熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

Summary

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756 細胞は、天然の機能障害Hsp70を保有し、熱ストレスの影響を受けやすいため、アッセイのモデルとなります。機能的なHsp70の異種導入は、細胞の成長欠乏を救います。

Abstract

ヒートショックプロテイン70(Hsp70)は、細胞内の他のタンパク質のフォールディングを促進する保存されたタンパク質であり、分子シャペロンになります。Hsp70は、通常の条件下で増殖する 大腸菌 細胞には必須ではありませんが、高温での増殖にはこのシャペロンが不可欠です。Hsp70は高度に保存されているため、様々な種の Hsp70遺伝子のシャペロン機能を研究する1つの方法は、Hsp70が欠損している大腸菌株または機能的に損なわれた天然のHsp70を発現している大 腸菌 株でそれらを異種的に発現させることです。 大腸菌dnaK756細胞はλバクテリオファージDNAを支持できません。さらに、天然のHsp70(DnaK)は、GrpE(Hsp70ヌクレオチド交換因子)に対する親和性が低下する一方で、ATPアーゼ活性の上昇を示します。その結果、 大腸菌dnaK756細胞は30°Cから37°Cの範囲の温度で十分に増殖しますが、高温(>40°C)では死滅します。このため、これらの細胞はHsp70のシャペロン活性を研究するためのモデルとして機能します。ここでは、これらの細胞を相補アッセイに適用し、Hsp70の セルロシャ ペロン機能の研究を可能にする詳細なプロトコルについて説明します。

Introduction

熱ショックタンパク質は、タンパク質のフォールディングを促進し、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質のミスフォールディングを逆転させることにより、分子シャペロンとして重要な役割を果たします^1,2。熱ショックプロテイン70(Hsp70)は、タンパク質の恒常性において中心的な役割を果たす、最も著名な分子シャペロンの一つである^3,4。DnaKは大腸菌Hsp70の相同体⁵である。

Hsp70のシャペロン活性を探り、このシャペロン^を標的とする阻害剤をスクリーニングするために、さまざまな生物物理学的、生化学的、および細胞ベースのアッセイが開発されています^6,7,8。Hsp70は高度に保存されたタンパク質です。このため、熱帯熱マラリア原虫(マラリアの主媒)などの真核生物のHsp70が、大腸菌のDnaK機能を代替することが報告されています^6,9。このようにして、大腸菌におけるHsp70の異種発現を含む大腸菌ベースの相補アッセイが開発され、その細胞保護機能が探索されました。典型的には、このアッセイでは、DnaKが欠損している、または機能的に損なわれている天然DnaKを発現する大腸菌細胞の利用を伴います。DnaKは、通常の条件下では大腸菌の増殖に必須ではありませんが、細胞が高温やその他の形態のストレスなどのストレスの多い条件下で増殖すると不可欠になります^10,11。

相補アッセイを用いてHsp70の機能を研究するために開発された大腸菌株には、大腸菌dnaK103(BB2393 [C600 dnaK103(Am)thr::Tn10])および大腸菌dnaK756が含まれます。大腸菌dnaK103細胞は、機能しない切断型DnaKを産生するため、細胞は30°Cで十分に増殖するが、菌株は寒さや熱ストレスに敏感である^12,13。同様に、大腸菌dnaK756 / BB2362(dnaK756 recA :: TcR Pdm1,1)株は40°C以上では増殖しません^14,15。大腸菌dnaK756株は、32位、455位、および468位で3つのグリシンからアスパラギン酸への置換を特徴とする変異体ネイティブDnaK(DnaK756)を発現し、タンパク質抑制の結果が損なわれます。その結果、この菌株はバクテリオファージλDNAに耐性である¹⁴。さらに、大腸菌dnaK756はATPアーゼ活性の上昇を示すが、ヌクレオチド交換因子であるGrpEに対する親和性は低下する¹⁶。大腸菌DnaK変異株は、相補的アプローチによってHsp70のシャペロン活性を調べるための理想的なモデルとなります。DnaKはストレスの多い条件下でのみ必須であるため、相補アッセイは通常、高温で実施されます(図1)。この研究に大腸菌を使用する利点には、そのよく特徴付けられたゲノム、急速な成長、および培養と維持の低コストが含まれます¹⁷。

この記事では、Hsp70の機能を研究するために大腸菌dnaK756細胞を使用するプロトコルについて詳しく説明します。今回使用したHsp70は、野生型DnaKとそのキメラ誘導体KPf(熱帯熱マラリア原虫Hsp70-1のC末端基質結合ドメインにDnaKのATPaseドメインが融合したもの)である^6,18。KPf-V436Fは、変異が基質への結合を本質的にブロックし、シャペ^{ロン活性を}阻害するため、ネガティブコントロールとして異種的に発現した9。

Protocol

1. トランスフォーメーション

注:培養には滅菌ガラス器具、ピペットチップ、および調製したてのオートクレーブ滅菌した培地を使用してください。2x酵母トリプトン(YT)[1.6%トリプトン(w/v)、1%酵母抽出物(w/v)、0.5%NaCl(w/v)、1.5%寒天(w/v)]寒天培地で大 腸菌 細胞の培養を調製します。プロトコルで使用される一般的な試薬とその供給源は、 材料表に記載されています。

1. 2.0 mLの微量遠心チューブに標識し、50 μLのコンピテント 大腸菌dnaK756細胞を分注し、細胞を氷上に保持します。
2. コンピテントセルを含む2.0 mL微量遠心チューブに、10〜50 ngのpQE60/DnaK、pQE60/KPf、およびpQE60/KPf-V436FプラスミドDNA⁹を別々のチューブに分注します。
3. コンピテントセルとプラスミドDNAを含む2.0 mL微量遠心チューブを氷上に30分間保持します。
4. コンピテント細胞とDNAの混合物を42°Cで60秒間熱ショックし、微量遠心チューブを氷上に10分間戻します。
5. 950 μLの新鮮な2x YTブロス(37°Cでプレインキュベート)を加え、150回転/分で1時間振とうしながら37°Cでインキュベートします。必要に応じて、細胞の回復を促進するために、細胞をはるかに長く成長させたままにします。
   注:セルを激しく振ることは避けてください。
6. 細胞100 μLをピペットで移し、プラスミド選択用に50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、およびプラスミド選択用の100 μg/mLのアンピシリン( 材料表を参照)を含む2x YT寒天プレートに広げます。
7. 残りの細胞(容量は約900 μL)をベンチトップ微量遠心分離機を使用して、5000 x g (4°C)で1分間遠心分離します。
8. 約800 μLのブロスをデカントし、残りの培地を使用してペレット化した細胞を再懸濁します。
9. 回収した細胞を2x YT寒天プレートに播種します。
10. 両方の寒天プレートを37°Cで一晩(または約17時間)インキュベートします。
    注:これらの細胞は非常にゆっくりと成長し、より長い時間インキュベートする必要がある場合があります。非常に小さいコロニーを見つけるように注意してください。遠心分離(ステップ1.7)後に再懸濁した細胞を含むプレートは、細胞の形質転換効率が悪い場合のバックアップとして機能し、その場合、ペレット化した細胞は形質転換細胞の回収率を向上させる可能性があります。しかし、形質転換効率が優れていれば、濃縮細胞をプレーティングした寒天プレートは、インキュベーション時に培養物が生い茂り、単一コロニーの同定が困難になることがあります。その場合、もう一方の寒天プレートは、間隔の広いコロニーが成長するプレートである可能性があります。

2. 細胞プレーティング

1. 形質転換体から単一のコロニーをピックアップし、50 μg/mL のカナマイシン、大 腸菌 dnaK756 細胞の選択のために 10 μg/mL のテトラサイクリン、プラスミドの選択のために 100 μg/mL のアンピシリンを添加した 10 mL の 2x YT ブロスに接種します。
   注:フラスコ(≥50 mL)を使用して、培養物を攪拌するときは必ず通気してください。接種物を37°Cで一晩(17時間)インキュベートし、150回転/分で振とうします。
2. 翌朝、OD₆₀₀で吸光度を読み取ります。
3. 75%エタノールを使用して作業台の表面を洗浄し、細胞のスポッティングに備えて表面を綿棒で拭きます。
4. 2 mLの微量遠心チューブを使用し、2x YTブロスを使用して培養液をOD₆₀₀読み取り値2.0に標準化します。
   注:このステップは、さまざまなサンプルの細胞密度を標準化するために重要であるため、ODの読み取り値が正しく取得されていることを確認してください。
5. 2 mLの微量遠心チューブを使用して、細胞を10⁰から^10-5までの段階希釈液を調製します。
6. 細胞のスポットに使用する寒天プレートを40°Cに設定したオーブンでインキュベートし、水蒸気を確実に逃がすために蓋を部分的に開いた状態でプレートを乾燥させます。
   注:細胞が均一に分離された距離で斑点が見られるようにするには、斑点部位のテンプレートが印刷された紙に線を引きます。
7. 50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、100 μg/mLのアンピシリン、および0.5 mM IPTG(組換えタンパク質の発現誘導用)を添加した寒天プレート上に、段階希釈した細胞2 μLをスポットします( 材料表を参照)。
8. 各サンプルを2つの別々のプレート(1つは37°Cでインキュベート、もう1つは43.5°C)にスポットします。
   注:寒天プレートに穴を開けないでください。
9. 環境への影響を最小限に抑えるために、実験サンプルと同じプレートにサンプルをスポットコントロールします。
10. スポッティングを迅速に行い、細胞が成長し始める前にプロセスが完了していることを確認してください。
    注:エアロゾルはプレートを汚染するため、スポッティング時には避けることが重要です。また、汚染を避けるために、スポッティングの間にプレートを閉じておくことも重要です。
11. 一方のプレートを37°C(許容増殖温度)でインキュベートし、もう一方のプレートを非許容増殖温度43.5°Cでインキュベートします。
    注:凝縮水が斑点のあるコロニーをその位置から洗い流すため、蒸気が蓋に溜まらないように、プレートを逆さまにしてインキュベートします。
12. すべてのプレートをインキュベーターに同時に置き、翌朝までインキュベーターを開かないようにします。
    注:プレートのインキュベーション中にインキュベーターのドアを数回開くことはお勧めしません。これは、インキュベーターに空気が入ると、細胞増殖に悪影響を与える温度変動が生じる可能性があるためです。

3. 組換えタンパク質の発現確認

1. 滅菌ループを使用して、形質転換大 腸菌dnaK756細胞の同じコロニーから残りの細胞の一部をピックアップします。
2. 50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、および 100 μg/mL のアンピシリンを添加した 10 mL の YT ブロスに細胞を接種します。37°Cで150回転/分で振とうしながら一晩(17時間)インキュベートします。
3. ステップ3.2で説明したように、必要な抗生物質を含む90 mLの滅菌2x YTブロスに培養液を移します。細胞を対数期中期(OD₆₀₀ = 0.4-0.6)まで成長させます。
4. 誘導前に2 mLのサンプル培養液を採取します(0時間誘導サンプル)。
5. IPTGを最終濃度1 mMに添加してタンパク質産生を誘導し、細胞を37°Cで再インキュベートします。
6. 誘導の 6 時間後に 2 回目の 2 mL サンプルを採取します。
7. 5000 x g で10分間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離機の温度を4°Cに保ちます。
8. 上澄みを捨てます。
9. ペレットをPBS緩衝液(137 mM NaCl、27 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、1.4 mM KH₂PO₄)に再懸濁し、-20°Cで保存します。

4. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析

1. 前述のように2x 10%SDSゲルを調製します¹⁹.
2. SDS-PAGEゲルの1つを保管し、その後のCoomassie染色試薬でタンパク質バンドを観察するために染色します。2つ目のSDS-PAGEゲルを使用して、ウェスタンブロット解析を行います。
3. 再懸濁したサンプル80 μLを分注し、20 μLの4x Laemmli SDSローディングバッファーと混合します。
4. 懸濁液を100°Cで10分間沸騰させます。次に、各サンプル10 μLをプレキャストSDSゲルにロードします( 材料表を参照)。
5. SDS ランニングバッファー(25 mm トリス、250 mm グリシン、0.1% (w/v) SDS)の 1 倍溶液中で 120 V の電圧を使用して、室温で 1 時間電気泳動を行います。
6. ゲルをクマシー染色( 材料表を参照)で1時間染色し、続いて脱染バッファー(蒸留水に50%(v/v)メタノール、10%(v/v)酢酸)を使用して2時間脱色します。
7. ゲルイメージングシステムを使用して、ゲル中に存在するタンパク質バンドを可視化します( 材料表を参照)。上記のプロトコルに従って、同じサンプルで別のSDS-PAGEゲルを再泳動します。
8. 電気泳動分析が終了したら、SDS-PAGEゲルを服用して、前述のようにウェスタンブロット分析を実施します¹⁹。
9. タンパク質を転写したニトロセルロースメンブレンを洗浄バッファー(TBS-Tween、pH 7.4 [50 mM Tris、150 mM NaCl、1%(v/v)Tween])で洗浄します。
10. α-DnaK( 材料表参照)を用いてDnaKを、KPf及びその変異体KPf-V436Fの検出にα-PfHsp70-1⁷)をそれぞれ用いる。
11. 抗体は、5%脱脂乳中で1:2000に希釈して使用します。4°Cで60回転/分で1時間振とうしながらインキュベートします。
12. TBS-Tweenでニトロセルロースメンブレンを15分間に3回洗浄することにより、非特異的結合抗体を除去します。
13. メンブレンを二次抗体(α-ウサギ、 材料表を参照)で前のステップと同じ条件でインキュベートします。その後、一次抗体と同じ条件で洗浄します。
14. 増強化学発光(ECL)検出試薬を使用してバンドを分離します。
15. ゲルイメージャーを使用してバンドを可視化します。

Results

図2は、それぞれ37°Cおよび43.5°Cの許容増殖温度でスポットおよび培養された細胞を含むスキャン寒天の画像を示しています。図2の右側は、大腸菌dnaK756細胞におけるDnaK、KPf、およびKPf-V436Fの発現を切除したウェスタンブロット成分です。予想通り、37°Cの許容増殖温度で培養したすべての大腸菌dnaK756細胞はなんとか増殖することができました。しかし、43.5°Cの非許容増殖条件下では、以前に報告された^ように、DnaKとKPfを異種的に発現する細胞のみが増殖することができました^6,9,20(図2)。一方、KPf-V436Fを発現する細胞は、37°Cでは増殖し、43.5°Cでは増殖しませんでした。 これは、DnaKとKPfが熱ストレス条件下で大腸菌dnaK756細胞の増殖欠陥を回復できたことを示しています。KPf-V436Fを異種的に発現する細胞が43.5°Cでの細胞増殖をサポートできないことは、このタンパク質のシャペロン機能の欠如を示しています。この点で、KPf-V436Fは理想的なネガティブコントロールタンパク質として機能します。

図1:異種発現タンパク質のシャペロン機能を研究するための 大腸菌dnaK756 細胞を用いた相補アッセイの原理。 大腸菌dnaK756は、熱ストレスから細胞を保護することができない天然のDnaK756タンパク質を発現します。機能的異種Hsp70の導入は、熱ストレスにさらされると細胞を死から救う。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:大 腸菌dnaK756細胞を熱ストレスから保護するDnaKおよびKPfの能力を実証する相補プレートアッセイ。 形質転換細胞を37°C(許容増殖温度)および43.5°C(非許容増殖温度)で培養した。細胞を標準化し、段階希釈液として播種しました。「N」は「Neat」を象徴し、希釈されていない細胞で構成された最初のスポットを表します。右端は、3つのタンパク質の発現を表すウェスタンブロット切除です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

プロトコルは異種に表現されたHsp70のシャペロン機能の調査の エシェリヒア属大腸菌dnaK756セルの有用性を示す。このアッセイは、 セルロのHsp70機能を標的とする阻害剤のスクリーニングに採用できます。ただし、この方法の1つの制限は、 大腸菌 のDnaKを代替できないHsp70がこのアッセイに適合しないことです。一部の非天然Hsp70の翻訳後修飾²¹の欠如は、 大腸菌 系内での機能の欠如を説明する可能性がある。酵母ベースの相補アッセイ²²は、 大腸菌ベースのアッセイのいくつかの欠点に対処し得る。

再現性のある結果を得るためには、いくつかの重要なステップが重要です。これらには、それぞれのプラスミドコンストラクトによって形質転換された細胞のみがプレーティング中に使用されるようにすることが含まれます。さらに、ステップ全体を通して培養物の汚染を避けることが重要です。さらに、ストレスを受けた 大腸菌 DnaK細胞は過剰なフィラメント化の影響を受けやすい^ため10、この物理的緊張が広範なフィラメント形成を促進するため、培養中の激しい揺れを避けることが重要です。過度にフィラメント化された細胞は、OD₆₀₀でより高い偽の見かけの成長測定値を与え、培養増殖の過大評価につながり、プレーティング前の細胞の標準化に悪影響を及ぼします。Hsp70は通常の条件下では 大腸菌 の増殖に必須ではないが、このタンパク質を欠損した細胞はストレスを受けやすい¹⁰。このため、 大腸菌dnaK756細胞は、形質転換後、またはグリセロールストックからの回収中に、はるかにゆっくりと増殖します。さらに、温度変動に非常に敏感です。したがって、メッキされた寒天プレートを内部に置いたら、プレートを表示する時間になるまで、インキュベーターのドアを開かないようにすることが重要です。

ウェスタンブロットデータは、 大腸菌dnaK756細胞におけるそれぞれの組換えHsp70タンパク質の発現を確認するために重要です。それぞれのタンパク質の発現に失敗すると、非許容増殖温度で増殖する細胞の偽陰性の結果につながります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-&β;-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	8,05,740	サンプルローディング染料の成分
酢酸	Labchem	101005125	脱染剤の成分
アクリルアミド	Sigma-Aldrich	8008300100	SDS
の成分 寒天	メルク	HG000BX1.500	中・液体成長アッセイの成分
アガロース	賢い科学	14131031	認定分子生物学 アガロー
過硫酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	101875295	SDS-PAGEゲルの成分
アンピシリン	VWR International	0339 & EU—25G	選択的抗生物質
ビス	シグマアルドリッチ	1015460100	SDS
ブロモフェノール	シグマアルドリッチ	0449-25G	サンプルローディング染料
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	コンピテントセル調製用
クーマシーブリリアントブルーVWR	インターナショナル	443293X	SDS-PAGE色素
二塩基性リン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	RB10368	PBSバッファーの成分
ECL	Thermofischer Scientific	32109	ウェスタンブロット検出試薬
臭化エチジウム	Thermofischer Scientific	17898	DNAインターカレート色素
グリセロール	メルク	SAAR2676520L	サンプルローディング色素の成分
グリシン	VWRインターナショナル	10119CU	SDS
IPTG	の成分 グレンサムライフサイエンス	162IL	誘導剤
カナマイシン	メルフォード	K0126	選択的抗生物質
塩化マグネシウム	メルク	SAAR4123000EM	中および液体成長アッセイの成分
メタノール	Labchem	113140129	脱染剤
一塩基性リン酸カリウム	メルク	1,04,87,30,250	PBS緩衝液の成分
ペプトン	メルク	HG000BX4.250	中・液体成長アッセイの成分
塩化カリウム	メルク	SAAR5042020EM	PBS緩衝液の成分
PVDF膜	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PB7320	ウェスタンブロット膜
塩化ナトリウム	メルク	SAAR5822320EM	中・液成長アッセイの成分
ドデシル硫酸ナトリウム	VWRインターナショナル	108073	発現タンパク質の分解に
Spectramax iD3	セパレーション	373705019	自動プレートリーダー
TEMED	VWR インターナショナル	ACRO420580500	SDSゲルの成分
テトラサイクリン	デュチェファ バイオケミーズ	T0150.0025	選択的抗生物質
トリス	VWRインターナショナル	19A094101SDS	ゲルの成分
Tween20	メルク	SAAR3164500XF	ウエスタンウォッシュバッファーの成分
エスタントランスファーチャンバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PB0112	ニトロセルロース膜酵母
抽出物	メルク	HG000BX6.500	へのタンパク質の転写中液成長アッセイの成分
&-DnaK抗体	Inqaba	BK CAC09317	一次抗体
&-ウサギ抗体	Thermofischer scientific	31460	二次抗体