ここでは、新鮮なメラノーマ組織から解離細胞懸濁液を培養することにより、メラノーマ患者由来のオルガノイドを生成するプロトコルを紹介します。これらのオルガノイドは 、in vitro で患者特異的な腫瘍を忠実に再現し、腫瘍免疫抑制メカニズム、薬物スクリーニング、薬剤耐性メカニズム、およびがんサーベイランスアプローチを探索するための革新的なアプローチを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
免疫療法の発展に伴い、天然腫瘍の腫瘍微小環境を再現できるモデルの開発が継続的に必要とされています。従来の2次元モデルや3次元モデルでは、がんの発生と進行に関する洞察を得ることができますが、これらには、天然腫瘍の忠実な模倣を妨げる重要な側面が欠けています。多くの注目を集めている代替モデルは、患者由来のオルガノイドです。これらのオルガノイドの発達は、複雑な細胞間コミュニケーション、腫瘍微小環境、および腫瘍の組織構造を再現しています。この論文では、黒色腫患者由来オルガノイド(MPDO)モデルを確立するためのプロトコルについて説明します。これらのモデルを検証するために、T細胞活性化マーカーの発現レベルを含む免疫細胞の組成を評価し、オルガノイドの細胞の不均一性を確認しました。さらに、細胞治療におけるMPDOの潜在的な有用性を説明するために、オルガノイドをγδT細胞で処理することの細胞毒性能を評価しました。結論として、MPDOモデルは、腫瘍の複雑さを理解し、治療戦略を検証し、個別化治療を進める可能性のある有望な手段を提供します。
概要
従来の2次元細胞培養モデルは、がん研究においてがんの進行や治療を研究するために不可欠なツールです1。これらのモデルは、がんの発生と進行の根底にある分子的および細胞的メカニズムを調査するための制御された実験条件を可能にするだけでなく、費用対効果が高く、比較的迅速な実験結果を提供します。しかし、腫瘍微小環境(TME)の細胞多様性が限られているため、その使用は制限されており、単一培養モデル2の同一平面上の性質では再現できません。さらに、細胞培養モデルは、人体と比較して過度に単純化された環境を提供します3。したがって、がんの進行をよりよく理解し、効果的な治療法を開発するために、研究者は自然界のTMEを密接に再現することを目的とした革新的なモデルに目を向けました。したがって、これらのモデルでは、天然腫瘍への忠実度を維持することが最も重要です。がんの複雑な性質を考えると、元の腫瘍からの大幅な逸脱は、腫瘍の挙動に関する有意義な結論を混乱させる可能性のある予期しない変数をもたらす可能性があります。
患者由来異種移植片(PDX)は、in vivoでの腫瘍進行のモニタリングを可能にするモデルシステムとして浮上していますが、いくつかの制限は、開発された腫瘍がヒトのがん生....
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プロトコル
ヒト黒色腫組織は、ペンシルベニア大学の治験審査委員会によって承認された組織収集プロトコル(UPCC08607)を使用して、ペンシルベニア大学で治療を受けている患者から採取されました。すべての患者はインフォームドコンセントに署名しています。ヒト黒色腫組織の切除後、腫瘍組織をダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)に入れ、処理まで4°Cに保ちます(6時間以内)。黒色腫患者由来オルガノイド(MPDO)は、 図1に示すように新鮮な腫瘍に由来しました。
1. ヒト黒色腫組織からの細胞の単離
- 手続き開始前の準備
注:2つの培養方法(マトリゲルゲルとコラーゲンゲル)を使用して、解離したメラノーマ組織を培養できます。- マトリゲル法の場合: Growth Factor Reduction(GFR)Basement Membrane Matrixのコーティング溶液を、GFR Basement Membrane Matrixをオルガノイド培養培地( 表1参照)で1:2の比率で希釈します。解凍した溶液を48ウェルプレートの複数のウェルのそれぞれに約115 μL加え、加湿インキュベーター内で37°Cで30分間固化させます。 ....
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結果
MPDOの形状とサイズを経時的に監視し、その成長ダイナミクスを研究しました。 図2に見られるように、初期の増殖期には、図示の7日間を通じてオルガノイドのサイズが大幅に増加しました。MPDOの増殖動態の観察に続いて、オルガノイドが元の腫瘍に忠実に再現されることを確認するために、免疫細胞組成の評価に注目が集まりました。この評価は、主にαβT細胞の存在量に焦点を当てており、オルガノイドと親腫瘍との類似性についての洞察を提供しました。図 3 は、親の腫瘍とマトリゲルまたはコラーゲンで培養したオルガノイドとの間にαβT細胞の割合に統計的に有意な差がなかったことを示しています。親腫瘍とオルガノイドとの類似性を示した上で、次にフローサイトメトリーを用いてT細胞の活性を評価した。ゲーティング戦略は図4に見出すことができ、図 4は、単一の生きた白血球を定義した後、CD3+ およびCD8+ T細胞集団をゲーティングして一般的なT細胞活性.......
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ディスカッション
PDO の出現により、以前に確立された他のがん研究方法によってもたらされた複数の制限に対処しながら、この分野での変革的な潜在的なアプリケーションを導入しました。このオルガノイド技術は、2009年にHans Cleversらによって最初に提案され、マウスの腸に由来するLgr5+ 幹細胞をR-スポンシン、EGF、およびNoggin因子を含む3Dマトリックスゲルで培養することにより、腸管オルガノイド培養システムを確立することに成功しました20。数年後の2020年、ケーラー氏のチームは、ヒトPSCのみを使用して 初めてin vitro で皮膚を作製することを可能にしたオルガノイド培養モデルを報告しました21。オルガノイド技術のこれらの目覚ましい進歩に照らして、腫瘍オルガノイドモデルの開発が急速に出現し、がん研究と医薬品開発に革命を起こす可能性を秘めています。
したがって、このプロトコルは、.......
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開示事項
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
謝辞
この研究は、R01(CA258113)、SPORE(CA261608)、およびP01(CA114046)からの助成金によって部分的に資金提供されました。 図1 は BioRender.com で作成しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2 mL レッド キャップ 雌ネジ ポリプロピレン 極低温バイアル | コーニング | 431420 | |
| 50 mL ポリプロピレン コニカル チューブ | コーニング | 352070 | |
| 100 mm TC 処理細胞培養ディッシュ | コーニング | 353003 | |
| 105 mm ポリスチレン鉗子滅菌カテーテル | エバーグリーン | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 細胞培養フラスコ | Corning | CLS430825 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human Perforin 抗体 | BioLegend | 308120 | |
| ブリリアントバイオレット 605 抗ヒト Ki-67 抗体 | バイオレジェンド | 350522 | |
| ブリリアントバイオレット 650 抗ヒト CD366 (Tim-3) 抗体 | バイオレジェンド | 345028 | |
| ブリリアントバイオレット 711 抗ヒト CD45 抗体 | バイオレジェンド | 304050 | |
| 細胞培養インサート 0.4 & マイクロ;m、直径30 mm | ミリポアシグマ | PIHP03050 | |
| 細胞染色 | バッファーBioLegend | 420201 | |
| 細胞ストレーナー40 µm ナイロン | コーニング | 352340 | |
| セルストレーナー70µm ナイロン | コーニング | 352350 | |
| コラゲナーゼ、IV型、粉末 | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex ラットコラーゲン I | トレビゲン | 3440-100-01 | |
| 培養プレート、PS、48ウェル、TC蓋付き処理、滅菌済み | Max Scientific | 07-6048 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - 高グルコース 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnase I - グレード II | ミリポア シグマ | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| ウシ胎児血清、FBS | Corning | MT35-010-CV | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | ||
| Forskolin | Tocris | 1099 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| ハイグロマイシン B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel Phenol Free &成長の事実。Reduced | Corning | 356231 | |
| Millex PVDF シリンジフィルター、0.22 μM | ミリポア Σ | SLGVR33RB | |
| N-アセチルシステイン | Σ-Aldrich | A9165-5G | |
| ニコチンアミド | Σ-Aldrich | N0636-100G | |
| Nunc TripleFlask 処理細胞培養フラスコ | ThermoFisher | 132867 | |
| PE/Cyanine5 抗ヒト CD8a 抗体 | BioLegend | 301010 | |
| PE-Cy 7 マウス 抗ヒトCD279 (PD-1) | BDバイオサイエンス | ||
| ペン連鎖球菌 | Gibco | 15140-122 | |
| 組換えヒト EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
| 組換えヒト FGF 酸性 | Peprotech | 100-17A | |
| 重炭酸ナトリウム溶液 (NaHCO3) (7.5%) | 品質 生物学的 | 118-085-721 | |
| ステンレス製外科用ブレード No. 22 | インテグラ | 4-322 | |
| TrypLE Express | ギブコ | 12604-021 |
参考文献
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).
- Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor ....
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再版と許可
