方法論記事

HIV-1感染T細胞における小胞体ストレスとアンフォールドタンパク質応答の測定とHIV-1複製におけるその役割の解析

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DOI：

10.3791/66522

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2024年6月14日

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

この記事について

サマリー

ここでは、特にHIV-1感染に重点を置いて、小胞体(ER)ストレスとアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)の活性化を決定するためのいくつかの確立された方法について説明します。この記事では、ER ストレス/UPR が HIV-1 の複製とビリオン感染性に及ぼす影響を調査するための一連のプロトコルについても説明します。

要約

ウイルス感染は、異常なタンパク質蓄積により小胞体(ER)ストレスを引き起こし、アンフォールデッドタンパク質応答(UPR)を引き起こす可能性があります。ウイルスは宿主のUPRを操作する戦略を開発してきましたが、HIV-1感染中のUPR調節とその機能的意義についての詳細な理解は文献に欠けています。これに関連して、現在の記事では、T細胞のHIV-1感染中の小胞体ストレスレベルとUPRを測定するために私たちの研究室で使用されているプロトコルと、ウイルスの複製と感染性に対するUPRの影響について説明します。

チオフラビンT(ThT)染色は、タンパク質凝集体を検出することにより細胞内の小胞体ストレスを検出するために使用される比較的新しい方法です。ここでは、小胞体ストレスを検出および定量化するためのHIV-1感染細胞におけるThT染色のプロトコルを示しました。さらに、小胞体ストレスは、従来の免疫ブロッティングおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、HIV-1感染細胞におけるBiP、リン酸化IRE1、PERK、eIF2αなどのUPRマーカーのレベル、XBP1のスプライシング、ATF6、ATF4、CHOP、およびGADD34の切断を測定することにより、間接的にも検出されました。ThT蛍光はUPR活性化の指標と相関していることを発見しました。この記事では、ノックダウン実験による小胞体ストレスとUPR調節がHIV-1複製に与える影響を分析するためのプロトコル、および薬理学的分子の使用についても説明します。HIV-1遺伝子の発現/複製およびウイルス産生に対するUPRの影響は、それぞれLuciferase reporter assaysおよびp24抗原捕捉ELISAによって解析されましたが、ビリオン感染性への影響は、感染したレポーター細胞の染色によって解析されました。これらの方法群を総合すると、HIV-1感染時のアンフォールデッドタンパク質応答経路を包括的に理解し、その複雑なダイナミクスを明らかにすることができます。

概要

後天性免疫不全症候群(AIDS)は、CD4+ Tリンパ球の数が徐々に減少することを特徴とし、免疫応答の進行性の失敗につながります。ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)は、エイズの原因物質です。これは、ウイルス粒子ごとに2つのRNAのコピーを持つ包み込まれたポジティブな感覚の一本鎖RNAウイルスであり、レトロウイルス科に属します。宿主細胞内での高濃度のウイルスタンパク質の産生は、細胞のタンパク質折り畳み機構に過度のストレスを与えます1。ERは、真核細胞の分泌経路の最初のコンパートメントです。タンパク質の産生、変更、および分泌経路と細胞外空間標的部位への送達を担当しています。タンパク質は、アスパラギン結合グリコシル化や分子内および分子間ジスルフィド結合の産生など、多数の翻訳後変化を経て、小胞体内で自然なコンフォメーションに折り畳まれます2。したがって、高濃度のタンパク質がER内腔に存在し、これらは凝集やミスフォールディングが非常に起こりやすいです。熱ショック、微生物感染、ウイルス感染など、タンパク質合成の促進やタンパク質の突然変異を必要とするさまざまな生理学的条件は、ERでのタンパク質蓄積の増加によるERストレスを引き起こし、ER内腔の恒常性を乱します。小胞体ストレスは、高度に保存された適応シグナル伝達経路であるアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)3のネットワークを活性化します。UPRは、折り畳まれていないタンパク質の負荷と折り畳み能力を調整することにより、正常なER生理学的状態を取り戻すために使用されます。これは、小胞体のサイズと小胞体に常在する分子シャペロンとフォールダーゼを大きくすることでもたらされ、小胞体の折り畳み能力が向上します。また、UPRは、翻訳レベルでの全球的なタンパク質合成の減衰を通じてERのタンパク質負荷を減少させ、ER関連分解(ERAD)をアップレギュレーションすることにより、ERからのアンフォールドタンパク質のクリアランスを増加させます4,5。

小胞体ストレスは、プロテインキナーゼR(PKR)様小胞体キナーゼ(PERK)、活性化転写因子6(ATF6)、およびイノシトール要求酵素1型(IRE1)の3つの小胞体常在膜貫通タンパク質によって感知されます。これらのエフェクターはすべて、結合タンパク質(BiP)/78-kDaグルコース調節タンパク質(GRP78)としても知られるシャペロンヒートショックタンパク質ファミリーA(Hsp70)メンバー5(HSPA5)に結合することにより不活性に保たれます。小胞体ストレスとアンフォールド/ミスフォールドタンパク質の蓄積により、HSPA5は解離してこれらのエフェクターを活性化し、その後、小胞体ストレスの解消に役立つ一連の下流標的を活性化し、極限状態では細胞死を促進します6。HSPA5から解離すると、PERKは自己リン酸化し、そのキナーゼ活性が活性化されます7。そのキナーゼ活性はeIF2αをリン酸化し、翻訳減衰を引き起こし、小胞体8のタンパク質負荷を低下させます。しかし、リン酸化真核生物の開始因子2α(eIF2α)の存在下では、特定のmRNA上の非翻訳オープンリーディングフレームが優先的に翻訳され、ATF4のようにストレス誘発遺伝子を調節します。ATF4およびC/EBP相同タンパク質(CHOP)は、ストレス誘発性遺伝子を調節し、アポトーシスおよび細胞死経路を調節する転写因子である9,10。ATF4およびCHOPの標的の1つは、増殖停止およびDNA損傷誘導性タンパク質(GADD34)であり、これはタンパク質ホスファターゼ1とともにpeIF2αを脱リン酸化し、並進減衰のフィードバック調節因子として作用する11。小胞体ストレス下では、ATF6はHSPA5から解離し、そのゴルジ体局在化信号が露出し、ゴルジ体への転座につながります。ゴルジ装置では、ATF6はサイト1プロテアーゼ(S1P)およびサイト2プロテアーゼ(S2P)によって切断され、切断された形態のATF6(ATF6 P50)が放出されます。その後、ATF6 p50は核に移され、そこでタンパク質のフォールディング、成熟、分泌、およびタンパク質分解に関与する遺伝子の発現を誘導します12,13。小胞体ストレス中、IRE1はHSPA5から解離し、多量体化し、自己リン酸化する14。IRE1のリン酸化は、そのRNaseドメインを活性化し、X-box結合タンパク質1(XBP1)のmRNAの中央部分からの26ヌクレオチドのスプライシングを特異的に媒介します15,16。これにより、トランス活性化機能を付与する新規のC末端が生成され、機能的なXBP1sタンパク質、いくつかの小胞体ストレス誘発遺伝子を制御する強力な転写因子が生成されます17,18。これらの転写因子の複合的な活性は、ERの恒常性を回復することを目的とした遺伝的プログラムのスイッチを入れます。

小胞体ストレスとUPRを検出するには、さまざまな方法があります。これらには、UPRマーカーを分析する従来の方法が含まれる19,20。従来とは異なるさまざまな方法には、UPRの酸化還元状態と小胞体内腔内のカルシウム分布の測定、小胞体構造の評価などがあります。電子顕微鏡法を使用して、細胞や組織の小胞体ストレスに応答して小胞体内腔がどれだけ拡大するかを確認できます。ただし、この方法は時間がかかり、電子顕微鏡の利用可能性に依存しており、すべての研究グループが利用できるとは限りません。また、小胞体のカルシウムフラックスと酸化還元状態の測定は、試薬が入手可能であるため困難です。さらに、これらの実験から読み取られたものは非常に感度が高く、細胞代謝の他の要因の影響を受ける可能性があります。

UPR出力をモニタリングするための強力でシンプルな手法は、UPRのさまざまなシグナル伝達経路の活性化を測定することであり、さまざまなストレスシナリオで何十年にもわたって使用されてきました。これらの従来の方法でUPRの活性化を測定する方法は、経済的で実現可能であり、他の既知の方法と比較して短時間で情報を得ることができます。これには、IRE1、PERK、eIF2αのリン酸化、P50型のATF6を測定することによるATF6の切断、HSPA5、スプライシングXBP1、ATF4、CHOP、GADD34などの他のマーカーのタンパク質発現など、UPRマーカーのタンパク質レベルでの発現を測定するためのイムノブロッティング、mRNAレベルを測定するためのRT-PCRやXBP1 mRNAのスプライシングなどが含まれます。

この記事では、HIV-1感染細胞における小胞体ストレスとUPRの活性化をモニタリングし、HIV-1の複製と感染性におけるUPRの機能的関連性を判断するための、検証済みで信頼性の高い一連のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、入手が容易で経済的な試薬を利用し、UPR出力に関する説得力のある情報を提供します。小胞体ストレスは、折り畳まれていない/誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積の結果であり、タンパク質凝集体21を形成する傾向がある。ここでは、HIV-1感染細胞におけるこれらのタンパク質凝集体を検出する方法について説明する。チオフラビンT染色は、これらのタンパク質凝集体を検出および定量するために使用されている比較的新しい方法である22。BeriaultとWerstuckは、タンパク質凝集体、つまり生細胞の小胞体ストレスレベルを検出および定量するためのこの手法について説明しました。低分子の蛍光分子チオフラビンT(ThT)は、タンパク質凝集体、特にアミロイド線維に選択的に結合することが実証されています。

この記事では、ThTを使用してHIV-1感染細胞のERストレスを検出および定量化し、UPRのさまざまなシグナル伝達経路の活性化を測定することにより、UPRを従来のモニタリング方法と関連付ける方法について説明します。

HIV-1感染時のUPRの役割に関する包括的な情報も不足しているため、HIV-1の複製とビリオン感染性におけるUPRの役割を理解するための一連のプロトコルを提供します。これらのプロトコルには、レンチウイルスを介したUPRマーカーのノックダウン、および薬理学的ERストレス誘導剤による治療が含まれます。この記事では、長末端反復(LTR)ベースのルシフェラーゼアッセイ、p24酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、β-galレポーター染色アッセイなど、HIV-1遺伝子発現、ウイルス産生、および産生されたビリオンの感染性を測定するために使用できるリードアウトの種類も示しています。

これらのプロトコルの大部分を使用して、我々は最近、HIV-1感染がT細胞23のUPRに対する機能的意味合いを報告しており、その論文の結果は、ここで述べた方法の信頼性を示唆している。したがって、この記事では、HIV-1と小胞体ストレスおよびUPR活性化との相互作用に関する包括的な情報を提供する一連の方法を提供します。

プロトコル

注:ここで使用される細胞株は、HEK-293TおよびJurkat J6(CD4 + T細胞株)であり、これらはインドのプネーにあるNCCSのCell Repositoryから入手しました。TZM-blは、HIV-1長末端反復(LTR)プロモーター24 およびCEM-GFP(別のCD4+ Tレポーター細胞株)25 の下にβ-ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ遺伝子のコピーを統合したHeLa由来細胞株であり、NIH AIDS Repository(米国)から入手した。

1. HIV-1ウイルスストックの調製と保管

  1. HIV-1ウイルスストックの調製
    注:HIV-1を含むすべての実験において、世界保健機関(WHO)または疾病管理予防センター(CDC)のマニュアルに記載されているバイオセーフティ関連の国際ガイドラインを実践することをお勧めします。ウイルスの取り扱いおよび生きたウイルスの実験は、少なくともBSL2レベルの封じ込め実験室に収容された適切なバイオセーフティキャビネットでのみ行われるべきです。リン酸カルシウム哺乳類トランスフェクションキットを使用した感染性HIV-1粒子の産生は、プロトコルのこのセグメントで説明されています。
    1. HEK-293T細胞を90 mm皿に10 mLの完全(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)DMEM(ダルベッコの改変イーグル培地)をクラスIIタイプA2バイオセーフティキャビネットに播種し、細胞のコンフルエンスが50%〜60%になるように37°Cの組織培養インキュベーターで約12時間保持します。
    2. 翌日、トランスフェクションミックスを調製します:滅菌バッファーに25 μgのpNL4.3(HIV-1の分子クローン)プラスミドDNAを含む溶液A、86.8 μLの2 M CaCl2、 および残りの滅菌水を含む溶液Aを調製して、各プレートの最終容量を700 μLにします。1プレートに対して、2x HEPES緩衝生理食塩水(HBS)700 μLを含む溶液Bを調製します。次に、プレートの合計数の計算を調整します。
    3. 次に、ソリューション B をソリューション A にドロップワイズ方式で追加し、ソリューション A を連続的にボルテックスします。トランスフェクションミックスの総容量は、1プレートあたり1.4 mLになります。
      注:溶液Bを溶液Aに正確に滴下しながら連続的にボルテックスすると、完全なトランスフェクション複合体が形成されます。
    4. この混合物を室温(RT)で約20分間インキュベートします。次に、新鮮な9 mLの完全なDMEMを含む各プレートに混合物をゆっくりと滴下し、プレートをCO2 インキュベーターに移します。8〜10時間後、既存の培地を新鮮な10 mLの完全なDMEMと交換します。
    5. メディア交換後24時間後、円錐形のチューブ内のすべてのプレートから上清(ウイルス粒子を含む)を収集します。.低速卓上遠心分離機(Table of Materials)を使用して、600 x gで5分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。
    6. 上清をポリアロマー超遠心チューブに移し、超遠心分離機のスイングアウトローターに入れます(材料表)。チューブホルダーの重量のバランスを確認し、必要に応じて滅菌培地で調整します。
    7. 1,41,000 x g で4°Cで2.5時間超遠心分離します。 この後、チューブを慎重に取り出し、バイオセーフティキャビネット内で上清をゆっくりとデカントします。
    8. 各チューブ内のペレット(現在は濃縮されたウイルス)に、不完全なRPMI(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート)1640培地1mLを加え、激しいピペッティングを行ってペレットを取り除きます。
      注:超遠心分離後のペレットは、肉眼ではほとんど見えません。そのため、ペレットが適切に外れるように、チューブの中央にRPMI 1640を追加する必要があります。
    9. 次に、1 mLのウイルス懸濁液に25 μLの1 M HEPES pH 7.4を加えます。懸濁液50μLを1.5 mLの遠心分離チューブに分注し、すぐに-80°Cの冷凍庫に保管して長期保存します。
  2. ウイルス濃度とビリオン感染力の定量
    注:ウイルスの感染力を計算するには、まずその濃度を定量化することが不可欠であり、これはp24抗原捕捉ELISAによって行われます(製造元の指示に従っているため、ここでは説明されていません; 資料の表を参照)。このプロセスは、ウイルスの濃度をストックのマイクロリットル当たりナノグラム(ng/μL)で与え、次いで、TZM-blレポーター細胞26における以下の実験を通じてストック中の感染性ビリオン数を同定するために使用される。
    1. 各ウェルに500 μLの完全なDMEMを使用して、24ウェルプレートで0.1 x 106 TZM-bl細胞をカウントして播種し、細胞培養インキュベーターで10〜12時間保持します。
    2. ウイルス定量のための感染を開始する前に、細胞が50%〜60%コンフルエントであることを確認してください。既存の培地を250 μLの新鮮な完全DMEMで各ウェルに交換します。
      注意: 実験的な障害を除外するために、ポジティブコントロールをしっかりと保ちます。
    3. 感染に必要なストックウイルスの量を1 ng、0.1 ng、0.01 ngの重複で計算します。ウェルに適切な量のウイルスを加え、プレートをインキュベーター内で37°Cに4時間保持します。
    4. 細胞を500 μLの不完全なDMEMで2回洗浄し、次に500 μLの完全DMEMを添加します。
    5. 培地交換の36時間後にβガロン染色手順に進みます。
      1. 既存の培地を廃棄し、1mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに500μLの固定溶液(PBS中の0.25%グルタルアルデヒド)を加えて細胞を固定し、バイオセーフティキャビネット内でRTで5〜7分間インキュベートします。
      2. 表1に示すように染色液を調製します。X-galは光に弱いため、光から遠ざけてください。
      3. 細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。調製したばかりの染色液500μLで細胞を覆い、暗所で37°Cで2〜18時間インキュベートします。
      4. その後反応を停止するには、PBS中の500 μLの3%ジメチルスルホキシド(DMSO)で細胞を2回すすぎ、その後、細胞を500 μLの新鮮なPBSに保ちます。
      5. 青色の感染細胞( 図1Aを参照)を顕微鏡下で10倍に拡大し、5つのランダムフィールドをカウントします。5 つのフィールドの平均カウントを取り、それにフィールド係数と希釈係数を掛けます。これにより、ウイルスストック中の感染性ビリオン粒子が定量化されます。
        注:24ウェルプレートの場合、電界係数は75です。
コンポーネント準備必要量
PBSの10x PBSのストックから1x PBSを調製します14ミリリットル
カリウムフェリフェロシアン化物0.82 gのフェリシアン化カリウムと1.06 gのフェロシアン化カリウムを25 mLの1x PBSに溶解します0.75ミリリットル
塩化マグネシウム1 mL 中 1 M の 1x PBS15μL
X-ギャル30 mgを0.6 mLのN、N-ジメチルホルムアミド(暗所)に溶解します0.3ミリリットル
合計 = 15 mL

表1:TZM-bl細胞のβ-gal染色に必要な成分のリスト。

2. T細胞株のHIV-1感染

  1. 不死化T細胞株を解凍し、培養します。この研究では、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 500 μg/mL G418 を添加した完全 RPMI 1640 培地で培養した CEM-GFP 細胞株を使用しました。
  2. 各時点(未感染、24時間、48時間、72時間、96時間)で200万個の細胞をカウントして採取します。100 x g で5分間遠心分離して未感染の細胞を直ちに回収し、細胞溶解バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.12 M NaCl、5 mM EDTA、0.5% NP40、0.5 mM NaF、1 mM DTT)を添加し、プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)および1xホスファターゼ阻害剤(1〜300万細胞で50 μL)を添加するか、Trizol試薬(1〜300万細胞で1 mL)で溶解してRNA単離( 表を参照)します(表を参照)。マテリアル)。
  3. ポリブレン(5 μg/mL)を含む1 mLの完全RPMI 1640培地で1 mL、100 x g 、室温で5分間、細胞を1 mLの完全培地に再懸濁します。
    注:ポリブレンは、哺乳動物細胞のレトロウイルス感染を促進するために使用されるカチオン性ポリマーです。
  4. 800万個の細胞を、完全培地を含むポリブレン1 mLに再懸濁します。次に、400万個のビリオン粒子に必要なウイルスストックの量を計算し、ウイルスストックを添加し、完全な培地を追加することで総量を2 mLにします。これにより、MOI は 0.5 になります。
  5. CO2 インキュベーター内の細胞を37°Cで4時間保持し、30〜45分ごとに断続的にタッピングします。
  6. 4時間後、細胞をスピンダウンし、上清をバイオセーフティキャビネット内に慎重に廃棄し、適切な廃棄方法を使用します。
    注:このステップ以降、細胞を100 x g でRTで5分間遠心分離します。
  7. 細胞を1 mLの不完全培地で2回洗浄します。細胞を8 mLの完全培地に再懸濁し、100万細胞/mLにします。
  8. 6ウェル組織培養プレートで、必要な数のウェルに同数の細胞を播種し、プレートを37°Cに維持されたCO2 インキュベーターに保持します。
  9. 次の4日間は、細胞溶解バッファーを添加して、24時間ごとに細胞を回収します。また、上澄み液を回収し、すぐに-80°Cの冷凍庫に移します。
  10. 感染が起こったかどうかを確認するには、すべての時点のp24抗原捕捉ELISAに進みます。その時点に対して適切な希釈、すなわち、最初の時点に対しては低く、1:50から1:500までの範囲の後の時点に対しては高い希釈を行います。感染の進行を示すグラフに測定値をプロットします(図1B)。

3. 小胞体ストレスを測定するためのチオフラビンT染色

  1. 非感染細胞と 0.5 MOI 感染した CEM-GFP 細胞 (72 時間感染細胞を採取) をそれぞれ 100 万個ずつ、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド 200 μL で RT で 20 分間固定します。
  2. 細胞を100 x g で5分間ペレット化し、500 μLの0.1 Mグリシンで5分間処理した後、500 μLのPBSで2回洗浄します。細胞を100 μLのPBSに再懸濁します。
  3. スライドガラス、フィルターカード、サンプルチャンバーを組み立てます。100 μLの再懸濁細胞をサンプルチャンバーに加え、細胞を1000 x g で4分間回転させて、細胞遠心分離機で細胞をスライドに接着します(材料表)。
    注:細胞懸濁液が希釈されすぎると、細胞遠心分離後のスライド上に十分な細胞が固定化されません。細胞懸濁液が非常に濃縮されている場合、細胞は凝集し、細胞遠心分離後に分布しなくなる可能性があります。
  4. 0.1% Triton-X-100 in PBS(細胞が付着した領域を覆うのに十分)を滴下して細胞を10分間透過処理し、滴下PBSを入れて細胞を2回洗浄し、スライドを傾けてPBSを組織で拭き取ります。
  5. 細胞を10 μLの5 μMチオフラビンTと30分間インキュベートします。
    注:ThTでインキュベートした後は洗わないでください。
  6. 5 μLの封入剤(80% glycerol v/v、20% PBS v/v、および8 mg/mL 1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン[DABCO])を使用してスライドをマウントし、カバースリップを入れ、マニキュアを使用してカバースリップを密封します。スライドを乾かしておきます。
    注意: これらすべての手順で、セルが乾かないようにしてください。
  7. 共焦点顕微鏡で63倍グリセロール液浸レンズを使用して、固定細胞の共焦点画像を撮影します( 材料の表を参照)。GFP(Ex.494 nm, Em. 519 nm)およびThT(Ex.458 nm, Em.480-520 nm)の励起および発光設定を調整します。
    注:各蛍光チャンネルは、チャンネルのオーバーラップを避けるために、同時にではなく、順番にイメージングする必要があります。CEM-GFP細胞は、HIV-1感染時に発火するLTRプロモーターの調節下でGFPを持っているため、GFPはHIV-1感染の指標として採用されました25。
  8. 蛍光画像を8ビットに変換してから、閾値解析で定量化します。Image J (~50 cells) 27 のようなソフトウェアを使用して、各細胞の強度を手動で定量化します。各セルの強度を Y 軸上の点として、非感染および感染の基準に対するグラフをプロットします。
  9. このプロトコルの有効性を実証するために、ポジティブコントロール、例えば、この場合はタプシガルギン治療(既知のERストレス誘導剤)を取ります28。100万個のCEM-GFP細胞を、それぞれ1μLのDMSO(ビヒクルコントロール)と100nMのタプシガルギンで12時間処理します。
  10. 細胞を採取し、感染したサンプルについて述べたようにThT染色を処理します(ステップ3.1-3.8)。
    注:これらのサンプルでは、GFP蛍光は必要ありません。したがって、共焦点顕微鏡ではThT蛍光のみが捕捉されます。

4. 各種UPRマーカーの活性化と発現の判定

注:UPRマーカーの発現を決定するために、イムノブロッティングとRT-PCRの2つの方法が使用されます。イムノブロッティングでは、感染後さまざまな時点(感染後24時間、48時間、72時間、96時間)で0.5 MOI HIV-1に感染したCEM-GFP細胞を回収し、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁します(ステップ2.2で述べたとおり)。あるいは、RT-PCRの場合、細胞ペレットをTrizol試薬(1〜300万個の細胞に対して1mL)で溶解します( 材料の表を参照)。溶解バッファーおよびTrizol試薬に再懸濁した細胞は、さらに使用するまで-80°Cで保存できます。

  1. UPRマーカーの分析のためのイムノブロッティング。
    1. 再懸濁した細胞を氷上の溶解バッファーに45分間保持し、ボルテックスを使用して断続的に混合します。
    2. ベンチトップ高速遠心分離機を使用して、細胞を18000 x g で15分間ペレット化します( 材料の表を参照)。上清を新しいチューブに集めます。
    3. Bradfordまたは類似の試薬を使用して、各サンプル中のタンパク質濃度を定量します。
    4. 各サンプルに等濃度のタンパク質を採取し、Laemmli バッファー (6x バッファー: 250 mM Tris-Cl pH 6.8、10% SDS、30% グリセロール、0.02% ブロモフェノール ブルー、5% β-メルカプトエタノール) でタンパク質サンプルを調製します。
      注:各UPRマーカーのイムノブロッティングには、最低60〜80μgのタンパク質を使用しました。
    5. タンパク質サンプルを96°Cで5分間煮沸し、短時間遠心します。
    6. タンパク質サンプルを10%-12%SDS-PAGEゲルで分離し、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します( 材料の表を参照)。
    7. 5%脱脂粉乳またはウシ血清アルブミン(BSA)で1〜2時間ブロックし、TBST(20 mM Tris pH7.4および0.137 M NaCl、0.1% Tween 20)で2回洗浄し、UPRマーカーに対するタンパク質特異的一次抗体( 材料表を参照)をロッカーで4°Cで一晩プローブします。 TBSTでブロットを2回洗浄した翌日、それぞれの二次抗体で1.5時間プローブします。
    8. TBSTでブロットを再度洗浄し、ウェスタンブロットイメージング装置で化学発光検出基質( 材料表を参照)を使用してタンパク質バンドを可視化します。
  2. RTのPCR
    1. Trizol試薬を使用して細胞から全RNAを単離します( 材料の表を参照)。
    2. Moloney Mouseine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT) を使用して、等濃度の RNA から cDNA を調製します ( 資料の表を参照)。
    3. 遺伝子特異的プライマーを用いたqRT-PCRを用いて、HSPA5、スプライシングXBP1、ATF4、CHOP、GADD34のmRNA発現の調節を解析します(表2)。簡単に説明すると、cDNAテンプレート(100 ng)、5 μLのSYBR Green色素( 材料表を参照)、および各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーペアの10 pmolを含む10 μLの反応混合物を調製します。滅菌H2Oを使用して容量を調整します。
    4. 次のプログラムを使用して、リアルタイムPCRマシンで混合物を実行します:初期変性を95°Cで3分間、95°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで30秒間の40サイクル、その後、メルトカーブ分析を行います。ハウスキーピング遺伝子(β-Actinなど)に対する標的遺伝子発現の倍率変化を次のように計算します。
      倍率変化 = 2-Δ(ΔCT)
      ここで、ΔCT = CT (ターゲット) − CT (ハウスキーピング遺伝子)
      およびΔ(ΔCT)=ΔCT(処理済み)-ΔCT(コントロール)
    5. XBP1のスプライシングをさらに確認するには、非感染サンプルと72時間感染サンプルで半定量的RT-PCRを実施します。
      注:XBP-1 mRNAのスプライシングは、スプライス部位全体でRT-PCRを使用して研究されます。
    6. 以下の条件下で、ハイフィデリティPCRマスターミックス(材料表を参照)を用いてXBP1プライマー(表2)でcDNAを増幅します:98 °Cで30秒、続いて98 °Cで15秒、65*Δ-5 °Cで30秒、72 °Cで30秒、続いて98 °Cで15秒のサイクルを30回行い、続いて98 °Cを30サイクルで15秒、 55 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒、その後 72 °C で 10 分間延長し、4 °C で保持します。
    7. 50 ng のエチジウムブロマイド/mL を含む 2.5% アガロースゲルでアンプリコンを分離し、ゲル doc 装置で可視化します。スプライシングされたXBP1バンドは、26ヌクレオチド小さくなります。

5. UPRマーカーのノックダウンとHIV-1 LTRによる遺伝子発現とウイルス産生の解析

  1. UPRマーカーのノックダウンのためのshRNAコンストラクトの調製
    1. pLKO.1-TRCベクターバックボーン(レンチウイルスクローニングベクター)を使用してshRNAコンストラクトを作製する29。
    2. 各遺伝子(IRE1、PERK、ATF6、HSPA5)に対して2つのshRNAコンストラクトを構築します。それぞれの遺伝子のmRNAを標的とするセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAiコンソーシアム(https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library)によって設計されています(表3)。
      注:同様に、shRNAコンストラクトは他のUPRマーカーに対して作製することができます。
    3. プライマー(順方向と逆方向各100 nM)を95°Cでアニールし、続いてRTまで徐々に冷却します。
    4. 次に、T4 DNAリガーゼを使用して、pLKO.1ベクターの Age1 および EcoRI 部位にライゲーションします( 材料の表を参照)。DNAシーケンシングにより配列を確認します。
      注:LacZ遺伝子を標的とするshRNAコンストラクトは、非標的制御として使用されます。
  2. HEK-293T細胞におけるPERK、ATF6、IRE1、HSPA5のノックダウン、ルシフェラーゼアッセイ、p24 ELISA
    1. shRNAコンストラクト(0.9 μg)とトランスフェクション試薬様ポリエチレンイミン(PEI)(DNA1 μgに対してPEI3 μL)( 材料表を参照)を50 μLの無血清培地にボルテックスして調製し、20分間インキュベートします。
    2. フラスコを含むコンフルエントHEK-293T細胞から、トランスフェクションミックスとともに~0.25 x 106 細胞をトリプシン化して播種し、24ウェルプレートでトランスフェクションミックスを行い、総容量を125 μLにし、CO2 インキュベーターで37°Cで6時間インキュベートします。この方法はリバーストランスフェクションと呼ばれ、トランスフェクション混合物とともに細胞に播種されます。
    3. 6時間後、125 μLの完全培地をウェルに加え、細胞を再懸濁して均一に播種します。
      注:ノックダウン実験では、リバーストランスフェクション(ステップ5.2.1-5.2.3)により、shRNAとsiRNAの両方で効率が向上します。
    4. 24時間後、2回目のトランスフェクションを行います。pNL4-3 (100 ng)、pLTR-Luc (100 ng)、および pEGFP-N1 (50 ng) コンストラクトを PEI (1 μg の DNA に対して 3 μL の PEI) と混合した pNL4-3 (100 ng)、および pEGFP-N1 (50 ng) の混合物をボルテックスにより調製します。ミックスを室温で20分間インキュベートし、既存の培地を250μLの新鮮な不完全培地と交換し、ミックスを細胞に加えます。
      注:HIV−1 LTRのレポーターベクターは、pU3RIII30,31からpGL3basicへのLTRを以前の研究室でサブクローニングすることによって開発された32。pEGFP-N1を用いたGFP発現を利用して、トランスフェクション効率を正常化した32。
    5. トランスフェクション後6時間後に、500 μLの完全DMEMで培地を交換します。36時間後に細胞を回収し、イムノブロッティングおよびルシフェラーゼアッセイを行います。
    6. ルシフェラーゼアッセイでは、細胞をペレット化し、市販のルシフェラーゼ基質(50 μL)に再懸濁します( 材料の表を参照)。再懸濁した細胞ライセートを不透明な96ウェルプレートに加え、10〜15分間インキュベートします。ルシフェラーゼの読み取り値をルミノメーターで取得します。また、同じサンプル中のGFP蛍光を測定し、マイクロプレートマイクロモードプレートリーダー(例:494 nm、Em:519 nm)でルシフェラーゼの読み取り値を正規化します。
    7. グラフをY軸上にルシフェラーゼユニット/GFPとしてプロットします。
      注:それぞれのUPRマーカーのノックダウンはチェックする必要があり、それはそれぞれ遺伝子特異的抗体またはプライマーを使用したイムノブロッティングまたはqRT-PCRのいずれかによって行うことができます。
    8. 上記のように、p24 ELISAを処理するために上清を収集します。
  3. UPRマーカーのノックダウンとHIV-1感染による安定細胞の作製。
    1. 6ウェルプレートに播種したHEK-293T細胞に、それぞれのshRNA(1 μg)コンストラクト、pMD2.G(VSV-Gエンベロープベクター)(0.75 μg)、およびpsPAX2(レンチウイルスパッケージングプラスミド)(0.25 μg)( 材料表を参照)をトランスフェクションし、DNA1 μg:PEI3 μLの比率でPEIを使用して、レンチウイルス粒子を調製します。100 μLの不完全DMEMに混合物を調製し、室温で20分間インキュベートし、播種したHEK-293T細胞の1.8 mLの完全培地に混合物を加えます。
      注:トランスフェクションの少なくとも12時間前に、HEK-293T細胞を6ウェルプレートに播種し、形態を獲得し、約60〜70%コンフルエントになるまで投与します。
    2. トランスフェクションの24時間後、各ウェルに1 mLの完全DMEMを添加します。
    3. 48時間後に上清を回収し、-80°C冷凍庫で保存し、p24 ELISAを実行してこれらの上清中のウイルスの存在を確認します。この粗レンチウイルス上清は、J6細胞の形質導入に使用します。
    4. 200万個の細胞を6ウェルプレートに同量のレンチウイルス上清(500 μL)を各コントロールおよび遺伝子特異的ノックダウンレンチウイルスでインキュベートし、ポリブレン(5 μg/mL)の存在下で新鮮な完全RPMI 1640培地を添加して容量を2 mLにします。
    5. 24時間後、各ウェルにピューロマイシン(1 μg/mL)を添加して、安定な細胞を選択します。ピューロマイシンを添加した後、24時間ごとに細胞をペレット化し、ピューロマイシンを含む2mLの新鮮な培地を添加します。
    6. これを細胞死がなくなるまで(~1週間)行います。生き残った細胞は、目的の遺伝子ノックダウンを持つ安定した細胞です。
      注:それぞれの遺伝子のノックダウンは、定期的にチェックでき、最後に、イムノブロッティングまたはqRT-PCRを使用して、ピューロマイシン含有培地で生存細胞のみが見える場合にチェックできます。
    7. セクション2で説明したように、LacZおよび遺伝子特異的ノックダウン細胞に0.5 MOIのHIV-1を感染させ、感染後48時間で細胞を採取します。
    8. 各サンプルから上清を採取し、前述のようにp24-ELISAを処理し、細胞を処理してイムノットダウンレベルを確認します。

6. 小胞体ストレス誘発剤による治療とHIV-1複製への影響の解析

注:HIV-1複製中のUPRの過剰刺激の影響を判断するために、薬理学的誘導分子であるThapsigarginを使用することができます。

  1. Thapsigargin処理時の細胞生存率の決定。
    注:タプシガルギンの細胞毒性は、MTT試薬によって決定されます( 材料の表を参照)。
    1. 100 μLの完全RPMI 1640を含む96ウェルプレートに、ウェルあたり25,000〜30,000個のCEM-GFP細胞を播種します。100 nM Thapsigarginを培地に加え、インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
      注:1 μL の DMSO で処理した細胞をビヒクルコントロールとして採取しました。
    2. 48時間後、各ウェルに10 μLのMTT(5 mg/mL)を加え、暗所で4時間インキュベートして、37°Cで5% CO2を含むホルマザン結晶を形成します。
    3. 4時間後、100 μLのイソプロパノールを使用して結晶を溶解して紫色を形成し、分光光度計を使用して570 nmでの吸光度を測定します。
    4. 以下の式に基づいて細胞生存率を計算します
      % 細胞生存率 = (コントロールOD570 - 処理OD570)/コントロールOD570 x 100
  2. タプシガルギンの前処理とp24ELISAによるHIV-1感染進行の分析。
    1. 1 mLの完全RPMI 1640を含む12ウェルプレートに100万個のCEM-GFP細胞を播種し、37°Cに維持したCO2 インキュベーターで100 nMのThapsigarginまたは1 μLのDMSO(ビヒクルコントロール)で細胞を12時間処理します。 12時間後、細胞を完全なRPMI 1640で洗浄し、前述のように0.5MOIのHIV-1に感染させる。
    2. 感染後24時間、48時間、72時間など、さまざまな時点で細胞を回収し、イムノブロッティングを行います。
    3. 各サンプルから上清を採取し、前述のようにp24 ELISAを実行します。
    4. サンプル中のp24濃度をY軸、それぞれの時点をX軸としてグラフをプロットします。
    5. イムノブロッティングを使用して、任意のUPRマーカーのレベルを測定することにより、タプシガルギン治療による小胞体ストレス誘導を分析します。この研究では、マーカーとしてHSPA5を使用しました。

7. ビリオン感染性に対するUPRの効果を決定するためのTZM-bl β-gal感染性アッセイ

注:ビリオン感染性におけるUPRの役割を理解するために、ノックダウンからの上清およびThapsigarginによる治療は、p24 ELISAによって決定されたp24濃度に基づいて、セクション1.2に記載されているようにTZM-bl β-gal感染性アッセイに使用できます。

  1. 各サンプルから同濃度のp24をTZM-bl細胞に感染させ、βガロン染色を行います。顕微鏡下で青色の感染細胞を10倍の拡大で5つのランダムフィールドに対してカウントします。
  2. 上記の手順から、各サンプルの 5 つのフィールドの数を平均します。
  3. 以下で説明するように、フォールドチェンジを計算します。
    倍率の変化 = テストサンプルの青いセルの平均数/コントロールサンプルの青いセルの平均数。

結果

この研究では、T細胞におけるHIV-1感染時の in vitro ERストレスとUPR活性化を研究するための詳細なプロトコルについて説明しました(図2)。この研究では、HIV-1複製とビリオン感染性におけるUPRの機能的関連性を分析する方法についても説明しています(図3)。

そのために、HIV-1感染による小胞体ストレスを、チオフラビンTを染色して細胞内のタンパク質凝集体を観察することで解析しました。 図4Aに示すように、ThTの強度は、非感染細胞と感染細胞のタンパク質凝集体を表します。同様に、ポジティブコントロールとして、 図4B はThapsigargin処理細胞におけるThT染色を表しています。ThT強度の増加は、より多くのタンパク質凝集体の存在を示唆しており、これはERストレスの増加と相関しています。

さらに、この観察結果を検証するために、UPRマーカーの分析を含む、より一般的な方法が使用されました。UPRの活性化は、最初に一次エフェクター-IRE1、ATF6、およびPERKの活性化によって分析されました。IRE1の活性化は、 図5Aに示すように、感染後の異なる時点で採取された非感染細胞と感染細胞のライセートを免疫ブロッティングすることにより、リン酸化IRE1レベルを分析することによって測定しました。pIRE1/Total IRE1レベルの増加は、IRE1の活性化を示唆しています。同様に、PERKの活性化は、非感染細胞と感染細胞のリン酸化PERKのレベルによって測定されました(図5B)。ATF6の活性化は、イムノブロッティングによるATF6 P50型の発現レベルによって定量されました(図5C)。UPRのもう一つの重要な指標は、マスターレギュレーターとERシャペロンであるHSPA5です。HSPA5のレベルは、 図5Dに示すように、イムノブロッティングによっても分析されました。sXBP1、peIF2α、ATF4、CHOP、GADD34などの他のUPRマーカーについても、それらの特異的抗体を使用して同様のプロトコルを実行しました(補足図1)。XBP1 mRNAのスプライシングは、定量的RT-PCR(図5E)と半定量的RT-PCRの両方で解析できます。定量的RT-PCRはスプライシングを特異的に同定できなかったため、半定量的RT-PCRを使用したスプライシングアッセイと組み合わせました(図5F)。上記のプロトコルにより、qRT-PCRのデータがsemi-qRT-PCRのデータと一致することが観察されました。sXBP1に対して実施されたqRT-PCRと同様に、このプロトコルは、HSPA5、ATF4、CHOP、GADD34などのUPRの他のマーカーのmRNAレベルでの分析に使用されました(補足図2)

次に、HIV-1の複製とビリオン感染性におけるUPRの役割を調査するために、特定のUPRマーカーであるPERKとHSPA5のノックダウンを行いました。上記のプロトコルを使用して、HEK-293T細胞(図6A)とJ6細胞(図6B)の両方で、これらのマーカーのノックダウンを有意なレベルまで達成しました。これらのノックダウン細胞を用いて、HIV-1 LTR駆動遺伝子活性(図6A)のノックダウンの影響を調査しました(これは、それぞれのサンプルでLuc/GFP発現比として表されます)。ウイルス産生は、 図6Bに示すように、上清のp24 ELISAによって測定されました。産生されたビリオンの感染性は、 図1Aに示すように、βガロン染色プロトコルを使用して分析することもできます。

さらに、小胞体ストレスの化学的誘導剤であるThapsigarginを使用して、HIV-1複製、ウイルス産生、およびビリオン感染性に対するUPRの過剰刺激の影響を研究することができます。所与の濃度におけるタプシガルギンの細胞毒性をMTTアッセイを用いて分析した(図7A)ことから、所望の濃度における細胞毒性は有意ではないことが示された。小胞体ストレスに対する薬物の影響を分析するために、HSPA5のイムノブロッティングを行いました(図7B)。その結果、100 nM Thapsigargin の 12 時間前処理により、すべての時点で HSPA5 の発現が誘導されたことが示されています。p24 ELISAは、ウイルス産生への影響と産生されたビリオンの感染性を示しており、これは前述のように解析することができます。

figure-results-1
図1:ビリオン感染性の定量化と感染進行の分析(A)TZM-blベースのβ-galアッセイによるビリオン感染性の定量。ウイルスの感染力は、TZM-bl細胞に1 ng、0.1 ng、および0.01 ngのウイルスを添加し、続いてβガロン染色して青色細胞の数をカウントすることによって決定しました。倍率:10倍 (B) 培養上清のp24抗原捕捉ELISAに基づく0.5 MOI HIV-1感染CEM-GFP細胞の感染進行の分析。CEM-GFP細胞に0.5MOIのHIV-1を感染させ、上清をp24 ELISAに処理しました。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。アスタリスクは有意水準を示し、スチューデントのt検定で分析されたns=p≥0.05、*=p≤0.05、**=p ≤ 0.01、*** = p ≤ 0.0001、****=p ≤ 0.0001として図で示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:小胞体ストレスとUPRに対するHIV-1感染の影響を分析するために従うべき手順の概略図。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:HIV-1の複製、ウイルス産生、およびビリオン感染性に対するUPRの影響を分析するために従うべきステップのフローチャート。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:ThT染色を用いたHIV-1感染によるT細胞の小胞体ストレスレベルの解析 (A)CEM-GFP細胞に0.5MOIのHIV-1を感染させ、感染後72時間で採取した。細胞を固定し、チオフラビンT.GFPで染色したGFP発現は、感染したCEM-GFP細胞を示しています。グラフは、非感染細胞とHIV-1感染細胞の場合のチオフラビンTの強度を示しています。n = 3 回の生物学的複製からの ~50 個の細胞からのデータがグラフに表示されます。(B)CEM-GFP細胞をDMSOおよびTGで12時間処理した。細胞を固定し、チオフラビンTで染色しました。グラフは、DMSOおよびTG処理細胞の場合のチオフラビンTの強度を示しています。n = 3 回の生物学的複製からの ~50 個の細胞からのデータがグラフに表示されます。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。アスタリスクは有意水準を示し、スチューデントの t検定で分析されたns=p≥0.05、*=p≤0.05、**=p ≤ 0.01、*** = p ≤ 0.0001、****=p≤0.0001として図で示されています。国連:感染していない;IN:感染しています。TG:タプシガルギンです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:HIV-1感染T細胞における異なるUPRマーカーの発現の解析 (A-E) HIV-1(0.5 MOI)感染したCEM-GFP細胞を4日目まで24時間ごとに採取し、以下に述べる種々の解析のために処理した。(A)IRE1の免疫ブロッティングによりIRE1の活性化を解析した。(B)PERKの活性化は、pPERKの免疫ブロッティングによって分析されました。(C)ATF6 P50型を免疫ブロッティングすることにより、ATF6の活性化を解析した。(D)小胞体シャペロンHSPA5の発現を免疫ブロッティングHSPA5により解析した。(E)XBP1のスプライシングを、特異的なリアルタイムプライマーを用いたsXBP1のqRT-PCRにより解析した。(F)semi-qRT-PCRによるXBP1のスプライシング解析のため、スプライス部位を横切るRT-PCRを用いてXBP-1 mRNAを増幅し、バンドを可視化した。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。国連:感染していません。IN:感染しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:HIV-1の複製とウイルス産生に対するUPRの役割の解析 (A)HEK-293T細胞でPERK(左パネル)とHSPA5(右パネル)をノックダウンし、HIV-1 LTR駆動遺伝子活性を解析するためにルシフェラーゼアッセイを行った。イムノブロットは、それぞれのタンパク質のノックダウンレベルを示しています。(B)J6細胞でPERK(左パネル)とHSPA5(右パネル)をノックダウンし、上清を採取してp24 ELISAを行い、ウイルス産生を解析した。イムノブロットは、それぞれのタンパク質のノックダウンレベルを示しています。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。アスタリスクは有意水準を示し、スチューデントの t検定で分析されたns=p≥0.05、*=p≤0.05、**=p ≤ 0.01、*** = p ≤ 0.0001、****=p ≤ 0.0001として図で示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図7:HIV-1感染の進行に対する化学的小胞体ストレス誘導剤Thapsigarginの影響の分析 (A)100 nM Thapsigarginで処理した場合のCEM-GFP細胞の細胞生存率。細胞生存率はMTTアッセイによって分析されます。(B)100nMのTGで12時間前処理したCEM-GFP細胞を0.5MOIのHIV-1に感染させ、感染後24時間、48時間、および72時間の時点で回収した。イムノブロットはHSPA5の発現に対するTGの影響を示し、グラフはp24 ELISAで解析したウイルス産生を示しています。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。アスタリスクは有意水準を示し、数値では ns = p ≥ 0.05、* = p ≤ 0.05、** = p ≤ 0.01、*** = p ≤ 0.001、****= p ≤ 0.0001 として示されます。TG:タプシガルギンです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:UPRのさまざまな下流マーカーの発現の解析。 イムノブロッティングにより分析した(A)sXBP1、(B)eIF2αのリン酸化、(C)ATF4、(D)CHOP、および(E)GADD34の発現。(ア-E)0.5MOIのHIV-1に感染したCEM-GFP細胞を、感染後24時間、48時間、72時間、および96時間後に回収し、イムノブロッティングに使用した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:qRT-PCRによるmRNAレベルでのさまざまなUPRマーカーの分析。 (A-D)0.5MOIのHIV-1に感染したCEM-GFP細胞を4日目まで24時間ごとに採取し、(A)HSPA5、(B)ATF4、(C)CHOP、および(D)GADD34のqRT-PCRに使用した。エラーバーは、平均± S.E 値として表示されます。アスタリスクは有意水準を示し、数値では ns = p ≥ 0.05、* = p ≤ 0.05、** = p ≤ 0.01、*** = p ≤ 0.001、**** = p ≤ 0.0001 として示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

建てるプライマー配列 5' から 3'
XBP1 スプライシングアッセイ FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 スプライシング アッセイ RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
スプライスXBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
スプライスXBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FのCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RのTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FのAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RのGAAGGTCATCTGGCATGGTT
チョップFCAGTCCCGAAGGAGAAG
チョップRCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 F型ATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCタグGCT
アクチンFAGAAAATCTGGCACCACACCの
アクチンRGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

表2:RT-PCR分析に使用したプライマーのリスト。 F: フォワード;R:リバース

shRNAコンストラクトプライマー配列 5' から 3'
パークSH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
パークSH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
パークSH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
パークSH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG
アイル1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
アイル1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGTTTTG
アイレ1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
ラックZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
ラックZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

表3:shRNAコンストラクトの生成に使用したプライマーのリスト。 F: フォワード;R:リバース

ディスカッション

本プロトコルの範囲には、(i)HIV-1ウイルスストックの取り扱いとウイルス濃度とビリオン感染力の測定、(ii)T細胞のHIV-1感染と小胞体ストレスおよびUPRのさまざまなマーカーに対するその影響の評価、(iii)UPRマーカーのノックダウンの影響とHIV-1 LTR駆動遺伝子活性への影響、 ウイルス産生とビリオン感染性、および(iv)薬理学的分子を使用したUPRの過剰刺激とHIV-1複製に対するその影響の分析。現在の一連のプロトコルを使用して、HIV-1とUPRの相互作用に関する包括的な情報を得ることができます。この研究にリストされているプロトコルは、実行が容易で、費用対効果が高く、信頼性が高いです。

UPRはストレス感受性のシグナル伝達経路であるため、これに取り組むにはかなり繊細な手順が必要です。すべての実験において、結果の一貫性を得るために、長い継代細胞を避けることをお勧めします。また、細菌や酵母の汚染を避けるために、すべての細胞培養技術で無菌状態を維持することも重要です。これは、実験や対応する結果を妨げる可能性があるためです。また、実験中の細胞の取り扱いやその後の培養では、過酷な温度変化や長時間の温度変化を防ぎ、細胞が健康でストレスを受けていないことを確認しておきましょう。そうしないと、変更によってセルに追加のストレスが発生し、結果が変わる可能性があります。UPRは敏感なシグナル伝達経路であり、時間点のわずかな変化は結果を異なる可能性があるため、時間点をできるだけ固定するようにしてください。

タンパク質凝集体を検出し、小胞体ストレスの判定に用いられるThT染色法22は、HIV-1感染細胞の小胞体ストレスレベルを非常に明確に示しています。ThT染色は、ERストレスと相関するタンパク質凝集体の検出に基づいています。ただし、個々のUPRシグナル伝達経路はタンパク質凝集体の関与なしに直接活性化できるため、UPRの活性化は必ずしもタンパク質凝集体と相関するとは限らないことに注意する必要があります。したがって、このThT染色法は小胞体ストレスレベルのアイデアを提供しますが、UPR活性化の詳細な分析のためには、常にUPRマーカーのさらなる分析で検証する必要があります。また、ThT染色の細胞内局在をさらに定義するために、ERをマーキングする場合のKDELなどのマーカーを使用することができます。さらに、小胞体ストレスにより細胞のサイズや形状が変化するケースも多いため、細胞の面積も考慮してThT強度を定量化することができます。高感度で信頼性が高く、費用対効果の高い市販の遺伝子特異的抗体が利用できるようになったことで、ライフサイエンスの多くの側面に革命がもたらされ、細胞内のタンパク質レベルの分析が容易になりました。また、最近では、ブロット上のタンパク質バンドを視覚化し、定量を迅速かつ容易にするために、高感度タイプの装置が提供されています。したがって、UPRマーカーの活性化は、イムノブロッティングによって容易に分析できます。しかし、UPRマーカータンパク質の発現は比較的低いため、その発現を解析するためには、かなりの濃度のタンパク質を使用する必要があります。さらに、一次抗体の希釈は、非特異的結合やブロット中のバックグラウンドノイズを避けるために、使用する細胞内のタンパク質発現に基づいて適切に最適化する必要があります。また、に示すように、 図4C、ATF6抗体はポリクローナルであり、多数の非特異的なバンドを示します。これらの非特異的バンドをある程度減らすためには、洗浄と抗体濃度の適切な最適化が必要です。ブロットは、ブロッキング溶液、一次抗体、および二次抗体でのインキュベーション後に適切に洗浄し、バックグラウンドバンドと非特異的バンドを減らす必要があります。ブロットを現像する際には、得られた結果のパターンを適切に視覚化するために、バンドの過飽和を避ける必要があります。この分析法の記事で広く焦点を当てていることから、一般的なイムノブロッティング技術の詳細な分析法やトラブルシューティングには焦点を当てていません。ただし、MahmoodとYangによるメソッドの記事を参照することができます33 Ghoshらと同様に。34 同じために。今日では、RT-PCRは非常に一般的に使用される方法であるため、簡単に入手できるプライマーやRT-PCR装置は、特定のUPRマーカーを分析するためのデータを提供します。ただし、RT-PCR用のRNAおよびcDNAの調製には非常に感度の高い方法であり、サンプルやピペッティングの品質にわずかなばらつきがあると、読み出しに大きなばらつきが生じる可能性があるため、注意が必要です。DNAまたはタンパク質の汚染は、RNAサンプルから除去する必要があります。また、qRT-PCRでは、ピペッティングエラーを減らすために、常にサンプルをトリプリケートで採取してください。qRT-PCRに使用するDNAの濃度は、各サンプルのCT値が30未満になるように最適化する必要があります。30を超えるものは理想的ではないと考えられるためです。qRT-PCRでは、誤検出の読み出しを避けるために、常にネガティブコントロールを維持する必要があります。XBP1のスプライシングは、qRT-PCRとsemi-qRT-PCRの両方で解析できます。qRT-PCRはスプライシングを正確に示さないため、データを検証し、スプライシングされたXBP1とスプライシングされていないXBP1の相対的な比率を決定するために、常にqRT-PCRとは別にセミqRT-PCRを実施する必要があります。スプライシングされたXBP1とスプライシングされていないXBP1のサイズの差はわずか26 ntであるため、ゲルの分離にはより高い割合のアガロースゲルを使用する必要があります。また、バンドは低電圧でより長い期間で分解して、分離を改善する必要があります。XBP1のスプライシングを観察するために今日より一般的である別の方法は、 Pst1 cDNAの制限酵素消化とXBP1スプライシングのより良い可視化35.この方法は、HIV-1感染サンプル中のXBP1のスプライシングを可視化するためにも使用できます。イムノブロッティングとRT-PCRから得られた結果は、ThT染色結果の検証に使用できます。

図5に示す代表的な結果は、HIV-1感染時のUPR活性化が、図4に示すThT染色の増強と相関していることを示唆しています。しかし、イムノブロッティングとRT-PCRを使用してUPRを解析することには限界があり、厳密であること、そして個々のUPR遺伝子は非小胞体ストレス因子によって独立して修飾されるため、複数の遺伝子産物をモニタリングしなければならないことである。また、これらの方法では、さまざまなUPRマーカーを調べることで、ERストレスを間接的に測定します。そのため、ThT染色とイムノブロッティングおよびRT-PCRによるUPRマーカーの解析を併用することで、HIV-1感染がT細胞の小胞体ストレスとUPR活性化に及ぼす影響を解析することができます。

この記事の第2部では、UPRがHIV-1複製に及ぼす影響を理解するためのプロトコルについて説明します。この記事で説明したUPRマーカーのノックダウンに使用したリバーストランスフェクション法は、UPRマーカーの発現を有意に減少させることがわかりました。プロトコルに記載されているように、GFP蛍光を使用して、ルシフェラーゼアッセイのルシフェラーゼ読み取り値を正常化しました。しかし、多くの場合、特定の遺伝子トランスフェクションにより、GFPの読み取りも影響を受ける可能性があります36したがって、その場合、RFP、YFP、または総タンパク質濃度などの他の蛍光マーカーを使用して、ルシフェラーゼの読み取り値を正常化できます。また、TZM-bl細胞のように細胞が溶解しにくい場合には、ルシフェラーゼ基質を添加する前に追加の溶解試薬を添加することができます。結果に示されているように、ルシフェラーゼの結果 (図6A 左パネル)がp24 ELISAの結果と一致すると、PERK(図6B 左のパネル)、PERKノックダウンはHIV-1遺伝子活性とウイルス産生を大幅に減少させます。一方、HSPA5の場合、HSPA5のノックダウンはLTRによる遺伝子活性に影響を与えません(図6A 右パネル)ルシフェラーゼアッセイの結果に従って、p24 ELISA(図6B 右パネル)。このように、これらの結果は、異なるUPRマーカーがHIV-1 LTRによる遺伝子活性とウイルス産生に異なる影響を与える可能性があることを示唆しています。ELISAによって上清中に測定されたp24抗原は、主に培養上清中に放出されるウイルス粒子の濃度を示しています。したがって、研究者は日常的に、p24抗原捕捉ELISAの結果を、細胞上清でのウイルス産生の間接的な指標として使用してきました37.したがって、細胞内のルシフェラーゼアッセイと上清のp24 ELISAを併用して、HIV-1 LTR駆動遺伝子活性およびウイルス産生への影響を決定することができる。また、このプロトコルは、遺伝子特異的shRNAを使用して、HIV-1 LTR駆動遺伝子活性およびウイルス産生に対する他のUPRマーカーの影響を分析するために使用できます。p24 ELISAおよびルシフェラーゼアッセイの読み出しを含むすべての実験では、適切な希釈とインキュベーション時間が維持され、外れ値のカテゴリーに該当する値を考慮しないようにすることが重要です。たとえば、p24 ELISA を実行している間、OD450 0.1 から 2 の間の値が理想的と見なされます。HIV-1の複製におけるUPRの役割を調査する2つ目のアプローチは、小胞体ストレス誘導剤であるThapsigarginや小胞体ストレス阻害剤であるTUDCAなどの薬理学的分子を使用することです。これらの薬剤は、さまざまな状況でUPRを研究するために非常に一般的に使用されています38,39,40,41.この記事では、タプシガルギン治療のプロトコルを実証し、T細胞のHIV-1感染進行に対するその効果を分析しました。実験に薬剤を使用する前に、使用する細胞株の薬剤の用量範囲で細胞生存率をテストすることを強くお勧めします。特定の細胞株で~80%未満の細胞生存率を与える濃度は避けるべきです。さらに、細胞生存率アッセイでは、すでにストレスを受けている細胞は適切な読み出しを示さず、細胞の破片が濁りを引き起こして誤った読み出しを与える可能性があるため、常に健康な細胞を採取する必要があります。この研究で言及されているプロトコルは、感染後 72 時間にわたるウイルス複製に対するタプシガルギンの効果を示しており、時間の経過とともにウイルス複製に対する薬物の影響をよりよく理解できます。また、感染後12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間などの短い時間間隔で、薬物がウイルス複製に効果を示し始める最も早い時点をさらに分析することもできます。

UPRはタンパク質の分解および膜動態にも関与している42,43ので、UPRがビリオンの感染性に関与し得る可能性がある。細胞によって産生されるビリオンの感染性もまた、所与のプロトコルを用いて分析することができる。上記のプロトコルは、より生物学的に関連性のある研究のために、小胞体ストレスとUPRに対するHIV-1感染の影響、およびヒトPBMCにおけるその機能的関連性を判断するためにも使用できます。HIV-1感染におけるER-UPRの機能を理解することは、多くの重篤な疾患の発症への関与に対する認識が高まっているため、不可欠です。この一連の方法を使用して得られた情報は、HIV-1とUPRの間の相互作用の重要な理解を提供することにより、この未踏の分野に追加されます。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

インド政府バイオテクノロジー局国立細胞科学センター(National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of Institutional)の学内支援に感謝いたします。ATとADは、インド政府のバイオテクノロジー部門の国立細胞科学センターから博士号の研究支援を受けたことに感謝しています。DMは、インド政府のSERBからのJCボーズナショナルフェローシップに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルアミドバイオラド、米国1610107
AgaroseG-Biosciences、米国RC1013
過硫酸アンモニウムSigma-Aldrich、米国A3678
抗 ATF4 抗体Cell Signaling Technology、米国11815ウェスタンブロット検出 希釈-1:1000
抗 ATF6 抗体Abcam、英国ab122897ウェスタンブロット検出 Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897ウェスタンブロット検出 Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386ウェスタンブロット検出 Dilution-1:2000 
抗GADD34抗体Abcam, UKab236516ウェスタンブロット検出 希釈-1:1000
抗GAPDH抗体Santa Cruz Biotechnology, USAsc-32233ウェスタンブロット検出 希釈-1:3000 
抗HSPA5抗体Cell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516ウェスタンブロット検出 Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728Gウェスタンブロット検出 Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683ウェスタンブロット検出 Dilution-1:2000
抗 pIRE1 抗体Abcam, UKab243665ウェスタンブロット検出 Dilution-1:1000
抗pPERK抗体Invitrogen, USAPA5-40294ウェスタンブロット検出 Dilution-1:2000
抗ウサギHRP標識抗体Biorad, USA1706515ウェスタンブロット検出 Dilution- 1:4000
抗XBP1抗体Abcam, UKab37152ウェスタンブロット検出 Dilution-1:1000
ベンチトップ高速遠心分離機Eppendorf, USA5804Rローター - F-45-30-11
ベンチトップ低速遠心分離機エッペンドルフ(米国) 5702Rローター-A-4-38
ビスアクリルアミドバイオラド(米国1610201
ウシ血清アルブミン(BSA)MPバイオメディカルズ(米国160069
ブラッドフォード試薬バイオラド(米国) 5000006
CalPhos哺乳類トランスフェクションキットClontech(タカラバイオ)米国631312ウイルスストック調製
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061 化学発光検出基板
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062化学発光検出基板
共焦点レーザー走査顕微鏡Olympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen,USA'15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 Infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
倒立顕微鏡ニコン, 日本モデル: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
塩化マグネシウムSigma-Aldrich, USAM8266感染性アッセイ
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24抗原捕捉 ELISAキットABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
ホスファターゼ阻害剤Sigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878レンチウイルスクローニングベクター
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope
vector PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
ポリエチレンイミン(PEI) Polysciences, Inc., USA23966
フェリシアン化カリウムSigma-Aldrich, USA244023感染性アッセイ
フェロシアン化カリウムSigma-Aldrich, USAP3289感染性アッセイ
プロテアーゼ阻害剤Sigma-Aldrich, USA 
psPAX2Addgene, USA12260レンチウイルス包装プラスミド
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833安定細胞の選択
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
超遠心分離機BeckmanOptima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018感染性アッセイ
) ) 5056489001

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