脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)は、肝臓組織工学の分野で有望な用途を持っています。このプロトコルは、ラットの脾臓を採取し、灌流によって脱細胞化し、得られたDSMを評価してその特性を確認することを含む、ラットDSMを準備する手順を概説しています。
この記事について
サマリー
要約
肝移植は、末期肝疾患の一次治療です。しかし、ドナー臓器の不足と質の低さから、代替療法の開発が求められています。脱細胞化肝マトリックス(DLM)を利用した生物人工肝臓(BAL)が有望な解決策として浮上しています。しかし、適切なDLMの調達は依然として困難です。脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)の使用は、BALの基盤として検討されており、すぐに利用できる代替手段を提供しています。この研究では、凍結融解サイクルと脱細胞化試薬との灌流の組み合わせを使用して、ラットの脾臓を採取し、脱細胞化しました。このプロトコルは、DSM内の細胞外マトリックス(ECM)の微細構造と成分を保存しました。完全な脱細胞化プロセスには約11時間かかり、DSM内に無傷のECMが得られました。組織学的分析により、ECMの構造と組成を維持しながら細胞成分が除去されることが確認されました。提示されたプロトコルは、DSMを取得するための包括的な方法を提供し、肝臓組織工学および細胞療法における潜在的なアプリケーションを提供します。これらの知見は、末期肝疾患の治療のための代替アプローチの開発に貢献します。
概要
肝移植は、末期肝疾患の唯一の決定的な治療法です1,2,3。しかし、ドナー臓器の深刻な不足と質の低下により、代替治療の必要性が高まっています4。再生医療の分野では、脱細胞化肝マトリックス(DLM)を利用したバイオ人工肝臓(BAL)が有望な解決策として浮上しています5,6,7。DLMは、複雑な微小血管ネットワークやECMの構成要素など、元の肝臓構造を保存し、肝疾患を緩和する可能性のある移植可能なBALを作成するための足場を提供します。
この技術の採用は、特に適切なDLMの調達において課題に直面しており、ヒト由来のDLMは不足しており、動物由来のDLMは病気の伝染や免疫拒絶のリスクを伴います。革新的なアプローチで、私たちの研究は、BAL8、9、10、11の基盤として脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)の使用を検討しました。脾臓は、門脈圧亢進症、外傷性破裂、特発性血小板減少性紫斑病、心臓死後の提供など、さまざまな医学的状況でより容易に利用できます。したがって、脾臓は研究目的で肝臓よりも広く利用可能です。脾臓摘出術を受けた患者は重篤な状態に罹患しておらず、脾臓のディスペンサビリティをさらに確認しています。脾臓、特に細胞外マトリックスと正弦波の微小環境は、肝臓の微小環境と似ています。これにより、脾臓は肝細胞移植研究における細胞接着と増殖に適した器官になります。これらの発見に基づいて、私たちの以前の調査では、DSMがDLMと同等の微細構造と成分を共有し、アルブミンや尿素産生を含む肝細胞の生存と機能をサポートできることが実証されました。さらに、DSMは骨髄間葉系幹細胞の肝分化を促進し、改善された一貫した機能をもたらすことが示されています。
ヘパリンで処理されたDSMを採用することにより、効果的な短期抗凝固療法および部分的な肝機能補償を実証できる機能性BALを設計しました11。したがって、この3次元DSMは、肝臓組織工学と細胞治療の進歩に大きな期待を寄せています。この研究では、ラットの脾臓を採取し、ECMの微細構造と成分を保存するDSMを調製する詳細な方法を紹介します。
プロトコル
本研究は、西安交通大学動物実験倫理委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施された。
1.脾臓の収穫
- 体重250〜280 gの雄のSprague Dawleyラットを使用してください。ネズミを温度と湿度が制御された部屋に収容し、手術前の絶食を除いて、 自由に餌と水を与えます。
- 手術の1時間前に鎮痛剤としてブプレノルフィン(0.05mL/kg)を皮下注射します。イソフルラン吸入によってラットを麻酔します。プレキシガラスの箱で導入麻酔には1.5 L / minの流量5%イソフルランを使用し、マスクを通して0.6〜0.8 L / minの流量で麻酔を維持します。つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
- 電気シェーバーを使用して、腹部全体の皮膚を剃ります。ラットを手術台の仰臥位に固定します。2 mLのヘパリン食塩水(1,000 Uのヘパリン)を陰茎背静脈から注入して、全身抗凝固を実現します。.剃った皮膚をポビドンヨード溶液で消毒し、滅菌したドレープ布で覆います。
- 腹部に外科用ハサミを使用して十字形切開を行い、止血鉗子で伸ばして腹腔を露出させ、肝臓を横隔膜に向かってひっくり返します。胃腸管を腹部の右側に外側に出し、湿ったガーゼで覆います。
- 脾胃靭帯を慎重に分離して切断し、脾孔を露出させます。
注:脾臓は、約3.0 cm x 0.6 cm x 0.6 cmの大きさの赤みがかった細長い構造として現れ、左腹部で識別できます。 - 脾鎖に沿って解剖することにより、総肝動脈、胃十二指腸動脈、および脾動脈を徐々に分離して露出させます。胃十二指腸動脈と総肝動脈を結紮して切断し、周囲の組織を徐々に解離させます。
- 脾臓を右側にひっくり返して、腹部大動脈を露出させます。鈍的解剖を穏やかに行い、綿棒を使用して腹部大動脈と腹腔幹を露出させます。腹腔幹の枝の上下に長さ約3cmの3-0シルク縫合糸を配置し、腹腔幹の枝に長さ約10cmの6-0シルク縫合糸を配置します。
- 腹腔幹の枝の下と上の腹部大動脈を結紮します。動脈枝を小さく切開します。6-0シルク縫合糸をそっと持ち上げ、腹腔幹に沿って脾動脈に24G静脈カテーテルを挿入し、結紮して固定します。
- シリンジポンプを4 mL/分の速度で使用し、ヘパリン処理した生理食塩水(25 U/mL)を50 mLの容量で注入します。同時に、注入された液体が脾臓から流出するように、流出チャネルとして門脈を切断します。動物は放血によって安楽死させられます。
- 脾臓の周囲の組織を注意深く解剖し、膵臓への損傷を避けながら、主要な付属血管を保存します。
- 脾臓の周囲に漏れがないか確認し、脾臓と膵臓を取り除き、生理食塩水ですすいでください。
注:ラットの脾臓と膵臓は密接に関連しており、膵臓は脾臓動脈を包み込んでいます。脾臓を別々に切除すると、多数の小さな血管を結紮するのが難しくなる可能性があります。この手順では、脾臓を膵臓と一緒に除去します。脱細胞化後、脾臓と膵臓は透明になり、微小血管系が見えるため、無傷の血管を持つ脾臓の保存が容易になります。 - 脾臓を生理食塩水で満たされた50mLの遠心分離チューブに移し、-80°Cの冷凍庫で保存します。
注: 脾臓と脾臓動脈に挿入された静脈カテーテルは、灌流実験中に便利な接続のために一緒に凍結保存されます。
2.脾臓の脱細胞化
- 滅菌容器内で凍結融解サイクルを3回繰り返して、脾臓細胞を溶解します。
注:凍結融解サイクルは、足場の脱細胞化に使用される物理的方法です。脾臓組織を-80°Cの冷凍庫に一晩入れて凍結した後、低温環境から取り出し、室温または37°Cの水浴に入れて解凍します。この凍結融解のプロセスを3〜6回繰り返すことで、細胞膜を破壊し、細胞溶解を引き起こします。 - 蠕動ポンプ、2Lリザーバー、内径2.4mmのシリコンチューブ、バブルトラップからなるクリーンベンチ内に灌流システムを設置します(図1)。
- 灌流システムに脱イオン水(ddH2O)を満たし、10分間稼働させます。
- 収穫した脾臓をddH2Oで満たされた容器に慎重に移します。
- 脾臓動脈に挿入された静脈カテーテルにシリコンチューブを接続します。
- ddH2O を 2 mL/分の速度で 30 分間灌流開始します。
- ddH2O を 4 mL/分の速度で 30 分間灌流します。
- 0.1%(w / v)SDS溶液で4時間灌流します。
- 1%(v/v)Triton X-100溶液で2時間灌流します。
- DSMを洗浄するために、4mL /分の速度でPBSで4時間灌流します。
注:すべての液体の一方向灌流に蠕動ポンプを使用します。 - 灌流が完了したら、膵臓と脾臓の間の血管枝を結紮して横断し、膵臓を取り除きます。DSMは、10%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSに浸した清潔で密封された50 mLの遠心分離チューブに、将来の実験に使用できるようになるまで-20°Cで保存してください。
結果
このプロトコルは、ラット脾臓の脱細胞化のために、反復凍結融解サイクルと脱細胞化試薬との灌流の組み合わせを利用しました。脾臓の完全な脱細胞化は約11時間で達成されました(図2A)。脱細胞化プロセス全体を通して、脾臓の色は徐々に深紅からまだらの明るい赤に変化し、最終的には白い半透明の外観になりました(図2B)。全体的な形態は比較的無傷のままで、血管構造が目に見えました(図2B)。
ヘマトキシリン-エオシン染色により、細胞成分の除去が確認され、DSM内に無傷のECMが明らかになりました。これは、 図3Aに示されているように、細胞核と細胞質要素が見える天然の脾臓とはまったく対照的です。細胞の非存在は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色および残留DNAの測定によってさらに確認されました(DSM:10.1 ± 4 ng / mg乾燥重量、天然脾臓:6,200 ± 300 ng / mg乾燥重量)。走査型電子顕微鏡画像は、脾臓からリンパ球を完全に除去した後のハニカム構造を示したDSMの超微細構造特性を明らかにしました(図3C)。これは、脾臓の脱細胞化が正常な脾臓の超微細構造と構造を維持していることを示しました。DSM内に存在する重要なECMタンパク質のより包括的な評価のために、マッソントリクローム(図3B)と免疫蛍光染色が採用されました。具体的には、コラーゲンI(図3D)とフィブロネクチン(図3E)を解析対象としました。結果は、ECMの構造膜成分と基底膜成分の両方が天然の脾臓と同様に保持されていることを示しました。
図1:実験のセットアップ。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:脱細胞化と肉眼的形態学的変化のワークフロー(A)脱細胞化した脾臓基質調製ワークフロー。脾臓の完全な脱細胞化は、DSMの準備中の脾臓の約11時間で達成されました。この過程で、脾臓の色は徐々に深紅からまだらの薄い赤に変化し、最終的には白い半透明の外観になりました。(B)1。凍結融解サイクルを繰り返した後、脱細胞化の前。2. 脱イオン水で1時間すすいだ後。SDSを4時間灌流した後。トリトンを2時間灌流した後。略語:DSM =脱細胞化脾臓マトリックス;SDS = ドデシル硫酸ナトリウム;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;PS =ペニシリン-ストレプトマイシン。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:脱細胞化した脾臓マトリックスの形態学的観察。(B)マッソントリクローム染色;(C)SEM;(D,E)コラーゲンIおよびフィブロネクチンの免疫蛍光染色;(F)DAPI染色。スケールバー = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C).略語:DSM =脱細胞化脾臓マトリックス;H&E =ヘマトキシリン-エオシン;SEM = 走査型電子顕微鏡;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
BALは、末期肝疾患の治療に効果的なアプローチであり、特に現在のドナー臓器不足によって肝移植が妨げられている場合に有効です6。BALを作成するための有望なオプションは、天然の肝臓の自然なECMと血管構造を保存するDLMの利用です。しかし、ヒトDLMの希少性と、動物DLMに関連する感染と免疫原性の潜在的なリスクは、重大な制限をもたらします。この課題に対処するために、BAL8、9、10、11の代替足場として脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)を採用する新しい戦略を提案します。脾臓は、さまざまな臨床シナリオでより容易にアクセスでき、肝臓と同様の特徴を示します。この研究では、ラットの脾臓を採取し、ECMの微細構造と成分を保存するDSMを準備する詳細な方法を紹介します。
理想的な脱細胞化法は、ECM 12,13,14の元の構造、組成、および機械的特性を維持しながら、細胞成分を除去することです。脱細胞化法には、物理的、化学的、および酵素的処理が含まれ、それぞれに明確な長所と短所があります15。これらの方法では、細胞成分を部分的に除去することができますが、残りのECMの組成、構造、および機能性を損なう可能性もあります。脱細胞化の質は、異なる組織源における細胞密度、マトリックスの厚さ、および組織形態の変動によって影響を受ける可能性があります。
今日まで、脱細胞化プロセスのためのゴールドスタンダードはありません。通常、これらの方法のいずれかを単に採用するだけでは、ECMへの悪影響を最小限に抑え、細胞内容物の除去を最大化するには不十分です。したがって、最も効果的なアプローチは組織特性に依存しており、これらの方法を組み合わせる必要があります。本研究では、ラットの脾臓を脱細胞化するために、物理的方法(凍結融解サイクルおよび灌流)と化学的方法(SDSおよびTritonX-100)を組み合わせたプロトコルを利用した。
凍結融解サイクルは、細胞溶解とECMからの細胞の急速な剥離を促進します16。同時に、天然の血管系を通る灌流は、脱細胞化効率を著しく高め、元の血管網を維持する17。イオン性界面活性剤として機能するドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は、細胞膜と核膜の両方を巧みに溶解し、細胞質成分と核成分をより包括的に除去します。しかし、このプロセスは、グリコサミノグリカン(GAG)とコラーゲンの枯渇により、ECMの超微細構造にも損傷を与えます。
SDS濃度の上昇は、ECM足場内の残留DNA含有量の減少および機械的強度の低下と相関していました。逆に、低濃度のSDSは、より多くのコラーゲンを保存し、ECMタンパク質の変性を誘導しませんでした。対照的に、非イオン性界面活性剤として機能するTriton X-100は、脂質-脂質、脂質-タンパク質、およびDNA-タンパク質の相互作用を効果的に破壊し、細胞膜溶解に対するより穏やかなアプローチを提供します。それにもかかわらず、細胞核とDNAを完全に除去するには不十分であることが証明されています。したがって、ECMの元の構造、組成、および性能を維持しながら、細胞成分を完全に除去するために、低濃度のSDSおよび物理的処理と組み合わせる必要があります。残留界面活性剤は特定の細胞毒性を持つ可能性があるため、保管前に滅菌PBSまたは蒸留水で後処理すすぐ必要があることに注意することが重要です。
このプロトコルの1つの制限は、残留SDSおよびTriton X-100の定量化がないことです。この決定は、私たちのチームの経験と、これらの物質を効果的に除去するには4時間のPBS洗浄で十分であることを示唆する裏付けとなる報告の両方に基づいています。さらに、このプロトコルを使用した以前の細胞培養実験では、細胞毒性の兆候は示されていません。プロトコルの費用を最小限に抑えるために、残留界面活性剤の定量を控えるという意図的な選択が行われました。
結論として、このプロトコルは、DSMの準備のための実行可能な方法を提示し、効率、安定性、および最小限の侵襲性を実証します。このプロトコルを使用して調製されたDSMは、脾臓の固有の構造、組成、および自然な血管ネットワークを維持します。さらに、細胞移植や3次元動的培養のための足場を提供し、それによって組織工学的肝臓の研究を進める基盤を確立します。
開示事項
著者らは利益相反を宣言していない。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(82000624)、陝西省自然科学基礎研究プログラム(2022JQ-899および2021JM-268)、陝西省イノベーション能力支援プログラム(2023KJXX-030)、陝西省重点研究開発計画大学共同プロジェクト-重点プロジェクト(2021GXLH-Z-047)、西安交通大学第一付属病院の制度的設立(2021HL-42および2021HL-21)の支援を受けました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 麻酔器 | ハーバード装置 | 卓上 | 動物麻酔 |
| バブルトラップ | 山東Weigaoグループメディカルポリマー株式会社 | 細孔径:5 μm | は気泡 |
| Buprenorphine | TIPRの薬剤の責任Co.、株式会社 | 鎮痛剤 | |
| の止血鉗子 | 上海の医療機器 Co.、株式会社 | J31020 | 外科用具 |
| ヘパリン化生理食塩水 | SPH No.1生化学&製薬株式会社 | 血栓症の形成を防ぐ | |
| イソフルラン | RWDライフサイエンス(株) | 麻酔薬:麻酔 | |
| ニシリン-ストレプトマイシンの導入 | ビヨタイムバイオテクノロジー(株) | C0222 | in vitro 抗生物質による微生物汚染防止 |
| 蠕動ポンプ | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | リン酸緩衝塩溶液 |
| シリコーンチューブ | Baoding長尺精密ポンプ株式会社 | 2.4×0.8mm | |
| 絹縫合 | 揚州金環医療機器工場 | 6-0および3-0 | 結紮血管ド |
| デシル硫酸ナトリウム | 上海タイタンサイエンティフィック株式会社 | 151-21-3 | 性洗剤は、細胞と核膜の両方を溶解します |
| シリンジポンプ | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | 静脈内注入 |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | 非イオン性界面活性剤、脂質-脂質、脂質-タンパク質、DNA-タンパク質の相互作用を阻害 |
| 静脈カテーテル | B. Braun Company | 24G | 脾臓動脈の挿入 |
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