へらを使用して、嗅球から脳をそっとすくい取り、PBSに4%PFAを一晩入れます。
   注:げっ歯類灌流のより包括的なプロトコルについては、Gageら³³を参照してください。
8. 4% PFA を PBS 中の 15% スクロースに 1 日間置き換えることにより、固定脳を凍結保護します。これに続いて、脳が溶液に沈むまで、15%スクロースをPBS溶液中の30%スクロースに1日間置き換えます。
9. スクロース溶液から脳を取り出し、PBSを入れたシャーレに入れます。メスの刃を使用して小脳と嗅球を切り取ります。
10. 直径1〜2cmの最適な切断温度コンパウンド(OCT)を試料ホルダーの表面に少量置きます。OCTで尾側の切断面を使用して脳を標本ホルダーに冠状に取り付けます。試料ホルダーを粉砕したドライアイスに置き、目に見えるように凍るまで約5〜7分間、脳を急速凍結します。
11. クライオスタットのブレード角度が0°から5°の間で設定されていることを確認して、均一なセクションを作成します。ロールプレートの角度を調整して、スライスを最適に平坦化します。具体的な手順については、機器のマニュアルを参照してください。
12. 検体ホルダーを、脳の腹面をブレードに最も近い状態でクライオスタットに置きます。脳を30μmの背側海馬切片に切り取り、吻側から海馬までのすべてのスライスを捨てます。
    注:プロトコルのこの部分は、選択した任意の望ましい脳領域に適合させることができます。ステップ 1.9 から 1.12 は、関心のある地域によって異なります。
13. 背側の海馬スライスをPBSに移します。絵筆を使用して、海馬切片を顕微鏡スライドにそっと取り付けます。綿棒またはデリケートなタスクワイプで余分な溶液を取り除きます。
14. 100 μLのハードセット封入剤を顕微鏡スライドに塗布し、すべての脳スライスを覆います。気泡を防ぐため、鉗子を用いてカバーガラスを封入剤にゆっくりと下ろします。気泡が発生した場合は、鉗子でカバーガラスを軽くたたいて、泡を逃がします。イメージングする前に、スライドを一晩置いてください。

2. 高解像度共焦点イメージング

1. 低倍率の接眼レンズを使用して、蛍光細胞を同定します。63倍(NA = 1.4)以上の対物レンズに切り替え、対物レンズに適切な液浸媒体を適用します。
   注:最良の結果を得るには、63倍以上の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してください。
2. 画像取得のために、オーバーラップが限られている適切に標識された樹状突起セグメントを特定します。レーザー出力とゲインを設定して、蛍光樹状突起が飽和しないようにします。さらに、スキャン速度を遅くすると、画像の解像度が向上します。
3. 将来の解析のために、完全な樹状突起セグメントを包含するzスタックを取得します。10 μm を超える Z スタックは、Z 平面に樹状突起が重なる可能性があるため、望ましくありません。
   注:利用可能な最小のzステップサイズ(0.2-0.7μm)と1つのエアリーユニットピンホールサイズを利用します。ステップサイズが小さいほど、Zスタック内の画像が多くなり、多くの顕微鏡の限られたZ解像度を補うことができます。
4. オプション:可能な場合は、顕微鏡のそれぞれのデコンボリューションソフトウェア機能を利用して画像をデコンボリューションします。これにより、より高解像度の画像が可能になります。

3. 樹状突起スパインの定量化

1. Neurolucida 360 (v2022.1.1 以降) を開きます。脊椎解析ソフト( File > Open > Image)で画像ファイルを開きます。画像ファイルがメインウィンドウと3D環境に表示されていることを確認します。 3D環境 ウィンドウが表示されない場合は、メインウィンドウ上部のツールバーの [トレース ]タブにある[3D環境]を左クリックします(補足図1)。
   注:プロトコルのこのセクションは、マウス組織からの樹状突起だけでなく、任意の樹状突起画像に適合させることができます。
2. [3D 環境]ウィンドウの[イメージ表示の変更]タブで、[イメージの表示形式]ボックスにイメージが [3D ボリューム]として表示されていることを確認します。[イメージ]タブの[イメージ スタック設定]ボックスで、[サーフェスの表示形式]ドロップダウン メニューの[最大投影]を選択します。(補足図2)
3. トレースに適した樹状突起セグメントを特定します。
   1. 3D 環境ウィンドウの上部ツールバーにある Move Pivot Point ツールを左クリックします。目的の樹状突起を左クリックして、新しいピボットポイントを設定します。これにより、向きが変更され、効果的なズームインが可能になります。
   2. 「 Reset Orientation 」アイコンを左クリックして、元の向きを再設定します。ピボットポイントを設定したら、 Move Pivot Point ツールを左クリックして樹状突起のトレースを開始します。(補足図2)。
      注:理想的な樹状突起とは、どの座標平面でも他の樹状突起との重複が限られており、別の樹状突起と交差していない、またはその下の別の樹状突起と表面的に交差していない樹状突起です。XY平面内の他のものへの近接性が低い樹状突起も、トレースされた樹状突起への隣接する棘の不適切な割り当てを防ぐために好ましい。また、体細胞からの距離が異なる厚さ、次数、および距離の樹状突起は、樹状突起スパイン密度^34,35が異なることにも注意しなければならない。これは、実験計画で考慮する必要があります。厚さ<1.5μmの二次状突起は、トレースの理想的な候補です(図1)。
4. [3D 環境] ウィンドウの [ツリー] タブを左クリックします。トレースモードの場合は「User-Guided」を、メソッドとして「User-Guided Tracing Options」の「Directional Kernels」を左クリックします。
5. 樹状突起を左クリックすると、円形のカーネルが表示され、トレースが開始されます。樹状突起セグメントに沿ってカーソルを移動します。これにより、カーネルが自動的に入力されます。カーネルが自動的に入力されない場合は、ステップ 3.51 を参照してください。
   1. カーネルが入力されるまで、カーソルを樹状突起上でゆっくりと前後に動かします。左クリックすると、検出された既存のカーネルが保持されます。カーネルが入力を停止した場合は、カーネルが樹状突起のさらに下に入力されたときに左クリックして、手動でカーネルを配置します。右クリックしてトレースを終了します。トレースされた樹状突起の長さが7μm以上であることを確認してください(補足図3)。
6. 3D 環境の 3 つの方向 (ピッチ、ヨー、ロール) すべてを使用して、樹枝状トレーシングの精度を確認するには、 3D 環境 ウィンドウを左クリックしてドラッグします。樹状突起トレースが樹状突起の適切な位置の外側にある点を特定します。上から下に正確にトレースされているように見える場合がありますが、Z 次元では、点が樹状突起上にありません (図 2)。
7. 不適切にトレースされた樹枝状セグメントを修正するには、ツリーメニュー内の編集タブを左クリックします。対象の樹状突起を左クリックし、[ポイント]を左クリックします。
9. 画像内の複数の樹状突起について手順3.3〜3.8を繰り返してから、手順3.10の脊椎の識別に進みます。
10. 3D 環境ウィンドウの Spine タブを左クリックします。[Outer Range]、[Minimum Height]、および [Minimum Voxel Count] の検出設定を設定します。準備によっては、変更の明確で具体的な理由がある場合に、プリセット値を変更する必要がある場合があります。プリセット条件は、Outer Range:2.5 μm、Minimum Height:0.3 μm、Minimum Voxel Count:10 Voxelsです。
    注:細胞培養と急性組織など、調製物が異なれば、発生の時点も異なるため、既存の文献から導き出さなければならない異なる基準が必要になります。また、検出設定を変更すると、結果が大幅に変わる可能性があることに注意することも重要です。たとえば、最小の高さを高くすると、背の低い脊椎を除外できます。検出設定は、実験の全過程を通じて一貫している必要があります。
11. [Detector Sensitivity] を 70% に設定し、[Detect All] をクリックします。これにより、この検出器の感度によって識別されたスパインがすべての樹状突起に装着されます。樹状突起固有の方法でスパインを選択する場合は、[Click Image to Detect All on Nearest Branch]ボックスを左クリックし、検出器の感度が異なる各樹状突起を手動で左クリックします。
    注:この段階では、すべての樹状突起スパインが出現するわけではないのは正常です。同様に、非背骨が不適切に入力される可能性があります。最初の70%の感度も柔軟です。これは準備によって変わる場合があります。
12. この検出器の感度によって選択されたスパインを調べるには、樹状突起を3方向すべてにクリックしてドラッグします。検出されたスパインの大部分が完全に充填されていない場合は、手順 3.12.1 に進みます。検出されたスパインがいっぱいになっている場合は、手順 3.12.2 に進みます。検出されたスパインが十分に充填されていると思われる場合は、手順3.13に進みます。
    1. [Detector Sensitivity] を 5% から 10% 上げ、[Detect All] をもう一度クリックします。これにより、以前に検出されたすべてのスパインが、より高い感度の新しいスパインに置き換えられます。検出されたスパインが十分に満たされるまで、必要に応じて繰り返します。
    2. [Detector Sensitivity] を 5% から 10% 下げて、[Detect All] をもう一度クリックします。これにより、以前に検出されたすべてのスパインが、感度の低い新しいスパインに置き換えられます。検出されたスパインが十分に満たされるまで、必要に応じて繰り返します。
13. 3D 環境の Spine タブで Keep Existing Spines を左クリックします。「画像をクリックして最近傍ブランチのすべてを検出する」が選択されている場合は、選択を解除します。
    注:[ 既存のスパインを保持] をオンにすると、新しく識別された樹状突起スパインを手動で識別しても、以前に識別されたスパインが上書きされなくなります。前の作業が上書きされないように、先に進む前にこのボックスが選択されていることを確認してください。
14. [Move Pivot Point] を左クリックし、ピボット ポイントを設定するためにさらに背骨を検出する必要がある樹状突起を左クリックします。
    1. 「ピボットポイントを移動」の選択を解除します。未充填の樹状突起スパインを特定します。検出器の感度を前の検出よりも10%〜20%上げ、脊椎を左クリックします。検出されたスパインが不足または過剰に充填されている場合は、手順 3.14.3 または 3.14.4 に進みます。スパインが入力されない場合は、「選択した位置でスパインを検出できません」というメッセージが表示されます。この場合は、ステップ 3.14.2 に進みます。
    2. 検出器の感度を段階的に、場合によっては100%以上に上げて、スパインが検出されて適切に満たされるまで上げます。スパインが検出されても充填が不十分な場合は、手順 3.14.3 に進みます。脊椎がいっぱいになっている場合は、手順3.14.4(図3)に進みます。
    3. [編集]タブを左クリックし、埋められていない脊椎を左クリックします。[削除] をクリックします。「編集」タブの選択を解除します。感度を5%〜10%上げ、背骨を左クリックします。背骨がまだ充填されていない場合は、この手順を繰り返します。
    4. [編集]タブを左クリックし、オーバーフィルされたスパインを左クリックします。[削除] をクリックします。「編集」タブの選択を解除します。感度を5%〜10%下げて、背骨をクリックします。脊椎がまだいっぱいになっている場合は、この手順を繰り返します。
15. 目視による識別によって識別されたすべてのスパインが検出されるまで、手順3.14〜3.14.4を繰り返します。樹状突起に、隣接する樹状突起に属する棘、真の信号がないと対応している偽の棘、または脊椎として誤ってラベル付けされた樹状突起の潜在的なセグメントがないか、樹状突起を再確認してください。これらの偽のスパインは 、削除 機能を使用して削除します。
16. 樹状突起の特定された棘を調べます。場合によっては、複数のスパインが 1 つのコングロマリット スパインとして表示されることがあります。1 つの背骨が 2 つを囲んでいるように見える場合は、[ 編集 ] タブを左クリックします。背骨を左クリックし、[ 選択を非表示]をクリックします。コングロマリット スパインを確認したら、[ 編集 ] タブで [ 選択項目を表示 ] をクリックし、[ 分割] を選択します。1つのコングロマリットに2つ以上のスパインがある場合は、この手順を繰り返す必要がある場合があります(図4)。
    注意: 手順3.16を実行しても礫岩の背骨が分割しない場合は、背骨を取り外します。次に、コングロマリットのより強度の高いスパインを低い感度で選択します。より強度の高い背骨が埋まったら、感度を上げて、他の満たされていない背骨を選択します。あるいは、コングロマリットスパインを削除してから感度を上げると、適切な分割が可能になる場合があります。
17. 視覚的に識別可能なすべてのスパインが検出され、適切に入力されたら、[ Spine ] タブで [Classify All ] をクリックしたまま、スパインを 4 つのサブタイプ (thin、mushroom、stubby、filopodia) に分類します (図 5)。
    注:スパイン分類パラメータは、スパインタブの分類ボックスの設定ウィンドウで変更できます。検出器の設定と同様に、既存のパラメータを変更するための明確な理論的根拠を強く推奨します。プリセット値は、頭と首の比率:1.1、長さと頭の比率:2.5、マッシュルームの頭のサイズ:0.35μm、フィロポディウムの長さ:3μmです。
18. 3D Environmentウィンドウの上部ツールバーで、 Save and View in Neurolucida Explorerを選択します。Neurolucida Explorerは、トレースからデータが収集される場所です。作業は、すべてのトレースとスパインを含む.datファイルとして保存されます。
19. [エクスプローラ]ウィンドウの [表示 ]タブで、[ すべて選択 ]を左クリックして、すべての樹状突起とスパインをハイライト表示します。
20. 上部ツールバーの 「分析 」タブを左クリックします。 「Structure 」ドロップダウンメニューを左クリックします。 [分岐構造解析]をクリックします。
21. 対象の変数に応じて、任意の分析を選択できます。脊椎の密度と平均脊椎体積を中心とした質問に最も役立つのは、各樹状突起>と脊椎>脊椎の詳細の2つです。[OK] を選択すると、データが 2 つの別々のウィンドウに表示されます。
22. データをスプレッドシートにコピーして、さらにコンパイルおよび分析します。
    注:個々のツリーは樹状突起で区切られますが、背骨のボリュームは分離されません。スプレッドシートの並べ替え機能を使用すると、背骨の詳細を機能でフィルタリングできます。

Results

この解析方法を効果的に活用するには、トレースする樹状突起セグメントを選択することから始まります。 図1で説明したように、トレースに理想的な樹状突起は、他の樹状突起に近接していません。樹状突起が並行して実行されると、隣接する樹状突起からスパインが不適切に識別される可能性があります。樹状突起は、異なるz平面で直接交差するか、垂直に走っているため、正確な樹状突起トレースも非常に困難になります。樹状突起の厚さの違いに注意することも重要です。以前に報告されたように、背骨の密度には、さまざまな厚さの樹状突起による重要な違いがあります³⁶。また、分岐点³⁷からの距離が長くなると、同じ樹状突起に違いが生じることもある。同じ順序と厚さの樹状突起をトレースし、理想的には同様の分岐点の起点を持つ樹状突起を追跡することで、樹状突起スパイン密度の既存の不均一性を制御できます。一部の調製物で分岐点を特定することは実行不可能であることが判明するかもしれませんが、樹状突起の厚さは常に樹状突起追跡の制御可能な要素であるべきです。樹状突起セグメントの正確なトレースは、この分析から正確な結果を得るために不可欠です。トレースされた樹状突起のすべての点が本当に樹状突起内にあることを確認する必要があります。3次元の樹状突起をさまざまな方向から見ると、このプロセスに役立ちます。 図2A、Bに示すように、上から見下ろしたビューは、適切にトレースされた樹状突起のように見えるものを示しています。側面図で;ただし、樹状突起自体には多数の点が配置されていません。これらの問題は、 図 2C の側面図には表示されません。また、トレーシング中に樹状突起が適切に充填されていることを確認することも重要です。樹状突起が十分に充填されていないと、樹状突起の断片が棘として不適切に識別される可能性があります。樹状突起が過剰に充填されていると、最小の高さのしきい値のために真の棘が識別されなくなる可能性があります。このユーザーガイドトレーシングの手動評価は、正確な樹状突起スパイン分析を可能にするために重要です。

樹状突起スパインの同定には、ユーザー主導のアプローチも必要です。「Detect All」機能を使用して均一な検出器感度しきい値を設定することは、多くの理由で不十分です。「Detect All」機能を使用すると、最も明白なスパインを特定するのに役立ちますが、これらのスパインの充填を確認して確認する必要があります。最初に「Detect All」と表示されている識別されたスパインは、充填が不足している可能性があります。これを修正するには、同定されたスパインを個別に削除し、より高い検出器感度で手動で再同定する必要があります(図3A-C)。これにより、背骨が適切に埋められるようになります。スパインに必要な検出器の感度には、手動で説明しなければならない大きな不均一性があります。検出器の感度を上げてすべてを検出すると、スパインが過剰に充填され、手動による修正が必要になる可能性があります(図3D)。検出器の感度が不適切な場合の追加の問題は、複数のスパインを包含する1つの充填された樹状突起スパインであるコングロマリットスパインの不適切な作成です。互いに近接している 2 つのスパインは、1 つのコングロマリット スパインに不適切にマージされる可能性があります (図 4A、B)。スパイン検出ソフトウェアには「スプリット」機能があり、過剰充填によってマージされたスパインを分離するために使用できます。「スプリット」機能により、個々のスパインをコングロマリットスパインから容易に生成できます(図4C)。正確な樹状突起のトレースと樹状突起のスパイン充填により、スパインのサブタイプに正確に分類できます。スパインの分類は、充填されたスパインからの形態と樹状突起からの距離に依存するため、プロセスのすべてのステップが形態学的分類に役割を果たします(図5)。

手動での選択としきい値処理が必要なため、すべての分析で統一された基準に従うことが重要です。これは、複数のユーザーがデータ分析に寄与する場合に特に関連します。分析を行うすべての研究者が同じ標準に従っていることを確認するために、研究者は同じトレースされた樹状突起からのデータを比較する必要があります。これにより、各研究者が盲検化された方法で共有された統一された基準に基づいて脊椎を識別していることを確認できるため、実験者のバイアスの可能性を減らすことができます。また、疲労のために、1人の研究者が日と日の間、あるいは同じ日にバイアスをかける可能性もあります。これは、データ分析のプロセス全体を通じて監視する必要があります。分析の妥当性をさらに確保するために、初期結果を文献で発表された結果と比較することで、プロトコルが効果的に守られていることを確認できます。この比較は、調製とパラメータが共有されている場合にのみ有効であることに注意することが重要です。染色、蛍光シグナルの獲得、樹状突起の順序と厚さ、または脳領域の違いは、異なる結果に寄与し得る^8,36。発表された結果が欠落している場合でも、複数の研究者を使用して脊椎の同定を検証することで、解析の信頼性と再現性に対する信頼性を高めることができます。この原稿には、補足的な解析フォルダが含まれています。樹状突起セグメント、トレースされた樹状突起、特定および分類されたスパインを持つトレースされた樹状突起のサンプル画像、およびデータ出力のファイル(補足表1、補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4)のファイルが格納されています。 新しいユーザーは、このデータ セットを使用してトレーニングを行い、このドキュメントで説明する手順を練習できます。提供されたサンプルデータセットの10%以内でユーザーが生成した結果は、分析の標準を再現するために許容できると見なされます。脊椎が完全に充填されているという潜在的に主観的な基準と、自動的に検出された脊椎の手動検査の必要性により、研究者間および研究者内の分散は分析の正常な部分です。生成された結果がそのしきい値を超えた場合。ただし、異なる脊椎の体積のインスタンスと、不適切に含まれているまたは除外された脊椎のインスタンスを特定するために、並べて比較する必要があります。その後、サンプルデータセットは、許容可能なしきい値に達するまで再分析できます。

図1:樹状突起スパイン解析のための樹状突起の選択 (A)THY1-YFPトランスジェニックマウス系統のCA1近位樹状突起から撮影されたzスタック共焦点画像の3Dボリューム表示。樹状突起の順序の不均一性に注目してください。青色の楕円形には厚い一次樹状突起があり、ピンクの楕円形には細い二次樹状突起と三次樹状突起があります。(B)樹状突起トレースの理想的な候補は、緑色の楕円で示されています。厚さと、交差、重なり、他の樹状突起との近接性が限られていることに注意してください。赤い楕円は、交差、重なり、他の樹状突起との近接性が高いため、樹状突起追跡で避けるべき樹状突起セグメントを示しています。より厚い一次樹状突起もトレースに適した候補ではありません。スケールバー = 25 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:樹状突起セグメントを正確にトレースします。 (A)ユーザーガイド指向性カーネル法により追跡するTHY1-YFPトランスジェニックマウス系統のCA1近位樹状突起から採取したz-stack共焦点画像の3Dボリューム表示。スケールバー = 10 μm. (B) 樹状突起のトレースが不十分な例。樹状突起は、上から見下ろすビューで適切にトレースされているように見えます。側面図は、樹状突起が樹状突起から逸脱した点で不適切に埋められていることを示しています。(C)適切な樹状突起トレースの例。上から見下ろすビューは B と似ていますが、側面ビューは大きく異なります。Cの樹状突起は、樹状突起からの偏差なしに完全に充填されていることで示されるように、適切にトレースされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:手動選択による樹状突起スパインの正確な充填 (A)手動検出を待っているスパインのTHY1-YFPトランスジェニックマウス系統のCA1近位樹状突起から採取したzスタック共焦点画像の3Dボリューム表示。スケールバー = 0.5 μm. (B) 充填不足の樹状突起スパインの例。充填が不完全であるため、まだかなりの蛍光シグナルが見えます。(C)適切に充填された樹状突起スパインの例。充填物の外側の周りにかろうじて見える信号の「コロナ」の存在は、樹状突起スパインを正確に充填するための標準です。(D)過充填された樹状突起スパインの例。検出器の感度が高すぎるため、スパインが過剰に埋まってしまいます。充填物は蛍光の境界を超えており、ほとんど知覚できないほどのコロナを持っています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:分裂する礫状樹状突起スパイン(A)THY1-YFPトランスジェニックマウス系統のCA1近位樹状突起から撮影されたzスタック共焦点画像の3Dボリューム表示。スケールバー = 0.15 μm. (B) 2つの独立したスパインが1つの礫状樹状突起スパインとして不適切に充填された例。(C)「スプリット」機能の使用に続いて、礫岩スパインは、適切に充填された2つの異なる樹状突起スパインに分割されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:樹状突起スパインの同定とサブタイプへの分類 (A)樹状突起の定量化と分類のために単離された追跡樹状突起セグメントのTHY1-YFPトランスジェニックマウス系統のCA1近位樹状突起から撮影されたzスタック共焦点画像の3Dボリューム表示。スケールバー = 5 μm. (B) すべての樹状突起スパインが特定され、適切な充填と分裂を確認するために検査された、トレースされた樹状突起セグメント。ソフトウェアは、この手順で識別されたスパインに任意の色を割り当てます。(C)ソフトウェアで定義されたパラメータを使用して、同定されたすべての樹状突起スパインをサブタイプに分類します。青=キノコ、黄色=細い、緑=ずんぐり。糸状仮足は、この組織の年齢のために存在しません。(D)キノコ、細くてずんぐりした棘の代表画像(上)と塗りつぶされた(下)。スケールバー = 0.3 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1: 3D 環境へのアクセス。 ソフトウェアインターフェースで表示された共焦点画像のZスタック。メイン ビューアの [トレース ] タブからの 3D 環境ナビゲーションが黄色で強調表示されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:3D環境の画像パラメータと向きの設定。 共焦点Zスタック画像用の3D環境ビューア。ハイライト表示された [イメージ表示の変更 ]タブのパラメータは、黄色の矢印で示され、[ イメージの表示形式: 3D ボリューム ]と [サーフェスの表示形式: 最大投影]に設定されています。 [ピボット ポイントの移動] と [方向のリセット] は黄色の矢印で示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:樹状突起セグメントのトレース。 (A)デンドライトトレーシング用のzスタック共焦点画像の3Dボリューム。ツリータブ、ユーザーガイドカーネル、および指向性カーネルがすべて選択されている場合、トレースは、左クリックで樹状突起に初期カーネルを配置することから始まります。(B)カーソルの動きに続いて樹状突起を下る方向性カーネルの伝播。(C)樹状突起をさらに左クリックすると、指向性カーネルが充填されます。(D)樹状突起に付着していない方向性カーネルの例。代わりに、セグメントのさらに下に 1 つのカーネルが存在します。(E)唯一のカーネルを左クリックすると、2つのポイントの間の樹状突起が埋められます。右クリックすると、トレースが終了します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:トレースされた樹状突起の調整ポイント。(A)トレースされた樹状突起セグメントの保留中のポイント調整。樹状突起の編集には、「ツリー」タブと「編集」タブを選択する必要があります。どちらも黄色で強調表示されています。Dendrite が左クリックで編集用に選択されています。(B)黄色で強調表示されているポイントタブを選択すると、樹状突起セグメント上の個々のポイントを選択できます。緑色の点の厚さは1.2μmです。緑色の点の新しい厚さの値は0.6μmです。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:サンプル画像解析結果。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:樹状突起とspines.datのサンプル画像トレース このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:dendrites.datを使用したサンプルトレース このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:サンプル樹状突起画像file.czi このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:樹状突起サンプル画像file.jpx このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルでは、サンプル調製、イメージング、および3次元再構成ソフトウェアを使用した樹状突起スパインの定量化と分類のプロセスの具体的な手順について詳しく説明します。このソフトウェアは、さまざまな調査に貢献する堅牢な構造データを生成できる強力なツールです。プロセス全体を通じて、このプロトコルを方法論的な負担を軽減し、データの全体的な出力を向上させるための重要なステップがいくつかあります。樹状突起スパインの標識方法は、研究者がこのプロトコルに着手する前に最初に考慮すべきことの1つです。スパインの定量化に関する問題は、標識方法が不十分であることから生じる可能性があります。スパインで低レベルで発現する特定のタンパク質を染色すると、ソフトウェアにとってシグナルが低すぎる可能性があります。また、最も明るい蛍光樹状突起をトレースすることでバイアスが発生する可能性があることにも注意する必要があります。異なる蛍光性樹状突起が異なる生理学的特性を持つかどうかは不明ですが、それでも考慮すべきプロトコルの制限です。さらに、THY1-YFP-H系統などの一部のトランスジェニック系統では、樹状突起スパインの蛍光はP21付近まで現れません。これにより、この系統は若年発達時点の調査には適していません。調査の手段のために脊椎を標識するために使用される方法の検討は、十分な蛍光がなければ、ソフトウェアの有用性が低下しているため、些細な側面ではありません。同様に、画像取得ハードウェアも考慮する必要があります。一部のファイルタイプは、他のファイルタイプよりも分析ソフトウェアとの互換性が低いことが証明されています。具体的には、ND2ファイルは、ソフトウェアを効果的に使用するための問題のあるファイルタイプとして特定されています。ソフトウェアプロバイダーは、問題が発生した場合に備えて、JPEG2000などのファイルタイプに変換することを推奨しています。

組織調製と画像取得も、高品質な脊椎定量のための重要なステップです。組織の適切な固定、スライス、およびマウントにより、データ解析を妨げる可能性のあるアーティファクトを最小限に抑えた長持ちするサンプルが保証されます。組織のイメージングは、単に脳スライス全体のzスタック画像を撮るだけの問題でもありません。イメージング中、常にスパイン定量化のために樹状突起を含むスタックを取得することを意図する必要があります。追跡が容易な樹状突起を組み込んだzスタックの取得に重点を置く必要があります。通常、z スタックが厚いほど、バックグラウンド デンドライトが多くなります。これにより、ソフトウェアで樹状突起を効果的に追跡することがより困難になります。イメージング中に余分な時間を費やして、トレースに適した候補を見つけることで、脊椎の定量分析にかかる時間を節約できます。さらに、z スタック イメージにトレースする樹状突起全体が組み込まれていることを確認します。樹状突起がZスタックで部分的にしか見えない場合、樹状突起のトレースと脊椎の識別は、3Dレンダリングが不完全であるため、困難で不正確であることがわかります。

樹状突起を追跡し、特定された樹状突起スパインの正確なプロファイルを取得するプロセスは、骨の折れるプロセスになる可能性があります。それにはある程度のニュアンスがあります。樹状突起トレース中、ユーザーガイド機能が意図したとおりに機能しないことがあります。場合によっては、指向性カーネルが特定のセグメントに入力されなかったり、望ましくないセグメントに入力が開始されたりすることがあります。これを回避する1つの方法は、一般的なプロセス幅を小さくすることから始めることです。これにより、ソフトウェアで樹状突起を検出しやすくなり、トレースが容易になります。指向性カーネルが完全に入力されない場合は、樹状突起を左クリックすると、樹状突起が手動で配置されます。それは非常に小さな点に来て樹状突起を埋めませんが、それはプロトコルのステップ3.8で説明されているように厚さ調整で修正することができます。ソフトウェアが不十分であることが判明した場合、樹状突起を手動でトレースすることはできますが、スパインを手動でトレースすることはソフトウェアの機能ではありません。明確な背骨が見えるように見える場合がありますが、検出器の感度がどれほど高くても、ソフトウェアはそれを検出できません。確認すべきことの1つは、疑わしい脊椎が範囲外であるかどうかです。範囲内にあるにもかかわらずソフトウェアによって識別されない場合、このスパインは分析から除外されます。これはめったに発生しないかもしれませんが、考慮すべき制限です。しきい値処理と手動の分類コンポーネントを必要とする分析と同様に、バイアスが生じる可能性があります。この問題は、複数のユーザーが生成したデータを比較すると、さらに悪化する可能性があります。この分析の半自動化された性質は、このバイアスの導入を最小限に抑えようとしていますが、完全に排除されるわけではありません。私たちの研究室では、標準的なデータセットの研究者間の10%の分散は、十分な練習とトレーニングがあれば妥当でした。バイアスを最小限に抑えるための努力が払われていますが、このプロトコルを通じて生成されたデータを評価する際には、研究者間のバイアスを考慮することが重要です。

ソフトウェアの小さな欠点を考慮すると、この手法を使用した樹状突起スパイン解析の出力は非常に堅牢です。前述のように、正確な樹状突起セグメントのトレースと脊椎の識別から推定できる指標は無数にあります。脊椎のサブタイプ情報を取得する機能は、基本的な指標よりも深いレベルで貴重な洞察を提供します。このデータは、構造と機能の間の相互接続性のために重要です。各脊椎サブタイプは、機能を暗示しています。細い棘は、豊富なターン^{オーバー21}を経験する主要なサブタイプです。細い棘もまた、キノコの棘に発展する可能性を秘めている³⁸。これは、キノコの棘が学習と記憶と強く関連していることと一致しています^38,39。ずんぐりした棘はさらに、学習の構成要素であると考えられており、キノコの棘の残骸である可能性がある⁴⁰。糸状仮足は、多くの成体組織に一般的ではありませんが、発生に重要な関心事である脊椎前駆体です^41,42。3D電子顕微鏡は、脊椎のサブタイプを最も正確に分類するためのゴールドスタンダードであり続けています。この手法は価値がありますが、人為的エラーが発生しやすい手作業による分類や分類に手間がかかるため、制限があります。この分析の半自動設計により、主観的なバイアスが持ち込まれる可能性のある事例が減少します。このプロトコルで完全な分類を行うために必要な絶対分解能と蛍光強度の点で欠点があるかもしれませんが、それでも3D電子顕微鏡法や手動分類に代わる方法論的に負担の少ない代替手段を提供します。さらに、この研究で概説した分析を使用して、より広範な脳領域から複数の樹状突起枝の完全な樹状突起分析が可能です。これは電子顕微鏡には当てはまりません。このプロトコルを使用することで、シナプスの可塑性、発生、神経学的および精神医学的障害など、複数の分野で構造中心の問題に信頼性と再現性のある方法で対処することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F 液浸オイル	ツァイス	444960-0000-000
クライオスタット	ライカ	CM3050S	スライス調製用
ファイン フォーセプス	FST	11150-10
止血鉗子	FST	13020-12
大型手術用ハサミ	FST	14002-16
LSM 880 共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM 880
顕微鏡カバー ガラス	フィッシャーブランド	12-541-035
ミニ蠕動ポンプ II	ハーバード装置	70-2027	灌流用
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	脊椎解析ソフトウェア
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	脊椎解析ソフトウェア
OCT Compound	さくらファインテック	4583	のクライオスタット切片用
	ッシャーブランド	F79-1
アポクロマート63x / 1.40オイルDIC	ツァイス	440762-9904-000
ブレード	FST10022-00
手術用ハサミ	FST14060-09
スパチュラ	FST	10091-12
スクロー	FIsherbrand	S5-500
スーパーフロスト プラス マイクロスライド	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet マウント ミディアム	ベクター ラボラトリーズ	H-1400-10