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方法論記事

自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

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DOI:

10.3791/66493

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2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

この記事について

サマリー

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。

要約

シナプス接続により、ニューロン間の情報の交換と処理が可能になります。興奮性シナプスのシナプス後部位は、しばしば樹状突起棘上に形成されます。樹状突起スパインは、シナプス可塑性、神経発達、神経疾患、精神疾患を中心とした研究で非常に興味深い構造です。樹状突起スパインは、その生涯の間に構造的変化を受け、総スパイン数、樹状突起スパインのサイズ、形態学的に定義されたサブタイプなどの特性は、さまざまなプロセスに応じて変化します。樹状突起スパインのこれらの構造変化を制御する分子メカニズムを明らかにするには、形態学的測定が必要です。これにより、実験的証拠を提供するために、正確で再現性のある樹状突起スパイン分析が義務付けられています。本研究では、Neurolucida 360(自動三次元ニューロン再構成ソフトウェア)を使用した樹状突起脊椎の定量化と分類のための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルにより、総脊椎密度、脊椎頭容積、脊椎サブタイプへの分類などの主要な樹状突起スパイン特性の決定が可能になり、樹状突起スパインの構造表現型の効果的な分析が可能になります。

概要

樹状突起スパインは樹状突起の突起であり、しばしばグルタミン酸作動性シナプスのシナプス後部位を構成する1,2。樹状突起スパインは、シナプス可塑性の分野で特に興味深いものです。棘は、シナプスの強度が変化するとしばしば変化し、長期のシナプス増強では大きくて強くなり、長期的なシナプス抑制では小さくて弱くなります3,4,5,6,7。シナプス可塑性を超えて、樹状突起スパインのプロファイルは生涯を通じて変化します。初期の発達では、樹状突起スパインの形成と成長の期間があり、その後、定常状態に達するまで樹状突起スパインの剪定が行われます8,9,10。老化した脳では、脊椎の喪失は脳の萎縮と認知機能の低下を伴います11。さらに、多くの神経学的、神経変性、および精神医学的障害は、異常な樹状突起棘によって特徴付けられます。統合失調症に罹患した個人の複数の脳領域は樹状突起棘が少なく、これはおそらくシナプス刈り込みの変化に起因する12。自閉症スペクトラム障害は、樹状突起脊椎の病状によっても特徴付けられます13。樹状突起脊椎の喪失は、アルツハイマー病とパーキンソン病の両方の特徴です14,15。樹状突起スパインの特性の調査を含む幅広い研究トピックを考えると、正確なスパイン定量化の技術は最も重要です。

染色、すなわちゴルジ法、または色素充填または蛍光タンパク質の発現によるニューロンの標識は、樹状突起スパインの可視化のための一般的な方法である16,17,18。可視化されたスパインは、無料および市販のさまざまなソフトウェアクライアントで解析できます。分析の望ましい出力は、どのソフトウェアが最も使用されるかを決定する重要な要素です。フィジーは、樹状突起スパイン密度を中心とした問題に対する実行可能なソフトウェアオプションです。ただし、この手法は、バイアスの可能性をもたらす可能性のある時間のかかる手動カウントに大きく依存しています。SpineJなどの新しいプラグインでは、自動定量化が可能になり、さらにより正確な脊椎頸部分析が可能になります19。これらのアプローチの欠点は、SpineJが2次元の画像スタックに限定されているため、脊椎の体積を決定するための3次元分析が失われることです。さらに、これらのプロセスを介して脊椎のサブタイプ情報を取得することは困難になります。細い、キノコ、ずんぐりした、糸状足の4つの主要な脊椎サブタイプは、すべて個々の機能を暗示し、形態学20によって大きく分類されます。細い棘は、細長い首と明確な頭21によって特徴付けられます。キノコの棘は、はるかに大きく、顕著な背骨の頭を持っています22。ずんぐりした棘は短く、頭と首の間のばらつきがほとんどありません23。糸状足は未熟な棘で、長くて細い首を持ち、明らかに観察できる頭はありません24。分類は貴重な情報を提供しますが、スパインは連続した次元に存在します。カテゴリーへの分類は、形態学的測定の範囲に基づいています25,26。分類のためにスパインを手動で測定すると、このアプローチでは研究者の物流上の負担が増します。

特に3次元樹状突起スパイン解析に焦点を当てた他のソフトウェアオプションは、スパインの体積とサブタイプの特性27、28、29、30、31の調査に適しています。3次元解析では、z面の解像度の低さや汚れなどの困難さにもかかわらず、これらのソフトウェアオプションにより、ユーザーガイドによる半自動方式で樹状突起や樹状突起スパインの信頼性の高い3次元再構成が可能になります。同定されたスパインをそのサブタイプに自動的に分類することも、これらのスパイン解析ソフトウェアパッケージの一部に存在する機能です。これにより、潜在的なワークロードと実験バイアスの懸念を改善できます。Neurolucida 360は、信頼性と再現性のある3次元樹状突起脊椎の同定と分類を可能にする市販のソフトウェア1つです32。ここでは、このソフトウェアを使用して固定組織を効果的に調製し、画像を取得し、最終的に樹状突起スパインを定量および分類するための包括的なプロトコルを紹介します。

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プロトコル

すべての動物用処置は、学内研究における動物の使用に関する米国国立衛生研究所ガイドラインに従い、国立精神衛生研究所の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.固定海馬スライスの調製

  1. ケタミン/キシラジン(ケタミン:100 mg / kg;キシラジン:8 mg / kg)。.テールピンチで麻酔を検証し、マウスを灌流プレートに貼り付けます。
  2. 大きな手術用ハサミを使用して、胸部の皮膚と被毛を取り除き、下にある胸郭の視覚化を容易にします。
  3. 肝臓と横隔膜を避けて、胸郭の幅より下に水平に切り込みを入れます。細い鉗子を使用して、剣状突起を引き上げ、胸郭の両側を切断します。胸郭を首の領域まで跳ね上げ、止血鉗子を使用して所定の位置にクランプします。
  4. 21 Gのバタフライ針を心臓の左心室に挿入し、室温の1x PBSで約5 mL /分で灌流を開始します。小さな手術用ハサミで右心房に小さな切り込みを入れます。心房を出る溶液が透明になるまでPBSで灌流します。
  5. 灌流ポンプをオフにして、気泡がチューブに入らないようにします。PBSのチューブをPBS中の氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れます。動物が完全に硬化するまで、PFAを5 mL/分の速度で灌流します(約25 mL)。
    注:最適な固定のために、PFAが新鮮であることを確認してください(ストックが4°Cで保存されている場合は1週間以内)。
  6. 小さな手術用ハサミで頭蓋骨の表面から皮膚を取り除きます。頭蓋骨の中央の亀裂に沿って小さな手術用ハサミで中矢状に切り込みを入れます。嗅球と小脳の上に横方向の切り傷を吻側に作ります。
  7. 細かい鉗子で頭蓋骨を開き、脳を露出させます。へらを使用して、嗅球から脳をそっとすくい取り、PBSに4%PFAを一晩入れます。
    注:げっ歯類灌流のより包括的なプロトコルについては、Gageら33を参照してください。
  8. 4% PFA を PBS 中の 15% スクロースに 1 日間置き換えることにより、固定脳を凍結保護します。これに続いて、脳が溶液に沈むまで、15%スクロースをPBS溶液中の30%スクロースに1日間置き換えます。
  9. スクロース溶液から脳を取り出し、PBSを入れたシャーレに入れます。メスの刃を使用して小脳と嗅球を切り取ります。
  10. 直径1〜2cmの最適な切断温度コンパウンド(OCT)を試料ホルダーの表面に少量置きます。OCTで尾側の切断面を使用して脳を標本ホルダーに冠状に取り付けます。試料ホルダーを粉砕したドライアイスに置き、目に見えるように凍るまで約5〜7分間、脳を急速凍結します。
  11. クライオスタットのブレード角度が0°から5°の間で設定されていることを確認して、均一なセクションを作成します。ロールプレートの角度を調整して、スライスを最適に平坦化します。具体的な手順については、機器のマニュアルを参照してください。
  12. 検体ホルダーを、脳の腹面をブレードに最も近い状態でクライオスタットに置きます。脳を30μmの背側海馬切片に切り取り、吻側から海馬までのすべてのスライスを捨てます。
    注:プロトコルのこの部分は、選択した任意の望ましい脳領域に適合させることができます。ステップ 1.9 から 1.12 は、関心のある地域によって異なります。
  13. 背側の海馬スライスをPBSに移します。絵筆を使用して、海馬切片を顕微鏡スライドにそっと取り付けます。綿棒またはデリケートなタスクワイプで余分な溶液を取り除きます。
  14. 100 μLのハードセット封入剤を顕微鏡スライドに塗布し、すべての脳スライスを覆います。気泡を防ぐため、鉗子を用いてカバーガラスを封入剤にゆっくりと下ろします。気泡が発生した場合は、鉗子でカバーガラスを軽くたたいて、泡を逃がします。イメージングする前に、スライドを一晩置いてください。

2. 高解像度共焦点イメージング

  1. 低倍率の接眼レンズを使用して、蛍光細胞を同定します。63倍(NA = 1.4)以上の対物レンズに切り替え、対物レンズに適切な液浸媒体を適用します。
    注:最良の結果を得るには、63倍以上の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してください。
  2. 画像取得のために、オーバーラップが限られている適切に標識された樹状突起セグメントを特定します。レーザー出力とゲインを設定して、蛍光樹状突起が飽和しないようにします。さらに、スキャン速度を遅くすると、画像の解像度が向上します。
  3. 将来の解析のために、完全な樹状突起セグメントを包含するzスタックを取得します。10 μm を超える Z スタックは、Z 平面に樹状突起が重なる可能性があるため、望ましくありません。
    注:利用可能な最小のzステップサイズ(0.2-0.7μm)と1つのエアリーユニットピンホールサイズを利用します。ステップサイズが小さいほど、Zスタック内の画像が多くなり、多くの顕微鏡の限られたZ解像度を補うことができます。
  4. オプション:可能な場合は、顕微鏡のそれぞれのデコンボリューションソフトウェア機能を利用して画像をデコンボリューションします。これにより、より高解像度の画像が可能になります。

3. 樹状突起スパインの定量化

  1. Neurolucida 360 (v2022.1.1 以降) を開きます。脊椎解析ソフト( File > Open > Image)で画像ファイルを開きます。画像ファイルがメインウィンドウと3D環境に表示されていることを確認します。 3D環境 ウィンドウが表示されない場合は、メインウィンドウ上部のツールバーの [トレース ]タブにある[3D環境]を左クリックします(補足図1)。
    注:プロトコルのこのセクションは、マウス組織からの樹状突起だけでなく、任意の樹状突起画像に適合させることができます。
  2. [3D 環境]ウィンドウの[イメージ表示の変更]タブで、[イメージの表示形式]ボックスにイメージが [3D ボリューム]として表示されていることを確認します。[イメージ]タブの[イメージ スタック設定]ボックスで、[サーフェスの表示形式]ドロップダウン メニューの[最大投影]を選択します。(補足図2)
  3. トレースに適した樹状突起セグメントを特定します。
    1. 3D 環境ウィンドウの上部ツールバーにある Move Pivot Point ツールを左クリックします。目的の樹状突起を左クリックして、新しいピボットポイントを設定します。これにより、向きが変更され、効果的なズームインが可能になります。
    2. 「 Reset Orientation 」アイコンを左クリックして、元の向きを再設定します。ピボットポイントを設定したら、 Move Pivot Point ツールを左クリックして樹状突起のトレースを開始します。(補足図2)。
      注:理想的な樹状突起とは、どの座標平面でも他の樹状突起との重複が限られており、別の樹状突起と交差していない、またはその下の別の樹状突起と表面的に交差していない樹状突起です。XY平面内の他のものへの近接性が低い樹状突起も、トレースされた樹状突起への隣接する棘の不適切な割り当てを防ぐために好ましい。また、体細胞からの距離が異なる厚さ、次数、および距離の樹状突起は、樹状突起スパイン密度34,35が異なることにも注意しなければならない。これは、実験計画で考慮する必要があります。厚さ<1.5μmの二次状突起は、トレースの理想的な候補です(図1)。
  4. [3D 環境] ウィンドウの [ツリー] タブを左クリックします。トレースモードの場合は「User-Guided」を、メソッドとして「User-Guided Tracing Options」の「Directional Kernels」を左クリックします。
  5. 樹状突起を左クリックすると、円形のカーネルが表示され、トレースが開始されます。樹状突起セグメントに沿ってカーソルを移動します。これにより、カーネルが自動的に入力されます。カーネルが自動的に入力されない場合は、ステップ 3.51 を参照してください。
    1. カーネルが入力されるまで、カーソルを樹状突起上でゆっくりと前後に動かします。左クリックすると、検出された既存のカーネルが保持されます。カーネルが入力を停止した場合は、カーネルが樹状突起のさらに下に入力されたときに左クリックして、手動でカーネルを配置します。右クリックしてトレースを終了します。トレースされた樹状突起の長さが7μm以上であることを確認してください(補足図3)。
  6. 3D 環境の 3 つの方向 (ピッチ、ヨー、ロール) すべてを使用して、樹枝状トレーシングの精度を確認するには、 3D 環境 ウィンドウを左クリックしてドラッグします。樹状突起トレースが樹状突起の適切な位置の外側にある点を特定します。上から下に正確にトレースされているように見える場合がありますが、Z 次元では、点が樹状突起上にありません (図 2)。
  7. 不適切にトレースされた樹枝状セグメントを修正するには、ツリーメニュー内の編集タブを左クリックします。対象の樹状突起を左クリックし、[ポイント]を左クリックします。
  9. 画像内の複数の樹状突起について手順3.3〜3.8を繰り返してから、手順3.10の脊椎の識別に進みます。
  10. 3D 環境ウィンドウの Spine タブを左クリックします。[Outer Range]、[Minimum Height]、および [Minimum Voxel Count] の検出設定を設定します。準備によっては、変更の明確で具体的な理由がある場合に、プリセット値を変更する必要がある場合があります。プリセット条件は、Outer Range:2.5 μm、Minimum Height:0.3 μm、Minimum Voxel Count:10 Voxelsです。
    注:細胞培養と急性組織など、調製物が異なれば、発生の時点も異なるため、既存の文献から導き出さなければならない異なる基準が必要になります。また、検出設定を変更すると、結果が大幅に変わる可能性があることに注意することも重要です。たとえば、最小の高さを高くすると、背の低い脊椎を除外できます。検出設定は、実験の全過程を通じて一貫している必要があります。
  11. [Detector Sensitivity] を 70% に設定し、[Detect All] をクリックします。これにより、この検出器の感度によって識別されたスパインがすべての樹状突起に装着されます。樹状突起固有の方法でスパインを選択する場合は、[Click Image to Detect All on Nearest Branch]ボックスを左クリックし、検出器の感度が異なる各樹状突起を手動で左クリックします。
    注:この段階では、すべての樹状突起スパインが出現するわけではないのは正常です。同様に、非背骨が不適切に入力される可能性があります。最初の70%の感度も柔軟です。これは準備によって変わる場合があります。
  12. この検出器の感度によって選択されたスパインを調べるには、樹状突起を3方向すべてにクリックしてドラッグします。検出されたスパインの大部分が完全に充填されていない場合は、手順 3.12.1 に進みます。検出されたスパインがいっぱいになっている場合は、手順 3.12.2 に進みます。検出されたスパインが十分に充填されていると思われる場合は、手順3.13に進みます。
    1. [Detector Sensitivity] を 5% から 10% 上げ、[Detect All] をもう一度クリックします。これにより、以前に検出されたすべてのスパインが、より高い感度の新しいスパインに置き換えられます。検出されたスパインが十分に満たされるまで、必要に応じて繰り返します。
    2. [Detector Sensitivity] を 5% から 10% 下げて、[Detect All] をもう一度クリックします。これにより、以前に検出されたすべてのスパインが、感度の低い新しいスパインに置き換えられます。検出されたスパインが十分に満たされるまで、必要に応じて繰り返します。
  13. 3D 環境の Spine タブで Keep Existing Spines を左クリックします。「画像をクリックして最近傍ブランチのすべてを検出する」が選択されている場合は、選択を解除します。
    注:[ 既存のスパインを保持] をオンにすると、新しく識別された樹状突起スパインを手動で識別しても、以前に識別されたスパインが上書きされなくなります。前の作業が上書きされないように、先に進む前にこのボックスが選択されていることを確認してください。
  14. [Move Pivot Point] を左クリックし、ピボット ポイントを設定するためにさらに背骨を検出する必要がある樹状突起を左クリックします。
    1. 「ピボットポイントを移動」の選択を解除します。未充填の樹状突起スパインを特定します。検出器の感度を前の検出よりも10%〜20%上げ、脊椎を左クリックします。検出されたスパインが不足または過剰に充填されている場合は、手順 3.14.3 または 3.14.4 に進みます。スパインが入力されない場合は、「選択した位置でスパインを検出できません」というメッセージが表示されます。この場合は、ステップ 3.14.2 に進みます。
    2. 検出器の感度を段階的に、場合によっては100%以上に上げて、スパインが検出されて適切に満たされるまで上げます。スパインが検出されても充填が不十分な場合は、手順 3.14.3 に進みます。脊椎がいっぱいになっている場合は、手順3.14.4(図3)に進みます。
    3. [編集]タブを左クリックし、埋められていない脊椎を左クリックします。[削除] をクリックします。「編集」タブの選択を解除します。感度を5%〜10%上げ、背骨を左クリックします。背骨がまだ充填されていない場合は、この手順を繰り返します。
    4. [編集]タブを左クリックし、オーバーフィルされたスパインを左クリックします。[削除] をクリックします。「編集」タブの選択を解除します。感度を5%〜10%下げて、背骨をクリックします。脊椎がまだいっぱいになっている場合は、この手順を繰り返します。
  15. 目視による識別によって識別されたすべてのスパインが検出されるまで、手順3.14〜3.14.4を繰り返します。樹状突起に、隣接する樹状突起に属する棘、真の信号がないと対応している偽の棘、または脊椎として誤ってラベル付けされた樹状突起の潜在的なセグメントがないか、樹状突起を再確認してください。これらの偽のスパインは 、削除 機能を使用して削除します。
  16. 樹状突起の特定された棘を調べます。場合によっては、複数のスパインが 1 つのコングロマリット スパインとして表示されることがあります。1 つの背骨が 2 つを囲んでいるように見える場合は、[ 編集 ] タブを左クリックします。背骨を左クリックし、[ 選択を非表示]をクリックします。コングロマリット スパインを確認したら、[ 編集 ] タブで [ 選択項目を表示 ] をクリックし、[ 分割] を選択します。1つのコングロマリットに2つ以上のスパインがある場合は、この手順を繰り返す必要がある場合があります(図4)。
    注意: 手順3.16を実行しても礫岩の背骨が分割しない場合は、背骨を取り外します。次に、コングロマリットのより強度の高いスパインを低い感度で選択します。より強度の高い背骨が埋まったら、感度を上げて、他の満たされていない背骨を選択します。あるいは、コングロマリットスパインを削除してから感度を上げると、適切な分割が可能になる場合があります。
  17. 視覚的に識別可能なすべてのスパインが検出され、適切に入力されたら、[ Spine ] タブで [Classify All ] をクリックしたまま、スパインを 4 つのサブタイプ (thin、mushroom、stubby、filopodia) に分類します (図 5)。
    注:スパイン分類パラメータは、スパインタブの分類ボックスの設定ウィンドウで変更できます。検出器の設定と同様に、既存のパラメータを変更するための明確な理論的根拠を強く推奨します。プリセット値は、頭と首の比率:1.1、長さと頭の比率:2.5、マッシュルームの頭のサイズ:0.35μm、フィロポディウムの長さ:3μmです。
  18. 3D Environmentウィンドウの上部ツールバーで、 Save and View in Neurolucida Explorerを選択します。Neurolucida Explorerは、トレースからデータが収集される場所です。作業は、すべてのトレースとスパインを含む.datファイルとして保存されます。
  19. [エクスプローラ]ウィンドウの [表示 ]タブで、[ すべて選択 ]を左クリックして、すべての樹状突起とスパインをハイライト表示します。
  20. 上部ツールバーの 「分析 」タブを左クリックします。 「Structure 」ドロップダウンメニューを左クリックします。 [分岐構造解析]をクリックします。
  21. 対象の変数に応じて、任意の分析を選択できます。脊椎の密度と平均脊椎体積を中心とした質問に最も役立つのは、各樹状突起>と脊椎>脊椎の詳細の2つです。[OK] を選択すると、データが 2 つの別々のウィンドウに表示されます。
  22. データをスプレッドシートにコピーして、さらにコンパイルおよび分析します。
    注:個々のツリーは樹状突起で区切られますが、背骨のボリュームは分離されません。スプレッドシートの並べ替え機能を使用すると、背骨の詳細を機能でフィルタリングできます。

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結果

この解析方法を効果的に活用するには、トレースする樹状突起セグメントを選択することから始まります。 図1で説明したように、トレースに理想的な樹状突起は、他の樹状突起に近接していません。樹状突起が並行して実行されると、隣接する樹状突起からスパインが不適切に識別される可能性があります。樹状突起は、異なるz平面で直接交差するか、垂直に走っているため、正確な樹状突起トレースも非常に困難になります。樹状突起の厚さの違いに注意することも重要です。以前に報告されたように、背骨の密度には、さまざまな厚さの樹状突起による重要な違いがあります36。また、分岐点37からの距離が長くなると、同じ樹状突起に違いが生じることもある。同じ順序と厚さの樹状突起をトレースし、理想的には同様の分岐点の起点を持つ樹状突起を追跡することで、樹状突起スパイン密度の既存の不均一性を制御できます。一部の調製物で分岐点を特定することは実行不可能であることが判明するかもしれませんが、樹状突起の厚さは常に樹状突起追跡の制御可能な要素であ...

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ディスカッション

このプロトコルでは、サンプル調製、イメージング、および3次元再構成ソフトウェアを使用した樹状突起スパインの定量化と分類のプロセスの具体的な手順について詳しく説明します。このソフトウェアは、さまざまな調査に貢献する堅牢な構造データを生成できる強力なツールです。プロセス全体を通じて、このプロトコルを方法論的な負担を軽減し、データの全体的な出力を向上させるための重要なステップがいくつかあります。樹状突起スパインの標識方法は、研究者がこのプロトコルに着手する前に最初に考慮すべきことの1つです。スパインの定量化に関する問題は、標識方法が不十分であることから生じる可能性があります。スパインで低レベルで発現する特定のタンパク質を染色すると、ソフトウェアにとってシグナルが低すぎる可能性があります。また、最も明るい蛍光樹状突起をトレースすることでバイアスが発生する可能性があることにも注意する必要があります。異なる蛍光性樹状突起が異なる生理学的特性を持つかどうかは不明ですが、それでも考慮すべきプロトコルの制限です。さらに、THY1-YFP-H系統などの一部のトランスジェニック系統では、樹状...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

技術支援を提供してくださったCarolyn Smith氏、Sarah Williams Avram氏、Ted Usdin氏、NIMH SNIRに感謝いたします。さらに、コルゲート大学ベセスダ生物医学研究研究グループに感謝します。この作業は、NIMH学内プログラム(1ZIAMH002881からZ.L.)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
518F 液浸オイルツァイス444960-0000-000
クライオスタットライカCM3050Sスライス調製用
ファイン フォーセプスFST11150-10
止血鉗子FST13020-12
大型手術用ハサミFST14002-16
LSM 880 共焦点顕微鏡ツァイスLSM 880
顕微鏡カバー ガラスフィッシャーブランド12-541-035
ミニ蠕動ポンプ IIハーバード装置70-2027灌流用
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1脊椎解析ソフトウェア
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1脊椎解析ソフトウェア
OCT Compoundさくらファインテック4583のクライオスタット切片用
ッシャーブランドF79-1
アポクロマート63x / 1.40オイルDICツァイス440762-9904-000
ブレードFST10022-00
手術用ハサミFST14060-09
スパチュラ FST10091-12
スクローFIsherbrandS5-500
スーパーフロスト プラス マイクロスライドDiaggerES4951+
Vectashield HardSet マウント ミディアムベクター ラボラトリーズH-1400-10
パラホルムアルデヒド(37%)フィプランメス小型ス

参考文献

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