方法論記事

プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語)

DOI：

10.3791/66507

⸱

2024年5月24日

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

この記事について

サマリー

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プロテアーゼ活性化受容体(PAR)のリガンドを同定するために使用される、内皮細胞を用いたカルシウム動員アッセイの改良されたプロトコルが開発されました。新しいプロトコルにより、合計アッセイ時間が90〜120分短縮され、再現性のある濃度-反応曲線が得られます。

要約

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細胞内カルシウム濃度の変化は、細胞内、蛍光、カルシウム結合性色素、および最大1,536ウェルからの蛍光発光を同時に測定できるイメージング機器を使用して、ハイスループットで迅速にモニタリングされます。しかし、これらの機器ははるかに高価であり、ウェルを個別にスキャンする広く利用可能なプレートリーダーと比較して、保守が困難な場合があります。ここでは、内皮細胞株(EA.hy926)と併用して、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)によるGαq シグナル伝達の活性化と、それに続くカルシウムの動員を測定するための最適化されたプレートリーダーアッセイについて説明します。このアッセイは、ドッケンドルフ研究室で同定されたアロステリックPAR1を標的とする抗炎症性「パルモジュリン」リガンドを含む、さまざまなPARリガンドの特性評価に使用されています。このプロトコルは、自動化されたリキッドハンドラーの必要性を排除し、96ウェルプレートのPARリガンドのミディアムスループットスクリーニングを可能にし、カルシウムの動員を開始する他の受容体の研究に適用できるはずです。

概要

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プロテアーゼ活性化受容体(PAR)1,2,3は、血小板細胞や内皮細胞4,5,6,7を含む様々な細胞タイプで発現するクラスA Gタンパク質共役受容体(GPCR)のサブファミリーである。大多数のGPCRとは異なり、PARは独自の分子内活性化モードを持っています。ほとんどのGPCRは、明確な結合ポケットと相互作用する可溶性リガンドによって活性化されますが、PARはN末端のタンパク質分解性切断によって活性化され、その結果、細胞表面の細胞外ループ2ドメインと相互作用できる新しいテザーリガンドが得られます6,8,9。この相互作用は受容体を活性化し、いくつかのシグナル伝達経路を開始し、炎症や血小板活性化などの効果を促進することができる4,10,11,12。異なるプロテアーゼは、N末端のユニークな部位での切断を通じてPARを活性化することができ、受容体の立体配座を安定化させる異なるテザーリガンド(TL)を明らかにし、異なるシグナル伝達経路を開始する9,13,14,15。例えば、サブファミリーの中で最もよく研究されているメンバーであるPAR1では、トロンビンによる切断は、血小板の活性化や内皮への白血球の動員など、多数の生物学的プロセスをサポートするために使用されますが、受容体が過剰発現または過剰に活性化されると有害な影響をもたらす可能性があります4,16,17,18,19,20,21 .逆に、活性化プロテインC(aPC)による切断は、抗炎症作用および内皮バリアの維持を促進することができる15,22,23,24,25,26,27,28,29。PARはまた、TLのペプチド類似体によって分子間的に活性化することもできる13,30,31。これらのペプチドは、PARターゲティングプロテアーゼの代わりにPAR阻害(調節)を測定するために日常的に使用されており、このプロトコルで使用されます。

病理学的PAR1シグナル伝達には、敗血症22,32、心血管疾患33,34,35,36,37,38、腎臓病39,40,41,42、鎌状赤血球症43、線維症44、骨粗鬆症および変形性関節症45など、多数の障害が関連しています、46、神経変性47、48、49、50、51、および癌52、53、54、55、56、57、58、59.PAR1のアンタゴニストは、1990年代から心血管疾患の抗血小板薬として研究されており、この受容体に関連する疾患のリストが増加する中、生物学的プローブ(ツール化合物)または潜在的な治療薬として使用するための新規リガンドの同定が必要とされています。現在、FDAが承認したPAR1拮抗薬は、高リスク患者34,36,37,60の冠状動脈疾患の治療に使用されるボラパキサールの1つだけです。代替のPAR1拮抗薬であるペプデューシンPZ-128は、心臓カテーテル検査患者の血栓症を予防するための第II相試験を成功裏に完了した38。ドッケンドルフグループは、パルモジュリン61,62として知られる別のクラスの低分子であるPAR1リガンドの医薬品化学および薬理学に焦点を当ててきました。ボラパクサールなどの報告されたPAR1拮抗薬とは異なり、パルモジュリンはアロステリックで偏ったPAR1のモジュレーターであり、Gαq経路を選択的にブロックしながら、aPCと同様の細胞保護効果を促進します。ボラパキサールのような強力なオルソステリックPAR1アンタゴニストとは異なり、公表されたパルモジュリンも可逆的である63,64,65。

最初に、パルモジュリンは、血小板61,66のP-セレクチン発現または顆粒分泌を阻害する能力について、Flaumenhaftおよび同僚によって同定されました。しかし、内皮細胞に対するパルモジュリンの影響を研究するためには、別の方法が必要でした。GPCR関連のシグナル伝達をモニタリングする一般的な方法の1つは、適切な細胞内カルシウム結合色素67,68を用いて測定できる重要な二次メッセンジャーである細胞内Ca2+の動員を測定することである。PAR1によって誘発されるカルシウム動員は、Gαq69,70の活性化によるものであることを示す実質的な証拠が提供されています。そのつながれた配位子(または適切な外因性配位子)によって活性化されると、PAR1は構造変化を起こし、Gαqサブユニットに結合したグアノシン二リン酸(GDP)がグアノシン三リン酸(GTP)に置き換えられます68。次に、GαqサブユニットはホスホリパーゼCβ(PLC-β)を活性化し、ホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェート(PIP2)の加水分解を触媒し、1,4,5-イノシトール三リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DAG)を形成します。最後に、IP3は、小胞体の膜におけるIP3感受性Ca2+チャネルに結合し、Ca2+が細胞質に放出されることを可能にし、そこで細胞71に添加されるFluo-4のようなCa2+依存性蛍光色素に結合することができる。このプロセスは数秒以内に発生し、Caの濃度を2+100倍に増加させ、カルシウム結合色素の量が大幅に変化し、強力な蛍光シグナルが得られます。

2018年、ドッケンドルフのグループは、PAR172のGαq経路のアンタゴニストを同定するために使用できるミディアムスループットのCa2+動員アッセイを発表しました。このアッセイでは、ハイブリッドヒト内皮細胞株であるEA.hy92673を使用しましたが、これはPAR1発現に顕著な変化なしに複数の継代に使用できるほか、細胞保護効果のin vitro測定に確立されています。

元のプロトコルでは、EA.hy926細胞を96ウェルプレートに充填し、488 nmの強い蛍光と高い細胞透過性のために選択されたFluo-4/AM色素をロードしました。色素が細胞にロードされると、自動化された8チャンネルのリキッドハンドラーで長い洗浄ステップが実行されました(96チャンネルウォッシャーなどのより高速なリキッドハンドリング方法は利用できませんでした)。このアッセイの再現性は、慎重な自動化されたロボット培地の変更がない場合よりも優れていました。次に、アンタゴニストを細胞とインキュベートし、選択的アゴニストを逐次添加してPAR1を活性化し(一度に16ウェル)、カルシウムの動員と色素結合による蛍光の変化を測定して活性を決定しました。

このプロトコルでは、PAR1を介したカルシウム動員の測定が可能ですが、各96ウェルプレートのアッセイに必要な時間には制限があります。実験時間が長いと、1日にスクリーニングできる化合物の数が限られているだけでなく、時間の経過とともに色素の流出が発生し、基礎蛍光が増加することでアッセイウィンドウが狭くなるため、問題があります。実験時間が長い原因の1つは、プレート洗浄に8チャンネルのリキッドハンドラーを使用していることであり、これにより各実験に30分以上かかります。また、サプライチェーンの問題により、必要なチップの入手も困難になりました。ここでは、PAR媒介カルシウム動員アッセイの更新されたプロトコルが報告されており、リキッドハンドラーを必要としないため、より高いスループットで実行できます。このプロトコルは、細胞内カルシウムの動員につながる他のGPCRとのシグナル伝達の測定にも適しているはずです。この更新されたプレートリーダープロトコルは、高価な細胞イメージング装置のためのリソースはないが、多数の化合物を迅速にスクリーニングする必要がある学術および小規模な産業ラボに最適です。プレートイメージャーを使用したカルシウム動員アッセイの例については、Caers et al.74を参照してください。

プロトコル

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以下のプロトコールのステップ1および2で行われたすべての培地交換/添加は、滅菌フード内で行われます。特に明記されていない限り、滅菌フードに使用されるすべてのプラスチック製品は、滅菌して購入し、滅菌して密封するか、オートクレーブを介して適切に滅菌する必要があります。

1. EA.hy926細胞株の作製開始

  1. EA.hy926細胞を取得します。
  2. 細胞のバイアルを液体窒素タンクの気相で保存します。
  3. まず、DMEM、FBS、およびペン/連鎖球菌(具体的な詳細は 材料の表 を参照)を37°Cの水浴で15〜30分間温めて、DMEM一式培地を調製します。500 mLのDMEMに50 mLのFBSと1 mLのペン/連鎖球菌を加えます。.溶液を反転させて穏やかに混合します。
    注意: 激しく混合しすぎると、気泡が過剰に発生します。
  4. 液体窒素から細胞のバイアル1つを取り出し、37°Cの水浴で5分間温めます。
  5. 細胞のバイアルとDMEM完全培地のボトルをアルコールを噴霧して滅菌し、滅菌フードに移動します。
  6. 1,000 μLのピペットを使用して、細胞を15 mLの滅菌遠心チューブに慎重に移します。バイアルに1 mLのDMEMを加えてすすぎ、遠心チューブに加えます。
  7. 遠心分離機(150 × g、5分、22°C)を使用して細胞のペレットを作成します。吸引により遠心分離管から媒体を取り出します。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  8. 3 mLのDMEM完全培地を遠心チューブに加え、1,000 μLのピペットを使用して細胞懸濁液を混合してペレットを穏やかに分離します。
    注:激しく混合しすぎて気泡を発生させると、細胞が活性化または損傷する可能性があるため、避ける必要があります。
  9. チップが20 μLまたは200 μLのピペットを使用して、微量遠心チューブ内で10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合します。細胞懸濁液/トリパンブルー混合物10μLを血球計算盤に加え、細胞をカウントします。
    注:0.1〜10μLのピペットチップを使用すると、細胞をせん断できます。このサイズのチップは、細胞懸濁液の取り扱い中に使用しないでください。
  10. DMEM完全培地を細胞懸濁液に加え、10 mLまたは25 mLの血清ピペットを使用して66,000細胞/mLの密度にします。15 mLの細胞懸濁液をT-75培養フラスコにピペットで移します。フラスコを北から南、東から西に移動させることにより、細胞懸濁液が均等に分散するようにします。
  11. 顕微鏡下での検査によって推定されるように、細胞がコンフルエントに達するまで(通常は4〜6日後)細胞をインキュベートします。この時点で、実験の細胞を使用するか(セクション2から開始)、または新しいフラスコに播種して増殖させ、凍結ストックを調製します(T-75フラスコあたり15 mLの完全培地に1,000,000個の細胞の推奨播種密度で)。
    注:細胞は、アッセイの形状、健康状態、または性能に顕著な違いなく、培養フラスコ内で3週間も増殖させることができます。完全な培地は3〜4日ごとに交換する必要があります。

2. EA.hy926細胞の96ウェルプレートへの添加

注:1つのコンフルエントT-75培養フラスコからの細胞は、2つまたは3つのアッセイプレートを調製するために使用することも、オプションで最大15個の新鮮なT-75フラスコに拡張することもできます。通常の就業日には、セクション4および5のプロトコルを使用して、少なくとも5つのアッセイプレートをスクリーニングできます。以下の説明では、1つのアッセイプレートの調製と試験について説明していますが、ステップ2.2、2.7、2.12、および3.2を繰り返して、必要な数のアッセイプレートを調製することで、追加のプレートを調製できます。最も一般的には、最大16種類の化合物の濃度反応を測定するために、1日あたり4枚のアッセイプレートが調製されますが、これにはコンフルエントセルを備えた2つのT-75フラスコが必要です。

  1. DMEM完全培地を37°Cのウォーターバスで15〜30分間温めます。DMEMコンプリートメディウムのボトルにアルコールを噴霧して滅菌し、滅菌フードに移動します。
  2. 滅菌した0.4%ゼラチン溶液100 μLを、蓋付きの黒壁96ウェル透明底プレートのすべてのウェルに加えます。プレートをゼラチン溶液とインキュベーター(37°C、5%CO2)で30分間インキュベートします。
  3. 倒立顕微鏡を使用して、T-75培養フラスコ内の細胞が80〜100%コンフルエントであることを確認します。吸引により、DMEMコンプリートメディウムをT-75フラスコから取り外します。
  4. フラスコ内の細胞を10mLのPBSで洗浄し、フラスコを北から南、東から西にゆっくりと動かします。吸引によりフラスコからPBSを取り外します。
  5. 5 mLの細胞解離溶液をフラスコに加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)でフラスコを~12分間インキュベートします。6分後にフラスコを軽くたたいて、解離を促進します。
    注:参照された細胞解離剤と細胞を15分以上インキュベートすると、細胞が凝集し始め、正確な細胞数を得ることが難しくなり、アッセイに支障をきたす可能性があります。
  6. 予熱したDMEM完全培地5 mLをフラスコに加え、細胞解離溶液/細胞懸濁液に穏やかに混合します。10 mLの血清ピペットを使用して、細胞懸濁液を滅菌済みの50 mL遠心チューブに加えます。遠心分離機(150 × g、5分、22°C)を使用して細胞のペレットを作成します。
  7. ペレットが形成されている間に、真空に接続されたパスツールピペットを使用して吸引することにより、96ウェルプレートからゼラチン溶液を除去します。ゼラチンの除去時から溶液をめっきする準備が整うまで、プレートの蓋を取り外してください。
    注:真空に接続されたマルチチャンネルピペットまたは滅菌マニホールドをオプションで使用することができます。
  8. 真空または血清ピペットに接続されたパスツールピペットを使用して吸引することにより、遠心分離管から培地を取り出します。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  9. 5 mLまたは10 mLの血清ピペットを使用して、新鮮なDMEM完全培地を遠心チューブに加えます。DMEM完全培地を1,000 μLピペットまたは5 mL血清ピペットと混合して、細胞ペレットを穏やかに砕きます。
    注:通常、8ミリリットルのDMEMが使用されますが、細胞のカウントを容易にするために、より多くのDMEMを追加することができます。
  10. チップが20 μLまたは200 μLのピペットを使用して、微量遠心チューブ内で10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合します。細胞懸濁液/トリパンブルー混合物10μLを血球計算盤に加え、細胞をカウントします。
  11. DMEM完全培地を細胞懸濁液に加え、10 mLまたは25 mLの血清ピペットを使用して600,000細胞/mLの密度を作製します。これにより、96ウェルプレートで60,000細胞/ウェルの最終密度が得られます(実験により最適な密度であると決定されました)。
    注:通常の成功した細胞培養では、12,000,000〜15,000,000個の細胞が得られ、2〜3枚の96ウェルプレートを播種できます。
  12. 遠心チューブを静かに反転させて細胞懸濁液を混合し、50 mLマルチチャンネルピペットリザーバーに加えます。リザーバーを左右に穏やかに揺さぶることにより、リザーバー内の懸濁液を30秒ごとに混合し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLの細胞懸濁液を加えます。透明プレートカバーを取り付け、プレートを無菌フードの表面にスライドさせて北から南、東から西にスライドさせて軽く振ると、細胞が均一に分布するようにします。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)で16〜24時間インキュベートします。
    注:追加の細胞懸濁液を使用して追加のプレートを調製することも、ステップ1.10〜1.11を繰り返して細胞株を継続することもできます。

3. カルシウム動員アッセイの調製

  1. アッセイ試薬を調製します。
    1. 36 mgのプロベネシドを微量遠心チューブに添加し、0.6 M NaOH(500 μL)に溶解して、プロベネシド溶液(250 mM、水溶液)を調製します。解決策をボルテックスします。
      注:プロベネシドは、有機イオントランスポーター75,76,77を阻害することにより、細胞内の色素の保持を改善する。
    2. HBSS-HEPESアッセイバッファーを作製するには、Ca/Mg/フェノールレッドフリーHBSSの500 mLボトルにHEPES(1.19 g)を加えます(HEPESの10 mM溶液を作製します)。バッファーにMgCl2(1 M水溶液、500 μL)およびCaCl2(1 M水溶液、500 μL)を添加します。溶液を混合し、使用しないときは5°Cの冷蔵庫で保存してください。
      1. 96ウェルプレートごとに、50 mLの HBSS-HEPESアッセイバッファー を50 mLの遠心チューブに加え、500 μLのプロベネシド溶液を添加してよく混合します。使用前にバッファーを室温まで温めてください。
    3. 微量遠心チューブまたはHPLCバイアルにPluronic F-127(20 mg)を加え、200 μLのDMSOで溶解することにより、DMSO中の10%プルロニックF-127溶液を作製します。
      注:この溶液は室温で保存でき、約30枚のプレートに十分です。プルロニックF-127は室温で非常にゆっくりと溶解するため、溶解を促進するために穏やかに加熱する必要があります。
    4. まず、24 μLのDMSOをFluo-4/AM(50 μg)のバイアルに加えて色素を溶解し、 色素ローディングバッファー を調製します。ホイルで包んだ15 mLの遠心分離チューブに、6 mLの HBSS-HEPESアッセイバッファー を加え、6 μLの10% Pluronic F-127と6 μLのFluo-4/AM溶液を補充します。溶液を短時間ボルテックスし、室温で光を避けて10分間放置します。
      注:Fluo-4の光退色を防ぐために、色素溶液を含む遠心分離管とアッセイプレートの蓋にアルミホイルを巻き付けて、染料を光から遠ざけてください。
  2. アッセイプレートを調製します。
    1. アッセイプレートをインキュベーターから取り外し、倒立顕微鏡を使用してコンフルエントを確認します。DMEMコンプリートメディアを手動で取り外すには、シンクにフリックし、プレートの上部をペーパータオルで吸い取ります。
      注意: プレートを水平に保持してはじき、続いてプレートを180°回転させて繰り返すことにより、媒体が十分に除去されます。
    2. HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液を50 mLマルチチャンネルピペット溶媒リザーバーに加えます。
      注:この溶液は後の洗浄手順に使用されるため、必要になるまで脇に置いてアルミホイルで覆う必要があります。
    3. マルチチャンネルピペットで各ウェルに HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液 100 μLを加え、細胞をプロベネシドの存在下に5分間放置します。ステップ3.2.1と同じ方法でシンクにフリックして、HBSS-HEPESアッセイバッファーを取り出します。
    4. 別の50 mLマルチチャンネルピペット溶媒リザーバーに 色素ローディングバッファー を添加します。マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに50 μLの 色素ローディングバッファー を添加します。プレートを45分間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
    5. プレートがインキュベーター内にある間に、アゴニスト/アンタゴニスト溶液を調製します。
      1. アンタゴニスト溶液は、31.6 mM溶液としてDMSOに保存されます。PCRチューブで、2 μLのストック溶液を38 μLの0.1% BSA/水で希釈し、1.58 mM溶液を得ます。この溶液を2 μL使用すると、アッセイプレートの最終濃度は31.6 μMになります。1.58 mMアンタゴニスト溶液4 μLを5% DMSO/水(BSA添加なし)36 μLで希釈し、残りの濃度を段階希釈して調製します。
      2. HBSS-HEPESアッセイバッファーにTFLLRN-NH2の108.3 μM(16.7x)溶液を調製すると、アッセイプレートの各ウェルに6 μLを添加すると、最終濃度は6.5 μMになります。例えば、2 mg アリコートの TFLLRN-NH2 を 5.244 mL の HBSS-HEPES アッセイバッファーに溶解して、0.5 mM のストック溶液を得ます。この溶液1.083 mLを3.917 mLのHBSS-HEPESアッセイバッファーと混合して、108.3 μM溶液を得ます。
        注:TFLLRN-NH2 溶液は、使用しないときは-20°Cの冷凍庫で保存する必要があります。
    6. インキュベーターからプレートを取り出し、適切な環境で蛍光顕微鏡を使用して色素の取り込みを確認します(通常、緑色蛍光タンパク質の場合、細胞に正常にロードされたFluo-4の例については 図1 を参照してください)。ステップ3.2.1と同じ方法でプレートをフリックして、染料ローディングバッファーを取り出します。
    7. 各ウェルで50 μLの HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液 (ステップ3.2.3から)で細胞を2回洗浄します(培地をシンクにフリックして除去します)。
    8. 各ウェルに92 μLのHBSS-HEPESアッセイバッファーを添加し、再度蛍光顕微鏡で細胞を観察して、余分な色素が完全に除去され、細胞が接着したままであることを確認します。
    9. マルチチャンネルピペットを使用して、2 μLのアンタゴニスト溶液とビヒクルを適切なウェルに添加します(代表的なプレートマップについては 表1 を参照)。

4. カルシウム動員アッセイの実施

  1. プレートリーダーを次のように設定します:温度:37°C;励起波長:485 nm;発光波長:525nm;測定高さ:7.8 mm(最適化);フラッシュの数:100;繰り返し回数:20回。
  2. プレートリーダーでプレートを37°Cで15分間インキュベートします。 カラム 1 および 2 のバックグラウンド蛍光を測定します(ウェルあたり 5 回のスキャン)。
  3. プレートリーダーからプレートを取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して、8チューブPCRストリップのカラム1および2の各ウェルに6 μLのアゴニスト溶液を迅速に加えます。
    注:このステップでは、0.1〜10μLのピペットチップを備えた電動8チャンネルピペットを使用します。
  4. 細胞内でカルシウムの動員が起こるときの蛍光の変化を測定します。上記の設定に従って、各ウェルのスキャンを20回実行します。
    注:各ウェルを2列ずつ20回ずつスキャンするには、約5分かかります(つまり、各ウェルのスキャン間は~15秒)。
  5. 列 3 から 12 に対して、手順 4.2 から 4.4 を 2 列ずつ繰り返します。

5. データ分析

  1. アッセイからデータを 2 列グループごとに個別のスプレッドシートとしてエクスポートします。
  2. 機能 AVG(first scan:last scan)を使用して、基礎蛍光測定値の平均を求めます。これは、両方の列のすべてのウェルに対して行います。
  3. アゴニスト添加後の最大蛍光は、 MAX(First scan:Last Scan)機能を用いて求めます。
  4. 最大蛍光から基礎蛍光を差し引いて、蛍光の変化を計算します。
  5. ネガティブコントロール(アゴニストを含まないビヒクルの追加)について計算された蛍光の変化を、同じカラムの各ウェルから差し引きます。
  6. 蛍光の相対的な(正規化された)変化を求めるには、各ウェルの蛍光の変化をビヒクル内の蛍光の変化(0.1% DMSO/水)+ 6.5 μM TFLLRN-NH2 ウェルで割ります。
  7. 非制御値をパーセンテージとして、統計およびグラフ作成ソフトウェアプログラムにコピーします。参照されているソフトウェアを使用している場合は、XYテーブルオプションを選択し、数値をX軸として選択し、サイドバイサイドのサブカラムの値をY軸として複製します。
  8. このプログラムを使用して、データから濃度反応曲線(CRC)をプロットします。参照されているソフトウェアを使用する場合は、 log(inhibitor) vs. response - Variable slope (4 つのパラメーター) オプションを選択します。

結果

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このアッセイの目的は、一般に、3〜4個の新しいパルモジュリンの濃度反応曲線(CRC)を作成することです。各アッセイプレートでは、既知の化合物、例えばNRD-21に対する追加のCRCがしばしば生成され、既知のIC50により実験の品質チェックとして機能します。CRCを生成するには、 表1 に示されているようなプレートマップを計画する必要があります。代わりにシングルポイント濃度レスポンスが必要な場合は、10 μMの最終濃度(または他の好ましい濃度)の化合物を少なくとも3つのウェルに添加する必要があります。

アッセイを実施する際には、プレートリーダーに表示される蛍光が急速に増加する必要があります(増加は最初の3〜4回のスキャンで開始されます)必要があります(図2Bの失敗した出力と比較した出力例については、図2Aを参照してください)。アゴニストは、プレートリーダーが蛍光の増加を正確に捕捉できるようにするために、迅速に(15秒以内に)追加する必要があることに注意することが重要です。実際の実験では、ビヒクルウェルの蛍光シグナルは平坦なままであるべきですが、ポジティブコントロールウェル(ビヒクル + 6.5 μM TFLLRN-NH2)の蛍光シグナルは、3 回または 4 回のスキャン後に増加し始めるはずです。最大値に達すると(~10回のスキャン後)、蛍光シグナルはゆっくりと減少し始めるはずです。非常に効果的なアンタゴニストを用いた実験では、アンタゴニストの濃度が最も高いウェルは、ネガティブコントロールと同様に、比較的平坦なシグナルを持つ必要があります。また、ポジティブコントロールウェルのシグナルとアンタゴニストの濃度が低いウェルのシグナルとの間には、ほとんど差がないはずです(図2C)。最も低い濃度の ?? 抗薬がまだカルシウム動員を阻害している場合は、スクリーニングされた濃度を調整して低濃度を含める必要があります。.生成された CRC は、曲線のシグモイドの性質を完全に示すために、少なくとも 1 つのデータ ポイントを ~100% 持つ必要があります。

実験がうまくいかなかった最も一般的な兆候は、ポジティブコントロールウェル(ビヒクル + 6.5 μM TFLLRN-NH2)で蛍光の大幅な増加が見られない場合です(図 2B)。これには、細胞数が少ない(コンフルエント性が確認されていない場合)、アゴニスト溶液が損なわれている、細胞に取り込まれた色素の量が不十分であるなど、さまざまな理由が考えられます。また、誤って特定のウェルにアゴニストを添加しないことも可能です。

プログラム方式では、データは 6 つの別々のスプレッドシートとして出力され、それぞれに 2 つの列のデータが含まれます。基礎蛍光の5回のスキャンはそれぞれの行にあり、すぐ下の行にアゴニストを添加した後に取得された20回のスキャンがあります(代表的な出力については 図3 を参照)。計算の例として、NRD-21を使用した実験の列を使用します。エクスポートされたファイル(図3)では、各ウェルからの基礎蛍光が列CからGに出力され、アゴニスト添加後(次の20スキャン)のデータが次の行の列CからVに出力されます。ファイルの行 14 から 17 には、2 つの別々の列のポジティブ コントロールが含まれています。ポジティブコントロールウェルの1つの基底列の平均は、コマンド「=AVERAGE(C16:G16)」を使用して計算され、1,039.8の値が得られました。このコマンドは、各ウェルの追加の基礎測定に対して繰り返されました。実験スキャンの最大値は、コマンド「=MAX(C16:V16)」を使用して計算され、値は2,629でした。ここでも、すべての井戸に対してコマンドが繰り返されました。次に、各ウェルの基礎蛍光を最大値から差し引きました。この実験では、各ウェルのネガティブコントロールの蛍光の変化を差し引くことでデータを正規化しました(例の列では142.6)。次に、これらの値を、同様に計算されたポジティブコントロールの値で除算しました。この列では、最大値は 2,629、平均基礎測定値は 1,039.8、ブランクから減算された値は 142.6 でした。したがって、調整された正の制御値は 1,446.6 です (式から計算)。この式をカラム内の各ウェルで繰り返し、計算値を1,446.6で割って、蛍光の相対的な変化を求めます。その後、比率はパーセンテージに変換され、分析ソフトウェアにコピーされました。このプロセスは、他の 11 列に対しても繰り返されました。

参照されたソフトウェアを使用してデータを処理するには、XYテーブルを選択し、列を並べて3回繰り返し測定するオプションを選択する必要があります。各濃度の -log 値を x 値に入力し、計算されたパーセンテージを y 値に追加する必要があります。データに対して非線形回帰分析を実行すると、4つの濃度-応答曲線が生成されます。このプログラムは、IC50 値、定量化されたエラー統計、および適合度統計も出力します。

figure-results-1
図1:EA.hy926セルにロードされたFluo-4 / AM。 Fluo-4は、色素のインキュベーションおよび洗浄ステップ後にEA.hy926細胞に選択的にロードしました。すべての蛍光は細胞内にあり、色素の漏れはありません。EVOSセルイメージャのGTP設定と20倍の倍率を使用して取得した画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:アッセイの潜在的な出力 (A)作業用アッセイの代表的なプレートリーダーの出力。行Aはネガティブコントロールであり、蛍光に変化はありません。行Bはポジティブコントロールであり、蛍光の急速な増加を示しています。行C-Hは実験用ウェルで、高濃度のパルモジュリンはプレートの下位にあります。(B)失敗した実験の出力例。陽性対照であるB列では蛍光の増加は見られません。(C)PAR1アゴニストTFLLRN-NH2によって誘発される蛍光の経時変化。付属の設定を使用して 96 ウェルプレートの 2 カラムをスキャンするには、PerkinElmer EnSpire プレートリーダーで ~5 分かかります (つまり、各ウェルのスキャン間には ~15 秒かかります)。NRD-21溶液は示されている通りで、「アゴニスト」は6.5μM TFLLRN-NH2、n = 1です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:作業アッセイのExcel出力例。 基礎蛍光は、行10から偶数番号の行に出力され、アゴニスト添加後の最初の10回のスキャンの結果は、後続の奇数番号の行に出力されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:ロボットによる液体処理と「フリック 」の比較アッセイプレートをゼラチンでプレコーティングし、プレートをフリックしてブロッティング乾燥させることにより、手動で培地交換を行うと、ばらつきの少ない濃度反応曲線が得られます。(A)パルモジュリンML161およびNRD-21および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(自動液体処理)の濃度-反応曲線。(B)パルモジュリンML161およびNRD-21および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(ゼラチンコーティング、フリックプレート)の濃度反応曲線。データはSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:温度スタディ。 37°Cでアッセイを実行すると、室温よりも再現性の高いデータが得られます。(A)ML161および5 μM TFLLRN-NH2、n = 3(室温)の濃度-反応曲線。(B)ML161および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(37°C)の濃度-応答曲線。データはSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:細胞密度の研究。 最適な細胞密度は、アッセイ開始の16〜24時間前に播種した場合、60,000細胞/ウェルです。(A)異なる細胞密度でのTFLLRN-NH2 の濃度-反応曲線、n = 3。(B)最適細胞密度60,000細胞/ウェルでのTFLLRN-NH2 の濃度-応答曲線。データはSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:アッセイ量。 (A) ML161 および 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μL 最終容量) の濃度反応曲線は、100 μL のアッセイ容量を使用します。(B)ML161および5 μM TFLLRN-NH2、n = 3(100 μL最終容量)の濃度-反応曲線。データはSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:ヒット化合物を検出するアッセイの能力を決定するためのZ'因子の生成。 6.5 μM TFLLRN-NH2 (カラム B) とオプションの PAR1 アンタゴニスト 10 μM NRD-21 (カラム C) または 0.316 μM vorapaxar (カラム D) によるカルシウム動員反応。(A)アッセイは細胞播種後16時間で完了しました。(B)細胞播種後24時間でアッセイを完了。(C)次の式を使用して計算されたZ'係数の表: figure-results-9、ここで、σp はポジティブコントロールの標準偏差、σ n はネガティブコントロールまたはサンプルの標準偏差、μp はポジティブコントロールの平均、μn はネガティブコントロールまたはサンプルの平均です。各値は、車両 + 6.5 μM TFLLRN-NH2 をポジティブ コントロールとして指定し、示された条件をネガティブ コントロール (ビヒクル) またはサンプル (NRD-21 および vorapaxar) として比較することによって計算されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:PAR2アゴニストによるカルシウム動員。 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4によって誘発される蛍光の経時変化。データはSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:化合物スクリーニング用の96ウェルプレートマップの例。 各濃度は3倍で測定されます。行 A にはネガティブ コントロール (拮抗薬なし、アゴニストなし) が含まれ、行 B にはポジティブ コントロール (アンタゴニストなし、アゴニスト) が含まれます。カラム 1 から 3 には、オプションで品質管理に使用できるパルモジュリン NRD-21 の 6 つのハーフログ濃度が含まれています。PM-A、PM-B、PM-Cは無名のパルモジュリンです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:以前に公開されたプロトコルと新しく最適化されたプロトコルの比較。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前に報告されたプロトコル72は一般的に信頼性が高く、新しいリードパルモジュリンであるNRD-21,62を特定することができましたが、より効率的なプロトコルが望まれていました。このアッセイは、COVID-19のパンデミックによって引き起こされた供給不足の間にさらに損なわれました。自動リキッドハンドラーのチップを入手するのが難しくなり、チップの洗浄、滅菌、再利用を試みると、CRCに大きなばらつきが出ました。これにより、改良されたPAR駆動型カルシウム動員アッセイを合理化するために設計された緊急の一連の実験が容易になりました。

この研究では、洗浄ステップに自動リキッドハンドラーを使用する有効な代替手段を特定することが最優先事項でした。以前のアッセイ開発では、ロボットリキッドハンドラーを使用することで、手動の培地交換によるエラーが減少していました。しかし、8チャンネルリキッドハンドラーとの培地交換により、各アッセイプレートの合計時間が30〜45分増加したため、アッセイにかなりの時間が追加されました。培地交換の「フリック」法は以前に試みられていましたが、これらの実験は、細胞播種前にアッセイプレートをゼラチンでコーティングせずに行われました。プレートをゼラチンで前処理することにより、手動で培地を除去するために使用される力に関係なく、細胞が所定の位置に留まるようにしました。ゼラチンコーティングされたフリックプレートを使用したアッセイで生成された CRC は、自動リキッドハンドラーを使用した曲線よりも適合度スコアが高く、複数のデータポイントでのエラーバーが小さかった(図 4)。自動リキッドハンドラーを使用したプレートの二乗平均平方根誤差(RMSE)値は、ML161曲線で9.687、NRD-21曲線で10.690でしたが、ゼラチンと手動培地交換を使用したプレートのRMSE値は、ML161曲線で7.658、NRD-21曲線で6.408でした。RMSE 値が小さいほど、特定のデータにより適合する曲線を示します。この変更により、合計アッセイ時間も大幅に短縮されます。あるいは、マルチチャンネル自動プレートワッシャーを使用することもできます。

アゴニスト添加の方法は、研究された追加の要因でした。これは、アゴニストをすべてのプレートウェルに同時に追加し、その後にプレート全体を一度にスキャンできるかどうかを決定するために行われました。これにより、研究者は、多数の個別のアゴニスト添加のための時間的センシティブアッセイの期間中、プレートリーダーの近くに留まる必要がなくなり、スループットを大幅に向上させることができます。残念ながら、すべてのウェルにアゴニストを添加し、プレート全体をスキャンすることは問題でした。なぜなら、応答が速すぎてすべてのウェルの一時的な最大カルシウム濃度を確実に測定できないため、CRCは非常に変動しやすいものでした。スキャンするカラムの数を12から6に減らすと、結果はわずかに改善されましたが、最良の結果は一度に2つのカラム(16ウェル)のみをスキャンすることで得られました。アッセイの温度を37°Cから室温に下げると、カルシウム濃度の変化が十分に遅くなり、信頼性の高い測定が可能になるという仮説を立てることができます。異なる色素または細胞株を用いた複数のカルシウム動員プロトコルが室温78,79で検証されていますが、この特定のアッセイでは、37°Cで改善された結果が観察されています。 室温(~23°C)で測定されたアンタゴニスト濃度反応曲線は、37°Cでの測定ほど均一ではありませんでした(図5A対図5B)。これらの結果から、37°Cで一度に2本のカラムを走査するのが最適であると判断されました。

アッセイ時間を短縮するために精査された別の変数は、アンタゴニストのインキュベーション時間でした。前のプロトコルでは、アンタゴニストはアゴニスト添加前に40分間インキュベートされていましたが、ここでは、パルモジュリンがPAR1と相互作用するのに十分な時間が15分であると判断されました。これは、パルモジュリン溶液を複数のカラムに同時に添加し、その後、異なる時点でアゴニストを添加することによって試験しました(アゴニストは t = 15 分、30 分、および 45 分で添加されました)。パルモジュリンの活性は保持されましたが、アンタゴニストをより長くインキュベートすることによって改善されませんでした。この知見の結果として、新しいプロトコルでは、アンタゴニスト溶液を一度に全プレートに添加し、15分間のインキュベーション後にアゴニスト溶液を最初のカラムに添加する。この変更により、合計実験時間がさらに 30 分短縮されます。vorapaxarのような遅い結合速度を持つアンタゴニストは、より長いインキュベーション時間を必要とする場合があることに留意すべきである80,81。

アッセイ時間を短縮し、リキッドハンドラーへの依存を排除することが、アッセイプロトコルの更新を必要とする主な要因でしたが、代替の細胞培養方法もテストされました。以前は、プレートに凍結ストックから直接細胞を播種し、播種後40〜48時間プレート内で成長させていました。しかし、プレートの播種からアッセイの実施までの時間が長くなると、毎週実行できる実験の数が制限されていました。培養フラスコで増殖させた細胞を使用すると、この時間が大幅に短縮されます。細胞は、組織培養処理されたT-75フラスコで増殖させ、非酵素的細胞解離剤を使用してフラスコ表面から除去しました。これは、特定の細胞表面受容体、特にPAR2をトリプシンで損傷するのを避けるために重要かもしれません。アッセイプレートに添加すると、細胞が沈殿してゼラチンに付着するまでに十分な時間が必要です。フリック法による培地除去は細胞を置換することもあるため、細胞がゼラチンに埋め込まれるまでに十分な時間が必要です。細胞を2時間沈静させる実験では、細胞が著しく失われ、アッセイが使用不能になりました(データは示されていません)。2時間から12時間の定常時間は、1日に分析できるプレートの数を制限するため、より長い一晩のインキュベーションが望ましいです。新たに培養した細胞を16時間から24時間の間にインキュベートすると、細胞がゼラチンに完全に付着し、再現性のあるデータが得られることがわかりました。

凍結細胞から培養フラスコ成長細胞に変更すると、最適な細胞播種密度も変わりました。予想通り、以前のプロトコルで標準的であった25,000細胞/ウェル密度でウェルを播種すると、細胞はより短いインキュベーション時間でコンフルエントに達することができませんでした。アゴニストCRCは、最適な条件を決定するために、8つの異なる細胞密度で生成されました(図6)。以前は、TFLLRN-NH2 を 5 μM の PAR1 アゴニストとして使用していましたが、これは、溶解度の低いパルモジュリンとの合理的なアンタゴニズムを可能にしたためです。45,000-65,000細胞/ウェルで播種した場合、バックグラウンドシグナルまたは最大シグナルに大きな差はありませんが、60,000細胞/ウェルを添加した場合、5 μM TFLLRN-NH2ではばらつきが減少します。興味深いことに、細胞数が多くても最大蛍光は有意に増加しないため、変動性が減少するため、60,000細胞/ウェルが最適な密度として選択されました。アゴニスト CRC は、TFLLRN-NH2 に対して EC50 が 6.5 μM も生成したため、これが新しい標準アゴニスト濃度として選択されました。

分析された別の要因は、アッセイに使用された量でした。前のプロトコルでは、2 μL のアゴニストを各ウェルに添加して、最終アッセイ容量を 200 μL にしました。アゴニスト溶液を大量に添加し、最終濃度を一定に保つことで、混合が促進され、より迅速で信頼性の高いシグナルが得られるという仮説が立てられました。この仮説を検証するために、異なる濃度のNRD-21を含むアッセイプレートで、2 μL、6 μL、および 10 μL の TFLLRN-NH2 を 100 μL または 200 μL の HEPES-HBSS に添加して比較しました。各条件からのNRD-21のCRCを生成して、アゴニスト容量と最終アッセイ容量のどの組み合わせが最も一貫性のあるデータを提供したかを決定しました。2 μL と 6 μL の添加の両方で、ばらつきがほとんどない CRC が生成されましたが、10 μL の TFLLRN-NH2 の添加による曲線については同じことは言えませんでした (データは示していません)。蛍光の増加は、これらのウェルでは大きさもタイミングも一貫していなかったため、同一であるはずのCRCが生成されましたが、実際には大幅に異なります。2 μL と 6 μL を添加しても同様の結果が得られましたが、6 μL の TFLLRN-NH2 を添加すると蛍光の変化がはるかに速くなり、各ウェルのスキャン数を 40 スキャンから 20 スキャンに半分に減らすことができました。また、最終容量100 μLを使用すると、最終容量が200 μLの場合と比較して、より均一なCRCが生成されることも決定されました(図7)。

新しいプロトコルがハイスループットアッセイに適しているかどうかを判断するために、アッセイのZ'係数を計算しました(図8)。Z'因子は、スクリーニングアッセイの品質を測定する統計的方法であり、アッセイが活性化合物と不活性化合物82を確実に区別するかどうかを決定する。Z'因子は、プレートの播種後16時間から24時間の間に、および異なる細胞継代で実施されたアッセイについて計算されました。すべての場合において、アゴニストのみおよびアゴニストとアンタゴニストの併用モードの両方において、計算されたZ'因子は0.5より大きく、優れたアッセイ82を示している。計算されたZ'係数も、前のアッセイで計算されたものと類似しており、より高速なアッセイを生成するためにプロトコルに加えられた変更が品質に悪影響を及ぼさなかったことを示しています。

PARによるカルシウム動員のプロトコルは、CRCからIC50 値を生成する実験を通じて更新されましたが、このアッセイは、単一濃度でのPAR1アンタゴニストの有効性を測定するためにも使用できます。このアッセイは、PAR2リガンドの活性を測定するためにも使用できます。例えば、PAR2アゴニストSLIGKV-NH2 は、更新されたプロトコルでTFLLRN-NH2 を置き換えることができます(図9)。以前のプロトコルは、PAR2アゴニストおよびアンタゴニスト83でも使用された。ここでは明示的にテストされていませんが、このプロトコルは、前のプロトコルで使用されたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)や、潜在的に他の接着細胞株にも適用できるはずです。このようなプロトコルでスキャニングプレートリーダーを使用する場合の制限は、少なくともプレートイメージャーで可能な並列での高速(サブセカンド)応答の研究には適していないことです。

結論として、プレートリーダーを使用した内皮PAR駆動カルシウム動員アッセイの迅速でシンプルなプロトコルをここで報告しています。自動化されたリキッドハンドラーの必要性を排除し、アンタゴニストのインキュベーション時間を短縮し、各ウェルのスキャン数を減らすことにより、合計アッセイ時間が少なくとも90〜120分短縮され、アッセイコストが削減されました(以前に報告されたプロトコルと現在のプロトコルとの比較については、 表2を参照)。これにより、毎日より多くの化合物をスクリーニングできるだけでなく、色素の流出によるアッセイウィンドウが減少するリスクも排除され、信頼性の低い結果につながる可能性があります。新たに最適化されたアッセイにより、プレートリーダーの使用に限定されたラボで、PAR1またはPAR2リガンド、または細胞内カルシウム動員を活性化する可能性のある他のGPCRリガンドの内皮細胞でのスクリーニングを迅速に行うことができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D.は、パルモジュリンに関する特許の発明者であり、臨床用パルモジュリンを開発しているFunction Therapeutics, Inc.の創設者であり、株主でもあります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトにスペースを提供し、間接的に支援してくださったIrene Hernandez氏、Trudy Holyst氏、Hartmut Weiler博士(Versiti Blood Research Institute)、Leggy Arnold博士(ウィスコンシン大学ミルウォーキー校)、および適切なアドバイスを提供してくださったJohn McCorvy博士(ウィスコンシン医科大学)に感謝します。National Heart, Lung, and Blood Institute(R15HL127636)、U.S. Dept. of Defense(W81XWH22101)、National Science Foundation(2223225)の助成金支援に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養試薬
接着性EA.hy926細胞ATCCCRL-2922
CellStripper細胞解離試薬Corning25-056-CIトリプシンはオプションで使用することができますが、PAR2アッセイでは絶対に避けるべきです。
Dulbeccoの変更されたイーグル媒体(DMEM)w/フェノールレッドコーニング10-013-CV
の胎児のウシの血清(FBS)アバントール97068-091
ブタの皮からのゼラチンMilliporeSigmaG2500脱イオン水と水0.4%(w / v)の溶液を作るために使用します。滅菌するために使用前にオートクレーブ。
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
strong>Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
ウシ血清アルブミン(BSA)Avantor97061-420
塩化カルシウム二水和物Thermo42352-0250
ジメチルスルホキシドThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
ハンク平衡塩溶液(Ca/Mg/フェノールレッドフリー)コーニング21-022-CV
塩化マグネシウム六水和物ミリポアシグマM2393
プルロニックF-127(ポロキサマー407)スペクトラムケミカルP1166
プロベネシドTCIアメリカP1975
酸化ナトリウムVWRインターナショナルBDH9292
TFLLRN-NH<サブ>2(TFA塩)Versiti血液でTrudy Holystによって調製Research Institute
Materials
96-well培養処理、黒壁、透明底アッセイプレートCorning3603透明蓋付き
遠心チューブ、15 mLAvantor89039-664
遠心チューブ、50 mLAvantor89039-656
培養フラスコ、T-75Corning353136組織培養処理
使い捨て試薬リザーバー、50 mLコーニングRES-V-50-S
エンスパイアプレートリーダーパーキン・エルマー製造中止
微量遠心チューブ、1.5 mLアバンター20170-038
パスツールピペット、9インチフィッシャー13-678-6B滅菌済み
PCRチューブストリップは、独立したフラットで滅菌する必要がありますキャップストリップAvantor76318-802
ペットチップ、20µLBiotix63300042滅菌済み、ろ過済みチップ
ピペットチップ、200 & マイクロ;LBiotix63300044滅菌済み、ろ過済みチップ
ピペットチップ、1250 µLBiotix63300047滅菌済み、ろ過されたチップ
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
セロロジカルピペット 10 mLトレードウィンズ ダイレクト 07-5010
セロロジカルピペット 25 mLTradewinds Direct 07-5025
<水済み ピ

参考文献

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PAR1 Fluo 4 Gq 96

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