方法論記事

妊孕性温存を受けている若年患者の卵巣予備能を評価するための Z スコア

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DOI:

10.3791/66504

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2024年10月25日

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1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、卵巣組織の凍結保存による妊孕性温存を必要とする 25 歳未満の患者の卵巣予備能を評価する方法を説明しています。この方法には、(1) 皮質サンプル中の卵巣予備能の組織学的評価、(2) 参照データセットとの比較、および (3) Z スコアの計算が含まれます。

要約

女性は、卵巣予備能と呼ばれる再生不可能な卵巣卵胞のプールを持って生まれます。この予備力は卵巣の原始卵胞で構成されており、遺伝性疾患や内分泌障害、医学的介入、内分泌かく乱物質など、多くの要因の影響を受ける可能性があります。性腺毒性治療が必要な場合は、生殖能力の保存が推奨されます。女性に好ましい選択肢は、卵子と胚の凍結保存です。しかし、非常に若く性的に未熟な患者では、卵巣組織の凍結保存が唯一の選択肢です。凍結保存された組織サンプルの卵胞密度を知ることは、若年患者の不妊治療カウンセリングに不可欠です。このプロトコルは、25 歳以下の少女および若年女性の卵巣組織の質を評価するためのツールとして、皮質卵胞密度の Z スコアの使用を示しています。患者サンプルの卵胞密度は、標準からの逸脱の可能性を推定するためにHassanらによって開発された年齢正規化された参照標準と比較されます。卵胞密度は、組織学的定量化によって測定されます。このために、卵巣皮質組織の小片(~2 mm x 2 mm x 2 mm)をブイン溶液またはホルムアルデヒド溶液に固定し、パラフィンに包埋し、厚さ4 μmで切片化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、スライドスキャナーを使用してデジタル化します。皮質に存在する卵胞期は、原始卵胞から一次卵胞までさまざまです。皮質領域は、組織切片の表面上皮から1mmでした。卵胞密度は、Schmidtらによって提示された修正式を使用して計算され、Zスコアは参照平均と標準偏差を使用して決定されます。Zスコアは、測定値が参照平均からどれだけ逸脱しているかを示し、卵巣予備能の減少(<-1.7 Zスコア)を決定します。この方法により、卵胞密度は、妊孕性の維持を必要とする若い患者の卵巣予備能の貴重な尺度として使用できます。

概要

卵巣は、外側の皮質と内側の髄質からなる、動的で内分泌的に活動的な器官です。卵巣内に不均一に分布しているのは卵胞であり、卵胞には間質顆粒膜細胞1に囲まれた性腺卵子が含まれています。すべての卵胞は胎児の発育中にすでに形成されており、妊娠期間の約20週でピークに達し、その後指数関数的に減少します。出生時には、100万〜200万個の原始卵胞が皮質内に残り、思春期まで生き残るのは数十万個の卵胞だけです2。成長していない卵胞プールは、卵巣予備能とも呼ばれ、他の要因の中でも特に女性の生殖能力に影響を与えます。卵巣予備能は皮質内に存在し、卵胞が成長して成熟するにつれて髄質に移動します。一部の研究者は、卵巣予備能が原始卵胞のみで構成されていると認識していますが、他の研究者はすべての単層卵胞(すなわち、原始卵胞、中間卵胞、および一次卵胞)を含む3,4,5,6。女性の生涯の間に、300〜400個の卵胞だけが成熟し、最終的に排卵を経験するために生き残ります。更年期障害は、卵胞の数が約1000に減少したときに始まり、通常は約50歳で発生します2,7。現在、異種移植後に卵母細胞を形成する可能性のある成人ヒト卵巣における卵原幹細胞(OSC)の存在について、議論が続いています。いくつかの研究は、原始生殖細胞の遺伝子プロファイルを発現し、卵母細胞に分化する細胞を単離することを示唆している8,9が、他の研究は、主張されているOSCが血管の血管周囲細胞であることを示している10,11,12。

早発卵巣機能不全(POI)は、40歳より前にFSHレベルが上昇した月経周期の中止によって定義されます13。POIの原因は多因子性であり、特発性で発生する可能性があります。しかし、それはしばしば病状の結果として発生します14。たとえば、ターナー症候群15のように、出生時にすでに卵巣予備能が減少しているため、特定の先天性遺伝的状態がPOIに関連しています。POIは、性腺毒性治療の副作用としても発生する可能性があり、これは正常な思春期を経ることができず、卵巣予備能を劇的に損なう可能性があるため、非常に若い患者では特に問題です。POIのリスクと患者の年齢に応じて、成熟卵子の凍結保存、体外受精後の胚の凍結保存、卵巣組織凍結保存(OTC)など、いくつかの受胎能保存オプションが利用可能です。思春期前の患者にとって、OTCは彼らの性的未熟さのために唯一の実行可能な選択肢です16,17。米国では、OTCによる妊孕性保存は最近、許容可能な臨床ルーチンと見なされています18。しかし、OTCは多くのヨーロッパ諸国ではまだ実験的であると考えられており、特に自家移植には倫理的承認が必要です19,20。したがって、OTCプロトコルの選択基準を慎重に検討し、各患者に対してリスク・ベネフィット分析を実施する必要があります。性腺毒性療法を受けているすべての子供が妊孕性温存の対象となるわけではありません。スウェーデンでは、リスクが高いまたは非常に高い患者のみが、北欧小児血液腫瘍学会の妊孕性保存に関するガイドラインに従って妊孕性温存を受けることが推奨されています21。このグループには、(1)幹細胞移植を必要とする、または範囲の領域で卵巣による放射線療法を受けている思春期前および思春期後の子供、および(2)アルキル化化学療法の累積用量が高い思春期後の子供が含まれます。初潮前の女児の場合、不妊症のリスクが非常に高い場合の選択基準には、次のいずれかで治療されたものが含まれます:卵巣への放射線量>10Gy、または同種または自家造血幹細胞療法(HSCT)。除外基準には、手術前に他の抗凝固剤製剤に追加の血液製剤が必要な人、または好中球数が<1の人が含まれます。初潮後の少女/女性の場合、不妊症のリスクが高いまたは非常に高い場合の選択基準には、次のいずれかで治療されたものが含まれます:卵巣への放射線量>10Gy、または同種HSCT、シクロホスファミド>9 g /m²、イホスファミド>60 g /m²、プロカルバジン、またはニトロソ尿素化合物(BCNU / CCNU)>360 mg /m²。除外基準には、担当医が評価した出血リスクの増加、感染リスクの増加、外科的合併症のリスクの増加、または痛みの問題のリスクの増加があるものが含まれます。

OTCの場合、卵巣組織は、開腹術または腹腔鏡検査による腹部手術中に、片側卵巣摘出術または生検によって採取されます。髄質は、収集された卵巣組織から除去され、残りの皮質は、その後、生殖能力回復22で使用するために、制御された速度凍結またはガラス化を通じて凍結保存のために小さな断片に切片化される。その後、サンプルは、患者が治療から回復し、家族を始めることを希望するまで、液体窒素に保存されます。がんの種類にもよりますが、卵巣組織移植に対する禁忌がない場合、組織は解凍され、ホルモンと卵巣の機能を回復させるために自家移植されます。OTCは成功していることが証明されており、成人期に採取された凍結保存された卵巣組織の移植後に50%の妊娠率と200人以上の出生が報告されています23,24,25。小児期に採取された卵巣組織の自己移植後の出生報告は少なく、間違いなく思春期前の卵巣組織の自己移植後の出生は報告されていない26,27,28,29,30。組織の質は、生殖能力の回復を成功させるための前提条件です31。したがって、収集された組織サンプルの品質を研究することが不可欠です。

現在、卵巣組織の質を推定する方法は、組織学的切片と卵胞の手動カウントによるものです。ただし、卵胞密度の正規性を評価することは、年齢の増加に伴う予備力の自然な減少と卵胞の不均一な分布のために困難です。さらに、参照値との比較は、生検のサイズと年齢が標準化されていないため、困難です。AMHの血清レベルや、カルセインやニュートラルレッドによる消化組織の染色など、他の評価オプションは十分に確立されていないか、独自の制限があります。Wallace と Kelsey は以前に、既知の卵巣病変を持たない患者の全卵巣から卵胞数に関するデータを収集することにより、年齢を超えた正常な卵巣予備能のモデルを発表しました2.さらに、生検は卵巣全体を代表しているわけではないため、Schmidtらは皮質生検32に基づいて卵胞の総数を推定する方法を開発した。この方法の修正版と正常な卵巣予備能のモデルを使用して、0〜25歳の女性の卵胞密度の参照データセットが確立された33。

この記事では、(1)組織学を使用した卵胞の直接定量化、および(2)Zスコア による 年齢正規化標準参照との結果の比較により、小さな卵巣サンプルに基づいて卵胞密度の正規性を評価するための戦略について説明します。Zスコアの使用は、卵巣バイオピーの卵胞密度と年齢およびサイズで標準化された参照グループ平均との関係を表します。これは、医師が患者に自己移植や妊孕性保存後のさらなる治療についてカウンセリングする際に大きな価値があります。

プロトコル

実施されたすべての手続きは、スウェーデンの倫理審査機関 (Sveafertil 患者、Dnr: 2019-03802) およびヘルシンキ大学病院の倫理委員会 (HCH 患者、Dnr 340/13/03/03/2015) によって承認されました。研究に関する書面および口頭での情報は、研究看護師によって提供され、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントが得られました。18歳未満の患者については、法定後見人からインフォームドコンセントが得られました。すべてのサンプルは仮名化され、欧州一般データ保護規則(GDPR)に従って処理されました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 卵巣組織の採取と処理

注:不妊症のリスクが高いまたは非常に高い兆候がある場合は、不妊症の予防に適格なすべての患者を特定します 地域のガイドライン(例:北欧、ヨーロッパ、または国際的な特定のガイドライン)。ヨーロッパでは、不妊治療研究プログラムの一環としてのみ未成年の患者を募集します。不妊症のリスクを判断するには、お住まいの国の妊孕性維持に関するガイドラインをご覧ください。

  1. 全身麻酔下で外科的処置を行います。麻酔導入のために、プロポフォール(2 mg / kg)、スフェンタニル(0.5 μgram / kg)、臭化ロクロニウム(0.6 mg / kg)を静脈内投与します。.
    1. 6-8 mL/kgの潮汐量と6-8 cmのH2O.の陽呼気圧で患者を挿管し、換気します。
    2. 外科的処置中は臭化ロクロニウム(0.15 mg / kg)による神経筋遮断を維持して、適切な筋肉の弛緩を提供し、腹腔内気道圧の低下で腹腔鏡検査を可能にします。.
    3. バイスペクトルインデックスを使用して麻酔薬の深さをガイドし、麻酔薬の投与量を減らして急速な覚醒を促進します。残存神経筋ブロックをスガマデックス(2-4 mg / kg)で拮抗します。.
  2. 3ポート技術を使用して、10 mmのトロカールを臍の腹腔に挿入してカメラを取り付けた光学レンズを導入し、左右の腸骨領域(それぞれの上腸骨前棘の2 cm上と内側2 cm)に2つの5 mmトロカールを直視下で導入し、手術器具と組織回収を行います。両方の卵巣を含む骨盤内臓器を検査して、正常であることを確認します。
    1. アクセスが最も簡単な卵巣を特定し、それをつかみます。卵巣の約3分の1(または倫理許可証に示されているように)のボリュームをカットし、必要に応じてジアテルミーを使用して止血を確保します。.
      注:生検は、術中または術後の過度の出血の危険因子や感染リスクの増加などの禁忌がない場合にのみ実施してください。明確に指定し、国の包含基準と除外基準に従ってください。不妊のリスクが非常に高い場合、および/または一部のみを切断するリスクが高すぎると考えられる場合(出血など)は、卵巣全体を採取できます。サンプルを採取する前にジアテルミーを使用すると、組織に損傷を与える可能性があるため、使用しないでください。
  3. 手術室にいる間、CaCl2、MgCl2、1 g/L D-グルコース、36 mg/L ピルビン酸を含む 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL を含むチューブに組織をセットし、サンプルをラボですぐに処理する場合は 37 °C に温めるか (30 分以内)、長時間の輸送中 (最大 24 時間) は 4 °C に保ちます。
    注:輸送ソリューションには、市販の臓器輸送/灌流ソリューションと、PBSやMEM34などの単純なバッファーが含まれます。
  4. 卵巣の表面から卵巣組織の小片(2 mm x 2 mm x 2 mm)を切り取ります。このピースには、卵巣卵胞が見つかる卵巣の外側部分である皮質が含まれています35。
    注意: 卵巣などのヒト組織の取り扱いは、バイオセーフティレベル2の実践と手順を使用して行ってください。
    注:専門の生殖医療ユニットは、患者の生殖能力回復における将来の潜在的な使用のために、卵巣組織の残りの部分を臨床的に凍結保存します。
  5. 組織を350 μLのBouin溶液に室温で2時間、または4°Cで350 μLの4%ホルムアルデヒドに一晩置いて、組織が完全に沈んでいることを確認します。インキュベーション後、組織を70%エタノールで3回洗浄します。
    1. ブアン液は、黄色が消えるまで洗ってください。組織をパラフィンワックス36に埋め込む。厚さ4μmの連続組織切片を最低30個切断し、スライドガラス上に置きます。
      注意: ブインの溶液とホルムアルデヒドは、化学フード内で適切な保護具を使用して取り扱ってください。
      注:ホルムアルデヒドは、組織に収縮関連のアーティファクトを引き起こす可能性があります。したがって、Bouinのソリューションは、組織学を保存するための好ましい選択肢です。しかし、Bouin氏のソリューションにはさらなるリスクが伴うため、いくつかの機関はホルムアルデヒド37の使用を好むようになりました。

2. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

  1. 5 gのeosin Y粉末を100 mLのオートクレーブ滅菌ガラス瓶に秤量します。800 mLの95%エタノールと200 mLの脱イオン水を加えて、0.5%エオシンストック溶液を作ります。0.5% エオシンストック溶液 200 mL を 100% エタノール 160 mL、酢酸 1 mL、脱イオン水 40 mL で希釈して、0.25% エオシン作業溶液を調製します。
    注:粉末が完全に溶解しない場合があります。使用前に溶液をろ過して、沈殿物を減らします。
  2. スライドをラックに置きます。スライド付きのラックを次の順序で対応する容器に浸します:キシレンで15分、100%エタノールで5分、70%エタノールで10回浸漬、50%エタノールで10回浸漬、次に脱イオン水に10回浸漬します。
    1. スライド付きのラックをヘマトキシリン溶液に3分間浸し、スライド付きのラックを蒸留水道水を入れた容器に30秒間移して、余分なヘマトキシリンの汚れを洗い流します。
    2. スライド付きのラックを分化溶液(1 mLの37%HClを100 mLの70%エタノールに加えたもの)を入れた容器に1分間入れ、スライド付きのラックを蒸留水道水を入れた容器に30秒間移します。
      注意: 組織切片が液体に沈んでいることを確認してください。必要に応じて、容器に試薬を追加します。キシレンは5回使用するごとに交換してください。70%エタノールを希釈して50%エタノールを調製します(たとえば、15 mLのDPBSに35 mLの70%エタノールを加えて、50 mLの50%エタノールを作ります)。
      注意: キシレンはフードの内側に取り取り、適切な保護具を着用してください。
  3. スライド付きのラックをスコットの水道水(ブルーイングソリューションとも呼ばれます)に30〜60秒間置き、スライド付きのラックを蒸留水道水の入った容器に30秒間移します。スライド付きのラックをeosin作業溶液に1分間浸します。
    1. スライドを次の試薬に入れて脱水します:100%エタノールで30秒間、2番目の容器で100%エタノールで30秒間、次にキシレンに2回浸します。ラックをキシレン溶液から取り出した後、ボンネット内にキシレンが滴り落ちないようにガラス容器で乾かします。
    2. スライドを2滴の取り付け液で取り付けます。カバースライドを慎重に配置して気泡を防ぎ、取り付け溶液を乾かします。
      注意: キシレンはフードの内側に取り取り、適切な保護具を着用してください。
  4. 可能であれば、スライドスキャナーを使用してスライドをスキャンしてデジタル化します。このオプションが利用できない場合は、通常の倒立顕微鏡を20〜40倍の倍率で使用して、卵胞を直接カウントします。画像解析ソフトウェアでの面積測定を容易にするために、生検全体の画像を必ず撮影してください。

3.卵胞のカウント

  1. スライドがデジタル化されている場合は、適切なソフトウェア(オープンソースソフトウェアの QuPath38など)を使用してファイルを開きます。デジタル化されていない場合は、倒立顕微鏡とそれぞれのソフトウェアを使用して直接分析を実行します。
    1. ファイルをQuPathのメインウィンドウにドラッグします。画像タイプを 明視野H&E に設定します( 図1Aを参照)。スケールバーを使用して、表面上皮(表面を覆う直方体細胞の単層)から1mmを定義します。 楕円 ツールをクリックし、毛根に注釈を付けます( 図1Bを参照)。
    2. この1mmの領域内の卵胞の数を、原始期から一次期まで数えます。各卵胞の病期を特定します(原始 - 卵子を囲む平らな顆粒膜細胞の層、中間期 - 平らな顆粒膜細胞と立方体顆粒膜細胞の混合物、一次 - 卵子を囲む立方体顆粒膜細胞の1つの完全な層)。
    3. サンプルID、年齢、各スライドの卵胞数、切片の厚さ、およびn番目の切片を、Follicle in mm3という名前のシートに入力してください(補足ファイル1および図2Aを参照)。
      注:卵胞の直径(最小の卵胞>35μm)により、同じ卵胞が連続したセクションに表示される場合があります。セクション間の距離が卵胞の直径よりも小さいセクションをカウントする場合は、特に注意してください。好ましくは、10番目の セクション(例えば、セクション#10、#20、#30)ごとに卵胞を数えます。表面上皮は組織処理中に剥離することがあり、スライドには部分的にしか存在しない可能性があります。細胞質が見える卵胞のみを数えます。品質管理のために、2人の人が独立して卵胞を数え、カウントがどれだけ整列しているかを判断します。同じサンプルの各オブザーバーの卵胞数間の単純な相関関数を使用して、オブザーバー間の一致を計算します。
  2. 目視で、カウントされた各セクションの卵胞の最大の10%を特定します。これらの卵子の平均直径を測定するには、線ツールをクリックし、卵母細胞膜を通る2本の垂直線を引いて、[測定]、[注釈測定値の表示]の順に選択します(図1Cを参照)。
    1. カラムの長さμmの下に測定値を記録します(図1Dを参照)。卵胞Zスコア計算機Excelファイル(卵胞(mm3))の各スライドの[平均卵子直径(μm)]フィールドに、すべての卵子の平均直径を入力します(Follicle in mm3、補足ファイル1および図2Aを参照)。
  3. QuPathの画面中央に画像を配置し、 ImageJ アイコンをクリックします。[ スナップショットを ImageJ に送信 ] を選択します ( 図 3A を参照)。ImageJで、 ブラシ ツールを使用して境界線から1mmの境界線を描きます。 [Image] をクリックし、[ Type] をクリックして [8-bit ] を選択します ( 図 3B を参照)。
    1. 線ツールをクリックし、画面の左下にあるスケールバーに線を引きます(図3Cを参照)。[分析] をクリックし、[スケールの設定] をクリックし、スケール バーに示されている長さを [既知の距離] フィールドに入力し、[OK] をクリックします (図 3C を参照)。[画像]をクリックし、[調整]、[明るさ/コントラスト]の順にクリックし、[自動]を選択します(図3Dを参照)。
    2. [Image] をクリックし、[Adjust]、[Threshold] の順にクリックし、[Auto] を選択します (図 3E を参照)。ワンドツールをクリックして領域を選択し、Ctrl + Mを押します(図3Fを参照)。面積値を卵胞Zスコア計算機Excelファイル(Follicle in mm3、補足ファイル1および図2Aを参照)に入力します。

4. 卵胞密度、皮質容積、Zスコア計算

  1. 提供されているFollicle Z-score calculator Excelファイルを使用して、以下に概説する計算を自動的に実行します。結果は、セクション3に示されている詳細が「follicles in mm³」シートに入力されている場合、Excel計算機( 補足ファイル1を参照)のシート「Zスコア(follicle per mm³)」に表示されます。
  2. これらのセクションの卵胞密度を計算するには、Schmidt et al.32 によって提示された修正式を使用します。まず、補正係数αを適用して、同じ卵胞の二重カウントを考慮します。変更された式は次のとおりです。
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    注:この式では、 t は切片の厚さ、 d は卵母細胞の直径、 q は卵胞の直径を切片の厚さで割った商です。
  3. 次の式33を使用して、セクション内の卵胞数から皮質内の卵胞の総数(n個の卵胞)を推定します。
    figure-protocol-3
    注: この式では、計算されていないすべてのセクションも考慮されます。ここで、γは計算されないセクションの数を表し(たとえば、10番目の セクションごとにカウントされる場合、γ = 10)、αは4.1で計算された補正係数、 N はカウントされたセクションの数、 n i はカウントされたセクションの卵胞の総数です。
    1. 次の式33を使用して、カウントされた領域から皮質体積全体(V)を推定します。
      figure-protocol-4
      注:ここで、 Ai はセクションの領域であり、 ti は組織の厚さです。γと Nについては、手順4.2を確認してください。
    2. 次の式33 を使用して、卵胞密度を計算します。
      figure-protocol-5
  4. 式33を使用してZスコアを計算することにより、卵巣予備能が減少している(<-1.7 Zスコア)かどうかを判断します。
    figure-protocol-6
    注:Zスコアは、セクション3(卵胞カウント)(図2B)で提供された情報に基づいて、Excel計算機(補足ファイル1を参照)のシート「Zスコア(卵胞/mm³)」で自動的に計算されます。この式では、Z は Z スコア、x は研究サンプルの計算された卵胞密度 (卵胞/cm3) (ステップ 4.4)、M はそれぞれの年齢層の平均卵胞密度、SD はそれぞれの年齢層の標準偏差です。0〜25歳の女性の基準値は、Hassan et al.33で確立されています。それぞれの年齢層の卵胞密度の平均と標準偏差は、卵胞Zスコア計算機Excelファイル(補足ファイル1)にあり、Zスコアの計算に使用できます。

結果

卵巣卵胞は、切片作製、染色、およびスライドのスキャンが成功した後に定量化されます。卵胞のさまざまな段階と健康状態が区別され、さらに分析されます。 図4Aでは、成人のBouin固定卵巣のHE染色断面が、皮質組織と髄質組織の例とともに示されています。 図4B は、子供の卵巣の代表的な写真と表面上皮の例を示しています。卵巣予備能(すなわち、成長していない卵胞プール)と小さな成長卵胞は皮質に存在します。仮想顕微鏡を使用して、卵胞を拡大して分類し、卵巣予備能のみが含まれるようにします。 図5 は、Bouinの(図5A)およびホルムアルデヒド固定(図5B)卵巣皮質組織で発見され、カウントされた卵胞の段階を表しています:(1)原始卵胞(直径約40μm)、(2)中間卵胞、および(3)一次卵胞。卵胞4〜6は、成熟段階を正しく割り当てることができないためにカウントから除外される卵胞の例です。 図6 は、卵胞がない、または少ない卵巣皮質組織(図6A)と中程度から多い卵胞数の卵巣組織(図6B)の代表的な画像を示しています。 図7 は、髄質組織のみが存在する(図7A)または組織の質が悪い(図7B)ために除外される組織切片の代表的な画像を示しています。 図 2 は、Follicle Z スコア計算機の Excel ファイルのスクリーンショットを示しています。計算された数値と関連するZスコアは、入力されたデータから自動的に計算されます。Z スコア <1.7 は、ターナー症候群16 患者の曲線受信者動作特性 (AUC-ROC) 曲線下面積に基づく卵巣予備能の減少を示します。

figure-results-1
図1:QuPathソフトウェアの使用のスクリーンショット。 (A)QuPathで画像ファイルを開き、画像の種類を設定するプロセスを表示します。(B)ソフトウェア内の楕円ツールを使用して卵胞に注釈を付ける。(C,D)注釈付き画像内の卵子の平均直径を測定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:卵胞Zスコア計算機Excelファイルのスクリーンショット。 (A)「Follicles in mm³」シートには、サンプルID、年齢、N番目の 切片、最終的な卵胞数、面積、平均卵母細胞径、切片の厚さ、およびカウントされたすべてのN番目の切片のデータを入力するフィールド(緑色のセル)が表示されます。卵胞密度(卵胞/mm³)は、必要なデータがすべて入力されると自動的に計算されます。データが不完全な場合は空白のままです。(B)「Zスコア(Follicles per mm³)」シートは、「Follicles in mm³」シートのIDデータ、年齢データ、卵胞/mm³データをリンクし、サンプルのZスコアを自動的に計算します。対応する参照値が右側の表に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:ImageJソフトウェアの使用のスクリーンショット (A)QuPathからImageJへの画像の転送。(B)ImageJ内で画像の種類を設定する。(C)測定のスケールを確立する。(D,E)画像の明るさ/コントラストとしきい値を自動調整します。(F)調整された画像内の領域を測定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:卵巣組織の代表的な画像 (A)性別適合手術を受けている成人の卵巣の画像。体細胞の密度が高く、卵巣予備能を含む皮質は、密度が低く、体細胞が大きく、多くの場合、より多くの血管を含むことを特徴とする髄質組織とともに見えます。(B)妊孕性温存を受けている子供の卵巣の画像。皮質は、表面上皮から1mmを測定することによって決定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:さまざまな溶液で固定された卵巣の卵胞の代表的な画像。 (A)ブイン溶液で固定された卵胞と、(B)さまざまな段階で4%ホルムアルデヒドで固定された卵胞:(1)原始期の卵胞、(2)中間期の卵胞、(3)一次期の卵胞。卵胞(4)〜(6)は、目に見える細胞質がないため除外されます。ホルムアルデヒド固定で一般的なアーチファクトには、組織からの基底膜の分離(緑色の矢印で示される)およびピクノティック顆粒膜細胞(黄色の点で示される)が含まれます。スケールバーは50μmを表します。この図は、Björvang et al.39から採用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:小児卵巣の皮質生検の代表的な画像。 (A)卵胞数がゼロから低いことを示す生検、および(B)中程度から高い卵胞数を示す生検。卵胞にはアスタリスク(*)が付いています。青い破線は表面上皮から1mmの位置を示し、黒い線は表面上皮を示します。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:除外する組織切片の代表的な画像。 (A)皮質ではなく髄質が採取された卵巣片。この部分は、表面上皮がないことと細胞の密度が低いため、髄質として特徴付けられます。(B)組織の擦り傷によって識別される、質の悪い組織切片。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:卵胞Zスコア計算機。 このファイルは、卵胞のZスコアの計算を容易にします。データ(サンプルID、年齢、スライドあたりの卵胞の数、セクションの厚さ、カウントされたN番目の セクション、および面積)を「Follicles in mm³」シートに入力する必要があります。その後、Zスコアは自動的に計算され、「Zスコア(Follicles per mm³)」シートにまとめられます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

女性は生まれつき有限の卵子のプールを持っており、それを補充することはできません。卵巣予備能は、女性の生殖能力の重要な決定要因です。この記事では、卵胞密度の組織学的定量方法と、若年患者と 25 歳までの女性における卵巣皮質卵胞密度の Z スコアを使用した参照標準との比較方法について概説します。

このプロトコルでは、卵巣組織は、不妊症のリスクが高いまたは非常に高い少女および女性から採取されます 妊孕性温存のためにOTCを受けている、または性別適合手術を受けている患者から。卵巣組織の小片を使用して、凍結保存された材料を評価します。卵巣予備能は年齢によって異なるため、卵胞密度をZスコアに変換すると、出生から性的成熟までの年齢正規化された参照値と比較できます(Hassan et al.33)。Zスコアの使用は、卵巣予備サンプルの正規性を推定するための、年齢標準化されたコホートに依存しない方法を提供します。年齢に基づく参照グループ平均が確立され、個々のサンプルのZスコア計算に使用されます。このアプローチにより、調査対象集団内の年齢分布に依存しない正規性の評価が可能になります。卵巣予備能の年齢標準化された評価により、同様の遺伝的背景を持つ患者や異なる研究集団間での化学療法への曝露のデータを組み合わせることができ、大規模なメタアナリシスが容易になります。

この方法には制限があります。卵巣の病理が知られていない患者の卵巣組織における卵胞数は限られています。確立された参照標準は、特に異なる年齢層を考慮した場合に、少数のサンプルに基づいており、OTCを受ける25歳までの女性にのみ適用されます。したがって、このツールは25歳以上の女性には適用されません。さらに、小さな皮質組織片は、生殖年齢の女性であっても、皮質32全体の卵胞の不均一な分布のために、いかなる卵胞も含まない可能性がある。さらに、埋め込みプロセス中の組織の向きが、皮質の正しい識別を曖昧にする可能性があります。生検はしばしば非常に小規模であり、生検収集の方法は標準化されていないため、主に髄質の卵巣組織を受け取る可能性があり、Zスコア評価には適していません。

さらに、残りの受胎能を診断するための卵巣生検の使用はまだ研究で確認されていません40。この方法では、卵胞の健康状態ではなく、卵胞の密度のみが考慮されることに注意することが重要です。組織アーチファクトを引き起こすことが知られているホルムアルデヒド固定組織の使用( 図5Bに示すように)は、異常な形態が卵胞閉鎖症に起因するのか、それとも固定手順に起因するのかの判断を複雑にします。この問題は、将来的には、定量的位相顕微鏡41や代替固定剤37などのラベルフリーの高分解能イメージング技術を使用して対処される可能性があります。さらに、生検の採取から手作業による卵胞のカウントまでの全プロセスは、侵襲的で、時間がかかり、労働集約的であるため、一部の患者グループにとって組織学による卵胞密度評価は実用的ではありません。

さらに、どの卵胞が成熟する運命にあるのか、また化学療法が卵巣予備能のサイズと機能にどのような影響を与えるのかは不明のままである。卵巣組織移植の成功との相関関係を確立するには、この方法を大規模かつ長期間にわたって使用したさらなる研究が必要です。

それにもかかわらず、この方法は卵巣生物学の研究と臨床不妊治療カウンセリングの両方で大きな価値を持っています。Zスコアを使用すると、個人の卵巣予備能を参照標準と比較することにより、その解釈が向上します。これにより、さまざまな患者グループや研究集団にわたる卵巣予備能のサイズと正常性を包括的に調べることができます。例えば、この方法は、卵巣予備能と、環境化学物質や性腺毒性治療などのさまざまな曝露との関連を評価するために採用することができる39。いくつかのクリニックでは、凍結保存のための組織調製中に組織学的評価のために小さな生検を定期的に取得しています。このような場合、この方法は、凍結保存前の卵巣予備能の正規性を決定するのに役立つ可能性があります。要約すると、卵胞密度は、集団レベルでの卵巣予備能サイズを推定するために使用できる39、この方法は疫学研究や不妊治療カウンセリングのための貴重なツールとなっている。

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

参加者の募集と組織採取に協力してくださった医療従事者の皆様、そして卵巣組織を提供してくださったすべての患者様に感謝いたします。また、この活動を可能にしたKIDに資金を提供したChildhood Cancer Fund(PR2020-0096)とKarolinska Institutet PhDにも感謝します。また、組織学的スライドの作成にご協力いただいたMorphological Phenotype Analysis施設にも感謝いたします。この原稿を言語校正してくれたNicola Byersに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水サーモフィッシャー14190144
1x リン酸緩衝生理食塩水 w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-グルコース, 36 mg/L ピルビン酸 サーモフィッシャー14287-080
37% 塩酸Sigma-Aldrich1.09057.1000
70% エタノールHistolabs01370.01L
95% エタノールフィッシャー サイエンティフィ10572143
無水エタノールHistolabs01399.01L
Bouin's solutionSigma-AldrichHT10132-1L
エオシンY遊離酸シグマ-アルドリッチE4009-5G 
ホルムアルデヒドサーモフィッシャー28908
シグマアルドリッチ03971-250MLヘマトキシリン溶液
ImageJ
マイクロソフトエクセル
ミクロトーム 
Pertex取り付けソリューション Histolabs00840-05
プロポフォールバクスター ホールディング B.V.カタログ番号
臭化ロクロニウム B. ブラウン・メルズンゲン社 M03AC09カタログ番号の代わりにATCコードを提供
スコットの水道水代替品濃縮シグマ-アルドリッチS5134-6x100ml
セボフルランバクスターメディカルAB カタログ番号の代わりにATCコードを提供N01AB08
スライドスキャナー 
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03.の代わりにATCコードを提供
カタログ提供されるATCコード
V03AB35 ヒストラブ 06400 
SuperFrost Plus White 顕微鏡スライドHistolabs 06400 
キシレン・サヴェーン・ヴェルナー131769.1611
ック デラフィールドによるQuPathの代わりにATCコードを提供N01AX10 https://qupath.github.io/ 物カタログ番号Sugammadex Baxter Holding B.V番号SuperFrostと白の代わりに

参考文献

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A. The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Cambridge University Press. 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147(2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. ART Fact Sheet. , European Society of Human Reproduction and Embryology. https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020).
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254(2023).
  21. Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology (NOPHO). , http://www.nopho.net (2013).
  22. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290(2022).
  23. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  24. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  25. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  26. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  27. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  28. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia - a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  29. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  30. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  31. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  32. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  33. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).
  34. Vilela, J. deM. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  35. Gibson, E., Mahdy, H. Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545187/ (2023).
  36. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569(2018).
  37. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  38. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  39. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589(2021).
  40. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  41. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

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