熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

サマリー

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756 細胞は、天然の機能障害Hsp70を保有し、熱ストレスの影響を受けやすいため、アッセイのモデルとなります。機能的なHsp70の異種導入は、細胞の成長欠乏を救います。

要約

ヒートショックプロテイン70(Hsp70)は、細胞内の他のタンパク質のフォールディングを促進する保存されたタンパク質であり、分子シャペロンになります。Hsp70は、通常の条件下で増殖する 大腸菌 細胞には必須ではありませんが、高温での増殖にはこのシャペロンが不可欠です。Hsp70は高度に保存されているため、様々な種の Hsp70遺伝子のシャペロン機能を研究する1つの方法は、Hsp70が欠損している大腸菌株または機能的に損なわれた天然のHsp70を発現している大 腸菌 株でそれらを異種的に発現させることです。 大腸菌dnaK756細胞はλバクテリオファージDNAを支持できません。さらに、天然のHsp70(DnaK)は、GrpE(Hsp70ヌクレオチド交換因子)に対する親和性が低下する一方で、ATPアーゼ活性の上昇を示します。その結果、 大腸菌dnaK756細胞は30°Cから37°Cの範囲の温度で十分に増殖しますが、高温(>40°C)では死滅します。このため、これらの細胞はHsp70のシャペロン活性を研究するためのモデルとして機能します。ここでは、これらの細胞を相補アッセイに適用し、Hsp70の セルロシャ ペロン機能の研究を可能にする詳細なプロトコルについて説明します。

概要

熱ショックタンパク質は、タンパク質のフォールディングを促進し、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質のミスフォールディングを逆転させることにより、分子シャペロンとして重要な役割を果たします^1,2。熱ショックプロテイン70(Hsp70)は、タンパク質の恒常性において中心的な役割を果たす、最も著名な分子シャペロンの一つである^3,4。DnaKは大腸菌Hsp70の相同体⁵である。

Hsp70のシャペロン活性を探り、このシャペロン^を標的とする阻害剤をスクリーニングするために、さまざまな生物物理学的、生化学的、および細胞ベースのアッセイが開発されています^6,7,8。Hsp70は高度に保存されたタンパク質です。このため、熱帯熱マラリア原虫(マラリアの主媒)などの真核生物のHsp70が、大腸菌のDnaK機能を代替することが報告されています

プロトコル

1. トランスフォーメーション

注:培養には滅菌ガラス器具、ピペットチップ、および調製したてのオートクレーブ滅菌した培地を使用してください。2x酵母トリプトン(YT)[1.6%トリプトン(w/v)、1%酵母抽出物(w/v)、0.5%NaCl(w/v)、1.5%寒天(w/v)]寒天培地で大 腸菌 細胞の培養を調製します。プロトコルで使用される一般的な試薬とその供給源は、 材料表に記載されています。

1. 2.0 mLの微量遠心チューブに標識し、50 μLのコンピテント 大腸菌dnaK756細胞を分注し、細胞を氷上に保持します。
2. コンピテントセルを含む2.0 mL微量遠心チューブに、10〜50 ngのpQE60/DnaK、pQE60/KPf、およびpQE60/KPf-V436FプラスミドDNA⁹を別々のチューブに分注します。
3. コンピテントセルとプラスミドDNAを含む2.0 mL微量遠心チューブを氷上に30分間保持します。
4. コンピテント細胞とDNAの混合物を42°Cで60秒間熱ショックし、微量遠心チューブを氷上に10分間戻します。
5. 950 μLの新鮮な2x YTブロス(37°Cでプレインキュベート)を加え、150回転/分で1時間振とうしなが....

結果

図2は、それぞれ37°Cおよび43.5°Cの許容増殖温度でスポットおよび培養された細胞を含むスキャン寒天の画像を示しています。図2の右側は、大腸菌dnaK756細胞におけるDnaK、KPf、およびKPf-V436Fの発現を切除したウェスタンブロット成分です。予想通り、37°Cの許容増殖温度で培養したすべての大腸菌dnaK756細胞はなんとか増殖することができました。しかし、43.5°Cの非許容増殖条件下では、以前に報告された^ように、DnaKとKPfを異種的に発現する細胞のみが増殖することができました^6,9,20(図2)。一方、KPf-V436Fを発現する細胞は、37°Cでは増殖し、43.5°Cでは増殖しませんでした。 これは、DnaKとKP.......

ディスカッション

プロトコルは異種に表現されたHsp70のシャペロン機能の調査の エシェリヒア属大腸菌dnaK756セルの有用性を示す。このアッセイは、 セルロのHsp70機能を標的とする阻害剤のスクリーニングに採用できます。ただし、この方法の1つの制限は、 大腸菌 のDnaKを代替できないHsp70がこのアッセイに適合しないことです。一部の非天然Hsp70の翻訳後修飾²¹の欠如は、 大腸菌 系内での機能の欠如を説明する可能性がある。酵母ベースの相補アッセイ²²は、 大腸菌ベースのアッセイのいくつかの欠点に対処し得る。

再現性のある結果を得るためには、いくつかの重要なステップが重要です。これらには、それぞれのプラスミドコンストラクトによって形質転換された細胞のみがプレーティング中に使用されるようにすることが含まれます。さらに、ステップ全体を通して培養物の汚染を避けることが重要です。さらに、ストレスを受けた 大.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-&β;-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	8,05,740	サンプルローディング染料の成分
酢酸	Labchem	101005125	脱染剤の成分
アクリルアミド	Sigma-Aldrich	8008300100	SDS
の成分 寒天	メルク	HG000BX1.500	中・液体成長アッセイの成分
アガロース	賢い科学	14131031	認定分子生物学 アガロー
過硫酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	101875295	SDS-PAGEゲルの成分
アンピシリン	VWR International	0339 & EU—25G	選択的抗生物質
ビス	シグマアルドリッチ	1015460100	SDS
ブロモフェノール	シグマアルドリッチ	0449-25G	サンプルローディング染料
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	コンピテントセル調製用
クーマシーブリリアントブルーVWR	インターナショナル	443293X	SDS-PAGE色素
二塩基性リン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	RB10368	PBSバッファーの成分
ECL	Thermofischer Scientific	32109	ウェスタンブロット検出試薬
臭化エチジウム	Thermofischer Scientific	17898	DNAインターカレート色素
グリセロール	メルク	SAAR2676520L	サンプルローディング色素の成分
グリシン	VWRインターナショナル	10119CU	SDS
IPTG	の成分 グレンサムライフサイエンス	162IL	誘導剤
カナマイシン	メルフォード	K0126	選択的抗生物質
塩化マグネシウム	メルク	SAAR4123000EM	中および液体成長アッセイの成分
メタノール	Labchem	113140129	脱染剤
一塩基性リン酸カリウム	メルク	1,04,87,30,250	PBS緩衝液の成分
ペプトン	メルク	HG000BX4.250	中・液体成長アッセイの成分
塩化カリウム	メルク	SAAR5042020EM	PBS緩衝液の成分
PVDF膜	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PB7320	ウェスタンブロット膜
塩化ナトリウム	メルク	SAAR5822320EM	中・液成長アッセイの成分
ドデシル硫酸ナトリウム	VWRインターナショナル	108073	発現タンパク質の分解に
Spectramax iD3	セパレーション	373705019	自動プレートリーダー
TEMED	VWR インターナショナル	ACRO420580500	SDSゲルの成分
テトラサイクリン	デュチェファ バイオケミーズ	T0150.0025	選択的抗生物質
トリス	VWRインターナショナル	19A094101SDS	ゲルの成分
Tween20	メルク	SAAR3164500XF	ウエスタンウォッシュバッファーの成分
エスタントランスファーチャンバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PB0112	ニトロセルロース膜酵母
抽出物	メルク	HG000BX6.500	へのタンパク質の転写中液成長アッセイの成分
&-DnaK抗体	Inqaba	BK CAC09317	一次抗体
&-ウサギ抗体	Thermofischer scientific	31460	二次抗体

ス の成分 の成分ウ