方法論記事

マウス創傷モデルおよび単一細胞懸濁液の調製

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DOI:

10.3791/66499

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2024年9月27日

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1Medical School of Chinese People's Liberation Army, 2Department of Dermatology, Southwest Hospital, Army Medical University, 3Biomedical Treatment Center, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital, 4The 83th Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, 5Department of Dermatology, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital

この記事について

サマリー

この研究は、創傷閉鎖を評価するためのマウス創傷モデルの構築と、細胞生存率を維持するためのマウス皮膚からの単一細胞懸濁液の調製という2つの重要な実験手法を提示しています。

要約

急性の全層皮膚損傷の管理は、臨床診療においてかなりの課題を提示します。創傷治癒は複雑で、多様な細胞集団や複雑な創傷微小環境が関与するため、従来の実験的アプローチを用いた治療効果とその相互作用の評価は複雑になります。シングルセルトランスクリプトームシーケンシング技術は、創傷治癒中の細胞機能とメカニズムの理解に革命をもたらしました。しかし、マウス創傷モデルの作成方法にばらつきがあるため、実験結果に影響を与える可能性のある交絡因子が生じます。さらに、マウスの皮膚組織を解離するプロセスには大きな技術的ハードルがあり、正確なトランスクリプトームシーケンシングのための高品質のシングルセル懸濁液が重要であることが浮き彫りになっています。したがって、この研究は、マウス創傷モデルの構築を最適化して、創傷閉鎖の変化を正確に評価し、その後のシーケンシング結果に影響を与える可能性のある変数を排除することを目的としています。さらに、シングルセル懸濁液の調製は、酵素調製プロトコルとテストキットプロトコルの両方を使用して行い、コストと有効性を最適化しました。

概要

マウスは、ヒトと非常に相同な遺伝子配列、迅速な繁殖、費用対効果、および管理可能なサイズ1で、研究で広く認識されている動物モデルです。しかし、マウスとヒトでは皮膚の構造に違いがあります。マウスには、皮膚の収縮に寄与する明確な皮膚膜層があり、この種の創傷治癒に重要な役割を果たしています。対照的に、ヒトの創傷治癒は主に再上皮化と肉芽組織形成を伴います1。

皮膚構造の種間の違いにもかかわらず、マウスモデルは創傷修復研究において依然として好ましい選択肢であり、他の動物モデルと比較しても非常に重要性を保持しています2,3.マウスの皮膚を使用してヒトの創傷治癒過程を模倣する場合、さまざまな影響因子を慎重に検討することが不可欠です。これらの要因には、外科的処置に適した部位の選択、マウスの毛包周期の説明、皮膚膜収縮の影響の理解が含まれます4,5.実験条件を最適化し、観察結果の精度を向上させるためには、対応する対策を実施することが不可欠です。

シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、従来のRNAシーケンシングよりもはるかに精製されたレベルで細胞をシーケンシングし、グループ内の違いを最小限に抑えながらサンプル品質に対する要求がはるかに高くなります。安定したマウスの急性全層皮膚欠損モデルを改良するために、複数の実験が行われました。これらの実験では、文献から確立された方法と革新的なアプローチを組み合わせて、創傷治癒を包括的に評価しました2,5.創傷治癒モデルを開発するために、マウスの全層皮膚切除を使用して、創傷修復と再生の生理学的プロセスを再現しました。その目的は、scRNA-seqを使用したさまざまな処理によって誘発される潜在的な変化を評価することでした。マウスからの皮膚組織の解離は、シングルセル懸濁液の調製中に、低い細胞生存率や高い凝集率などの課題を引き起こします6。これらの問題により、機器の目詰まりや細胞の異常な捕捉などの問題が生じ、データ品質が損なわれる可能性があります。シングルセルシーケンシングにはかなりのコストがかかるため、シングルセル懸濁液の安定性と信頼性を確保するためには、複数の予備実験を行うことが重要です。この研究では、混合酵素解離と組織キット解離法の有効性を評価して、組織解離の最適なアプローチを特定しました6,7。この研究は、さらに詳細な調査のための強固な基盤を確立します。

プロトコル

すべての手続きは、中国の中国人民解放軍総合病院の第7医療センターの倫理委員会によって承認されました。6週齢の雄C57/BL6マウスを用いた。

1. マウス創傷治癒モデル

  1. 動物のグループ化
    1. マウスを実験グループと対照グループにランダムに割り当てます(各6匹)。特定の病原体を含まない(SPF)動物施設のイエネズミで、温度は23〜25°Cに維持され、湿度は50%〜60%に保たれ、明暗サイクルは12時間です。
    2. マウスが標準的な餌とオートクレーブ処理された水道水に無制限にアクセスできるようにします。
  2. 術前準備
    1. 拘束具を使用するか、マウスを腹臥位でしっかりと保持して、マウスをそっと拘束します。シリンジに1%ペントバルビタールナトリウムを室温に戻して、0.1 mL / 20 g体重で投与します
      注:1%ペントバルビタールナトリウム溶液は、4°Cの暗い環境で保存する必要があります。
    2. アルコール綿棒でマウスの腹部を清掃します。シリンジを少し角度をつけて腹部に挿入します。膀胱や腸への不注意な投与を防ぐために、注射前に吸引してください。.10分待ちます。
    3. マウスのけいれんが止まり、刺激に反応しなくなったら、乾燥を防ぐために両目に白いワセリンを塗ります。シェーバーを使用して、長い背側の毛をトリミングします。
    4. 脱毛クリームを背中に塗り、2分ほど待ってから、マウスの皮膚を傷つけないように湿ったガーゼでやさしく拭き取ります。脱毛クリームが長時間つけっぱなしにならないようにしてください。
    5. ベタジンと70%アルコールの綿棒を交互に3回入れて、周囲の皮膚をやさしく消毒します。
    6. オートクレーブ皮膚生検パンチ、はさみ、鉗子、およびその他の滅菌器具。無菌のワークスペースを維持します。その後、新しい手術用布で手術を行います。
  3. 全層皮膚切除
    注:創傷スプリントモデルは、創傷治癒の治療の有効性を評価するために使用されました。
    1. 油性マーカーを使用して、マウスの背側領域の上部中央領域に直径8 mmの円を1つ付けます。
    2. 清潔な鉗子を使用して背側の皮膚を持ち上げ、細かい手術用ハサミを使用して最初のカットを行います。最初のカットに続いて、鉗子を使用して部分的に除去された皮膚領域を保持し、マークされた円を慎重に切り取ります。
    3. リングはカスタムデザインのステンレス製(内径15mm、外径18mm)をご使用ください。5-0の非吸収性縫合糸で金属リングを切開部位の周辺に縫合し、切開部位の皮膚の収縮を防ぎます(図1A)。リングの材質はステンレスを使用し、錆びや変形を防ぎます。
    4. 術後の痛みを治療するために、創傷の近くに 10% ブプレノルフィン塩酸塩希釈液の 0.1 mL 皮下注射を 1 回投与します。
    5. マウスを再度導入して、個々のケージを清掃します。マウスを腹臥位に置きます。マウスが意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
    6. ステップ1.2で説明したように、麻酔後の創傷サイズを測定するために、2日ごとにマウスの創傷を観察および撮影します。
  4. 生検組織を取得するための創傷スタンプマーキング
    1. ステップ 1.1 と 1.2 で説明した実験の準備
      2. をします。
    2. 円の直径が 8 mm、正方形の辺の長さが 10 mm のカスタマイズされたマウス創傷マーキングスタンプを作成します (図 1B)。
    3. マウスを腹臥位に置き、アルコール綿棒で背側の皮膚を消毒します。スタンプをインクに浸します。マウスの背面の上部中央部分にスタンプで印を付けます。
    4. 手術用ハサミを使用して、円形のマークに沿って背中の皮膚層全体を慎重に切除し、筋肉層を完全に露出させます。傷の状態を妨げないように、包帯を巻かずに傷口を開けたままにしてください。マウスを清潔で消毒された環境に置き、傷口が自然にかさぶたを形成するようにすることで、創傷の無菌性を維持します。
    5. 術後の痛みを治療するために、創傷の近くに 10% ブプレノルフィン塩酸塩希釈液の 0.1 mL 皮下注射を 1 回投与します。
    6. マウスを再度導入して、個々のケージを清掃します。マウスを腹臥位に置きます。マウスが意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
    7. ステップ1.2で説明したように、麻酔後の創傷サイズを測定するために、2日ごとにマウスの傷を観察および撮影します。
    8. 1.4で説明されているように治療投与を行います
  5. 治療管理
    1. マウスが意識を取り戻してから4時間後に、ステップ1.2.2-1.2.3で説明したように麻酔を行います。
    2. 所望の治療を皮下注射し、ここでは100μgのヒト臍帯間葉系幹細胞由来エクソソーム(hucMSC-Exo)を200μLのPBSに溶解して治療群の切開部位に注入する。
    3. 対照群の切開部位の周囲に 200 μL の PBS を皮下注射します。
    4. 手順 1.5.2 と 1.5.3 を 2 日ごとに最大 14 日間繰り返します。注射部位に腫れ、発赤、感染の兆候がないか調べます。

2. シングルセルRNAシーケンシングの準備

  1. ティッシュの収集と調製
    1. 手順1.2.2-1.2.3で説明されているように麻酔を行います。
    2. 清潔な鉗子を使用して背側の皮膚を持ち上げ、かさぶたを取り除きます。傷口付近の皮膚を約2cm2切り取り、脂肪組織と大きな血管を切除します。
    3. 滅菌鉗子を用いた皮膚生検を、予め冷却した4mLのPBSで満たされた6ウェルプレートのウェルに移します。
    4. 目に見える血液がなくなるまで、生検を4mLのPBSで満たされた新しいウェル(6ウェルプレート)に順次移すことにより、PBSで洗浄します。
    5. メスで皮膚を約2mmサイズに切り、さらにBSAを0.04%含有するDPBSで洗い、ゴミを取り除きます。
  2. 酵素的解離 (図 2)
    1. 1 mLのコラゲナーゼI(10 mg/mL)、1 mLのコラゲナーゼIV(5 mg/mL)、1 mLのコラゲナーゼD + ディスパーゼII(15 mg/mL)、1 mLのDNase I(5 mg/mL)、および6 mLのDPBSを滅菌コニカルチューブに入れて消化液を調製します。均一性を確保するために、コンポーネントを完全に混合します。
    2. コニカルチューブを37°Cにセットしたウォーターバスに10分間入れ、消化液を予熱します。
    3. 2.5 mLの消化液を組織に加え、37°Cで70分間消化し、10分ごとに試験管をひっくり返して完全に混合します。
    4. 70 μmのストレーナーを洗浄バッファー(PBS中0.2%BSA)で事前に濡らします。解離した細胞や残留組織断片などの反応ミックスを、ストレーナーの1 mLワイドボアピペットチップを使用して移します。
    5. この混合物を、あらかじめ湿らせた70 μmセルストレーナーで15 mLの遠心チューブにろ過します。
    6. 反応混合物を消化した組織と300 x g、室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、次の解離ステップのためにペレット(細胞)を保持します。
  3. 赤血球溶解
    1. 赤血球溶解液(10倍)を1:10の比率で再蒸留水で希釈します。円錐形のチューブ内で、細胞を1倍赤血球溶解液で1:10の比率で希釈します。
    2. 混合物を5秒間ボルテックスし、室温で2分間インキュベートした後、300 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を等量のDPBSに再懸濁し、氷上に保存します。
  4. 濾過
    1. 細胞懸濁液を取り出し、40 μmのストレーナーでろ過して新しい円錐形チューブに入れます。
    2. チューブを4.5 mLのRPMI(10% FCS)で2回すすぎ、残りの細胞が確実に収集されるようにします。
    3. 細胞懸濁液を室温で300 x gで5分間遠心分離します。
    4. 上清を捨て、ペレットを静かにフリックし、0.04% BSA PBSの50μLに幅の広い先端で細胞を再懸濁します。このプロセス全体を通して、細胞を氷上に維持します。
  5. デッドセルの除去
    1. 死細胞除去キット20xストックバッファーとヌクレアーゼフリー水と1:20の比率で混合し、1x結合バッファーを得ます。
    2. サンプルを300 x gで遠心分離し、上清を除去し、60 mgの皮膚サンプルに対して10 μLの死細胞除去マイクロビーズを加えます。
    3. 室温で15分間インキュベートします。ストックバッファーを500 μLに達するまで加え、サンプルをキットの調製済みカラムにロードし、解離器に付着させます。
    4. 解離プログラムを実行して、生細胞を分離します。プログラム終了後、懸濁液を30μmフィルターでろ過し、等量のD-PBS.
      で希釈します 注:滴下速度が著しく遅くなった場合は、不純物が細孔を塞いで細胞の回復に影響を与えるのを防ぐために、すぐにカラムを交換してください。
    5. アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の染色および細胞カウントを、自動セルカウンターを用いて実施します。次の許容基準を使用してください:細胞生存率≥85%、細胞凝集率<20%、目に見える赤血球や細胞片がない。
  6. 多組織解離キットの解離手順(代替)
    1. 2.5 mLのRPMI 1640、100 μLのEnzyme D、50 μLのEnzyme R、および12.5 μLのEnzyme A1を穏やかなMACS Cチューブ(Multi Tissue Dissociation Kitの成分)に混合します。
    2. 酵素ミックスが入った穏やかなMACS Cチューブに組織を移し、しっかりと閉じます。
    3. チューブを37°Cのウォーターバスに90分間置き、10分ごとに穏やかに反転させて、解離溶液への組織への適切な曝露を確保します。
    4. 解離溶液を廃棄し、DPBSで組織を洗浄します。
    5. シングルセル懸濁液を70 μmおよび40 μmのセルストレーナーに順次通過させ、4°Cで300 x gで10分間遠心分離します。
    6. 赤血球溶解試薬を使用して、ステップ2.3と同じ手順に従って赤血球を溶解します。
    7. ステップ 2.58 と同じ手順に従って、デッドセル除去キットを使用してデッドセルを除去します。
    8. AO/PI染色および細胞カウントは、自動セルカウンターを使用して行います。次の許容基準を使用してください:細胞生存率≥85%、細胞凝集率<20%、目に見える赤血球や細胞片がない。

結果

手順の複数のバリエーションを検討した。スタンププロトコルは、創傷治癒プロセスへの干渉が最小限であり、掻破や縫合などの影響から創傷の完全性を維持できるため、こちらを採用した。これは、後続のシーケンシングにおいて、単一細胞レベルでのノイズ導入を避けるためである。マウスの両側に創傷を設けたところ、マウス皮膚固有の弾性により、創傷面積に顕著な差が生じた（図3A,B）。両側穿刺では、創傷部位が端に近くなり、マウスの自傷掻破行動が起きやすい領域となりました。7週齢以上のマウスの一部に、背側皮膚の周囲10mmに不規則な黒ずみが見られたため、本研究には不適であると判断されました。th 術後〇日目であり、これは毛髪再成長の開始を示している（図4A）。これにより、望ましくない追加の変数が導入された。

ゴムリングを使用した際は、ソフトゴムかハードゴムかに関わらず、マウスの頻繁な動作とリングの接着性の低さにより、約12時間以内にリングが剥がれたり、創部から脱落したりする傾向がありました。縫合糸で固定したゴムリングは裂けやすく、安定させるために繰り返し縫合する必要がありました。この反復的な縫合処置は、結果としてマウスにさらなる外傷を与えることとなりました（図4B,C）。対照的に、金属リングは優れた安定性と保持性を示し、創傷収縮による干渉を受けることなく再上皮化の効果を評価することが可能となりました。

金属リング縫合スプリントは、創傷領域を超えて余分な皮膚損傷を引き起こす可能性があり、また創傷全体に不均一な機械的ストレスをかける可能性があるため、その後の解析を容易にするために、固定寸法の標準化されたスタンプを使用した。

調査の結果、例として処置を行った群（hucMSC-Exo）は、対照群と比較して治癒速度が速いことが明らかになりました（図 5A）。創傷収縮を制限する縫合メタルリング群よりもスタンプモデルにおいて完全治癒がより迅速に起こりましたが、初期の7日間において治癒率に統計的な有意差は見られませんでした（図 5B）。これらの所見はLinらの先行研究と一致しており、マウス皮膚治癒の初期10日間は、収縮よりも主に再上皮化が関与していることが示唆されました9。

解離の比較
酵素組成の広範な最適化の結果、Dispase IIとコラゲナーゼの組み合わせが、単一の酵素を使用した場合よりも優れた性能を示した（表 1）。重要な点として、赤血球や細胞破片の混入は最小限であり、細胞生存率 85% 以上、凝集率 20% 未満という、装置使用に不可欠な基準を満たしていた。

対照的に、テストキットを用いた手法では、細胞生存率が相対的に高く、細胞凝集率が低いという有望な結果が示された（表1さらに、赤血球や細胞断片は観察されず、他の手法と比較して全般的に細胞品質が優れていることが示された。

動物皮膚上の手術器具、円形切開図、定規で測定した創傷。
図1確定したマウス創傷モデル。 (A) 縫合したカスタム金属リングの代表的な画像。 (B）スキンスタンプおよび切除創の代表的な画像。直径：8 mm。縁：1 cm。（C) 創傷閉鎖率。エラーバー：標準誤差。両側T検定（n=6）。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞調製プロセス：サンプルの調製、解離、赤血球溶解、死細胞の除去、単一細胞懸濁液の作成。
図 2: 単一細胞懸濁液調製の概略図。 ステップには、サンプルの採取、解離、赤血球溶解、死細胞の除去、および単一細胞懸濁液の作成が含まれる。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ラットにおける創傷治癒実験；タイムライン画像、術後1日目および6日目；測定用定規。
図 3: 両側に創傷を設けたマウス創傷モデル。 (A) 両側に創傷を設けたマウス創傷モデルの代表画像を示す。白い円形の参照直径：8 mm。 (B) 両側の創傷における異なる時点での創傷治癒の代表画像。マウスの尾に近い背中の皮膚は、首に近い部分よりも治癒が早かった。白い正方形の参照物の一辺：1 cm。白い円形の参照物の直径：8 mm。略語：POD = 術後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

測定を伴う創傷治癒実験の図、POD 1からPOD 10、ラット皮膚切開研究。
図4単一創傷を伴うマウス創傷モデル (A) 7週齢マウスにおける異なる毛成長段階での創傷治癒の代表的な画像。POD 10におけるマウスの毛成長段階はそれぞれ異なる。皮膚の色が濃いほど治癒が早かった。 (B) ゴム製接着リングの代表画像。白色の正方形のリファレンスオブジェクトの辺：1 cm。 (C) 縫合線の代表的な画像。白い円形のリファレンスオブジェクトの直径：8 mm。略語：POD = 術後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

時間経過に伴う創傷閉鎖率。治療有効性を比較する実験用棒グラフ。統計解析。
図5: 創傷閉鎖率。 (A) コントロール群とhucMSC-Exo群の比較。エラーバーは標準誤差を示す。両側T検定 (n=6)。 (B) スタンプ群とメタルリング群の比較。エラーバーは標準誤差を示す。有意性は両側t検定を用いて算出した (n=6)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞生存率細胞凝集速度
院内アプローチ86.90%18.50%
テストキットを用いたアプローチ90.65%13.73%

表1：2つの細胞調製法の生存率および凝集率。

ディスカッション

プロトコルの成功には、いくつかの重要なステップが不可欠でした。これらの手順には、徹底的な剃毛と洗浄による創傷領域の正確な準備、特定のサイズと深さの標準化された創傷の作成、感染を監視して適切な治療を行うための入念な創傷後のケアが含まれていました。これらの手順の標準化により、実験条件全体での一貫性が確保され、それによって結果の信頼性と再現性が向上しました10。

他の方法ではマウスの傷の傷や縫合糸の裂傷などの追加の変数が導入されるため、シーケンスには創傷スタンプマーキングを採用しました 2,5。スタンプ モデルは、マウスの創傷の初期一貫性を改善し、創傷治癒を評価するための標準化されたベンチマークを提供し、マウス モデルにおける創傷治癒率の推定における潜在的な不正確さを減らします。さらに、スタンプマークはImageJなどのソフトウェアの使用を容易にします。ただし、傷を覆うために包帯を使用しないため、スタンピング法では環境に対する消毒要件がはるかに高くなります。感染が発生した場合は、実験を繰り返す必要があります。

個々のマウス間の生物学的変動は実験結果に変動をもたらす可能性があり、堅牢な統計分析のためにはより大きなサンプルサイズが必要になります。このモデルは、空間シーケンシングなどの他のシーケンシング技術に拡張して、その有用性をさらに高めることができます。

scRNA-Seq解離の条件を最適化し、適切な解離方法を選択することは、実験ワークフローの重要なステップです。現在、一般的に使用されている方法論には、推奨される10倍ゲノミクス試薬ベースのアプローチ11と組み合わせた酵素消化が含まれます。特に、酵素消化は試薬ベースの方法よりもコスト効率が大幅に優れています。ただし、酵素の選択と消化時間を最適化するには、実験前の複数の反復が必要です。

本研究では、様々な酵素の組み合わせを用いて予備実験を行った。選択した方法は、マウスの全層皮膚解離用に特別に設計された10倍ゲノミクス試薬キットがなかったにもかかわらず、下流の品質管理の基本的な要件を満たしていました。代わりに、多組織解離キット1を使用して、高品質の単一細胞懸濁液を取得しました。ただし、この方法は社内の酵素消化技術と比較して優れた安定性を提供しますが、コストが比較的高いことに注意することが重要です。貴重なサンプルには、10x ゲノミクス試薬ベースの解離法の使用をお勧めします。

一部のサンプルが必要な基準を満たさず、下流のデータ品質に影響を与える可能性があるため、個人差が細胞生存率に及ぼす潜在的な影響を考慮することが重要です12。

肯定的な面としては、この方法は、空間トランスクリプトミクスまたは他のマルチオミクスアプローチと統合する機会を提供し、それによってより包括的な分析フレームワークを提供します13。さらに、その潜在的な臨床応用は、基礎研究の文脈を超えたその多用途性と関連性を浮き彫りにしています。

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(#82373494)によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
75% AlcolcholLiuheJIUJING500ML
C57/BL6J マウスCharles River Laboratories
Collagenase D + Dispase IIRoche11088858001
Collagenase IRoche5349907103
Collagenase IVRoche5267439001
Cotton SwabsHaishiMIANQIAN
死細胞除去キットMiltenyi Biotec130-090-10
DNase IRoche10104159001
gentleMAC解離剤Miltenyi Biotec130-093-235
医療用ナイロン糸JinlongHM507
Multi Tissue Dissociation Kit 1Miltenyi Biotec130-110-201
パンチ生検針Integra Miltex
赤血球溶解液Miltenyi Biotec130-094-183
外科用ハサミJingluJIANDAO
白いワセリンShangyuanBAIFANSHILIN

参考文献

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