モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

サマリー

ここでは、人工脂質膜において、光制御された可逆的なタンパク質パターンを高い時空間精度で生成するためのプロトコールについて説明する。この方法は、モデル膜に固定化されたタンパク質iLID(改良型光誘導ダイマー)の局所的な光活性化で構成され、青色光の下では、そのパートナータンパク質Nano(野生型SspB)に結合します。

要約

特定の時間に細胞膜でタンパク質が正確に局在化および活性化されることで、細胞の分極、移動、分裂など、多くの細胞プロセスが引き起こされます。したがって、人工細胞でそのようなプロセスを複製および制御するためには、細胞内分解能と高い時間制御でモデル膜にタンパク質をリクルートする方法が不可欠です。ここでは、光制御された可逆的なタンパク質パターンを脂質膜に高い時空間精度で作製する方法について説明する。この目的のために、光スイッチングタンパク質iLID(改良型光誘導性ダイマー)を担持脂質二重膜(SLB)および巨大単層小胞(GUV)の外膜に固定化します。局所的なブルーライト照射により、iLIDはパートナーのNano(野生型SspB)に結合し、Nanoに融合した任意の目的タンパク質(POI)を溶液からメンブレン上の照射領域まで動員することができます。このバインディングは暗闇でも可逆的であり、POIの動的なバインディングと解放を提供します。全体として、これは、青色光を使用して空間と時間でタンパク質の局在を高精度に制御するための柔軟で汎用性の高い方法です。

概要

細胞内領域内の細胞膜上にタンパク質パターンが形成されると、移動、分裂、局所的な細胞間コミュニケーションなど、数多くの生物学的プロセスが引き起こされます^1,2。これらのタンパク質パターンは、空間と時間で制御されており、非常に動的です。このようなタンパク質パターンを合成細胞で複製することは、それらから生じる細胞プロセスを模倣し、そのような調節が分子レベルでどのように機能するかをよりよく理解するために不可欠です。生細胞の膜で観察されるのと同様に、人工膜上にタンパク質パターンを生成する方法は、そのダイナミクスを捉え、正確な時空間制御を提供する必要があります。

さまざまな刺激の中で、光は最高の時空間制御といくつかの追加の利点を提供することで際立っています³。光による調整により、いつでも必要な領域を比類のない精度で照らすのは簡単です。さらに、光の強度とパルス幅の両方を調整できるため、光は高い調整性を提供します。また、可視光はタンパク質などの生体分子に対して無害であり、波長の異なる複数の機能にも対応することが可能です。したがって、可視光に基づく光応答型アプローチは、空間と時間におけるタンパク質パターンの制御された双直交的な調節のための有望な手段として浮上しています^4,5,6。光誘導性二量体として作用する光遺伝学の光切り替え可能なタンパク質ペアを利用することで、特定のタンパク質を膜にリクルートする簡単な方法が得られます。特に、iLID(Avena sativa由来の光スイッチング可能なLOV2ドメインに基づく改良型光誘導性ダイマー)とNano(野生型SspB)^7,8、青色光誘導性SpyTagシステム(BLISS)⁹、緑色光応答性タンパク質四量体^CarH10、およびPhyBとPIF6との間の赤色光誘導性相互作用との間の青色光トリガー相互作用を用いて、人工膜上にタンパク質パターンを形成することに成功しています¹¹。

iLIDとNano⁵ との間の光切り替え可能な相互作用は、青色光⁷を用いてモデル膜上のタンパク質をフォトパレートするために利用できることが実証されている。iLID/Nano相互作用は、暗闇でも可逆的で、非常に特異的で、生理学的条件下で機能します。巨大単層小胞(GUV)や担持脂質二重膜(SLB)などの脂質膜モデルにiLIDを固定すると、これらの膜へのNanoの光制御動員が可能になり、暗闇でも可逆的になります。特に、モデル脂質膜へのテザーとしてiLIDのN末端に無秩序なドメインを導入する(disiLIDと名付けられたタンパク質をもたらす)と、Nanoの動員効率と^{復帰ダイナミクスが向上する}ことが観察された8。

disiLID/Nano相互作用を用いることで、SLBやGUVの外膜上にNano-fused Protein of Interest(POI)の高コントラストパターンを生成する方法を開発しました。この方法により、優れた空間的および時間的分解能と高い可逆性を数分以内に実現するタンパク質パターンを作成できます。詳細なプロトコルは、人工膜にタンパク質を局所的にリクルートするプロセスの概要を示しています。具体的には、ビオチン-ストレプトアビジン(SAv)相互作用を通じて、SLBおよびGUV上にビオチン化バージョンのdisiLIDを固定化することによって達成されます。続いて、蛍光標識されたナノ(mOrange-Nano)を、青色光照射下でこれらのdisiLID官能化膜に動員します。私たちの実験プロトコルは、メンブレンへの局所的なタンパク質動員を達成するための簡単で適応性の高いアプローチを提供します。重要なことに、この方法論は、報告されているSLBおよびGUVインターフェースまたはmOrange-Nanoに限定されません。他のdisiLID官能化材料やNanoに融合したタンパク質に拡張することができます。

プロトコル

1. 実験の準備

1. ビオチン化ジシリド(b-disiLID)およびmOrange-Nano(材料表を参照)を、以前に報告された手順^7,8に従って発現および精製します。
2. 選択した脂質組成と濃度のガラスバイアルに脂質混合物を調製します。まず、脂質をクロロホルムに溶解して、1 mg/mL 濃度の最終脂質溶液を得ます。
   1. 脂質を混合して、94.9 mol% 2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、5 mol% 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンN-(キャップビオチニル)ナトリウム塩(DOPE-ビオチン)、0.1 mol% 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン(DiD)の組成を得ます( 材料の表を参照)。
      注:脂質混合物は、さまざまな比率、DOPE-ビオチン濃度、および/または異なる膜染料で調整できます。推奨されるDOPE-ビオチン濃度(5 mol%)により、次のステップで高密度ストレプトアビジン(SAv)層を形成できます。
3. 以前に報告された方法^7,8,12に従って、小さな単層小胞(SUV)を調製します。このステップでは、直径≤100nmのSUVを準備することをお勧めします。
4. この研究では、超音波処理法が採用されています。まず、ガラスバイアル内のクロロホルム溶液を窒素流で蒸発させながらバイアルを回転させ、薄い脂質膜を形成します。次に、真空下で少なくとも1時間残留クロロホルムを除去します。
   1. 乾燥フィルムを超純水で最終濃度1 mg/mLの脂質にボルテックスして再水和します。最後に、不透明な溶液が透明になるまで、得られた溶液を10分間超音波処理します。
      注:脂質混合物は、冷蔵庫の微量遠心チューブに最大2週間保管してください。最終的なSUVのサイズが100nm≤限り、さまざまなSUV調製方法(押出法など)も使用できます。

2. mOrange-Nanoによる機能化SLBの分散へのリクルートメント

1. μスライド式18ウェルガラスボトムチャンバー( 材料表を参照)の各ウェルに2 M NaOHを150 μL加え、室温で1時間インキュベートします。続いて、NaOHを除去し、ウェルを最初に150μLの超純水で3〜5回洗浄し、次に10 mM CaCl₂を含む150 μLのバッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)で3回洗浄します。
2. 調製したばかりの 15 μL の SUV (水にストック濃度 1 mg/mL) を 150 μL のバッファーと 10 mM CaCl₂ のウェルに加えると、バッファー中の SUV が約 10 倍に希釈されます。SUVを室温で30分間インキュベートします。インキュベーション時間後、ビオチン化SLBが形成されます。
3. 最初に溶液を除去し、その後各ステップで新しいバッファーを添加することにより、CaCl₂ を含まないバッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)でSLBを少なくとも7回洗浄します。各洗浄ステップに80μLのバッファーを使用することをお勧めします。
   注:SLBの最適な洗浄は、表面に触れずに新鮮な溶液を数回上下にピペッティングすることで得られます。新たに形成されたSLBを含むウェル内の溶液のピペッティングは、形成されたSLBを損傷する小さな気泡の形成を減らすために穏やかに行う必要があります。この瞬間から、SLBが乾燥するのを防ぐために、ウェルには十分な量のバッファーが含まれている必要があります。
4. ビオチン化SLBをSAvでさらに官能基化するためには、SAv溶液を最終濃度250 nMまで添加し、室温で30分間インキュベートします。その後、バッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)で少なくとも5回洗浄することにより、余分なSAvを除去します。
5. この瞬間から、光スイッチングタンパク質の望ましくない光活性化を避けるために、サンプルを保護赤色光の下に保管してください。b-disiILD( 材料表参照)をウェル中の最終濃度1 μMまで添加します。室温で30分間インキュベートした後、バッファーで少なくとも5回洗浄して余分なタンパク質を除去します。
6. mOrange-Nano( 材料表参照)を最終濃度200 nMまで添加し、サンプルをアルミホイルで覆って暗所に保ちます。
7. μスライドを蛍光顕微鏡の下に置き、イメージング設定を調整します。mOrange-Nanoの励起用に552nmレーザーをセットします。mOrange信号を最適化するために放出範囲を調整します。disiLIDの光活性化は、2.58秒間隔の光パルスを使用して、488nmレーザーで達成されます。

3. GUVの準備

1. ポリビニルアルコール(PVA、 材料表を参照)の5%(w/v)溶液(MW:145,000 g/mol)と100 mMのスクロースを超純水に調製し、80°C、400 rpmで一晩混合します。
2. クロロホルムで目的の組成(最終濃度10 mg/mL)の脂質溶液を調製します。この分析法では、10 mg/mL POPC、10 mol% 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(POPG)、2 mol% DOPE-ビオチン、1 mol% DiDからなる組成物を推奨します( 材料の表を参照)。
3. ハイドレーションテクニック^7,8でGUVを準備します。まず、調製したPVA溶液40μLを均質な薄層として、60 mm x 24 mmのスライドガラスの上に、できればピペットチップで広げます。次に、薄層を50°Cで30分間乾燥させます。
4. 脂質溶液5μLを針でPVA層に広げ、30°Cで1時間乾燥させます。
5. スペーサー(~40 mm ×24 mm × 2 mm、 材料表を参照)と 2 枚目のスライドガラスを使用して、機能化されたスライドガラス上にチャンバーを組み立てます。
6. 1 mLの再水和バッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)をチャンバーに室温で1時間加え、GUVを形成。1時間後、チャンバーを反転させ、ピペットチップでガラス面を軽くたたきます。
7. 片側のスライドガラスを慎重に取り外して、構築されたチャンバーを開き、ピペットでGUVを回収します。
8. 溶液をプラスチックチューブに入れ、GUVを2時間沈殿させます。

4. mOrange-Nanoの官能基化GUVへのリクルートメント

1. 収穫したばかりのGUVにSAvの溶液を加え、室温で30分間放置します。
   注意: 次の手順は、disiLIDの光活性化を避けるために、保護赤色光で実行する必要があります。
2. GUVs溶液に1 μMのb-disiLIDを加え、サンプルを暗所に30分間置き、アルミホイルで覆います。
3. スライドμ式18ウェルガラスボトムチャンバーを150 μL BSA溶液(3% w/v水溶液)で10分間前処理します。次に、BSA溶液を取り出し、ウェルを150μLの超純水で3回洗浄します。
4. 145 μL の 200 nM mOrange-Nano バッファー (10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl) をウェルに加えます。
5. 次に、b-disiLIDで装飾したGUVを5 μL溶液に加え、GUVが沈殿するまで~15分待ちます。
6. μスライドを共焦点顕微鏡の下に置きます。サンプルを552 nmで励起してmOrange(λ_ex = 557 nm; λ_em = 576 nm)蛍光を可視化し、638 nmでサンプルを励起してGUV膜のDiD(λ_ex = 644 nm; λ_em = 665 nm)を可視化します。mOrange-Nanoの動員は、望ましくない光退色の影響を最小限に抑えるために、5.3秒ごとに青色光パルス(488 nm、強度1%)でトリガーされます。
   注:励起波長は、使用する顕微鏡の種類に基づいて調整できます。顕微鏡で使用できる他の一般的な励起波長も、532 nmまたは561 nm、および633 nm、647 nm、639 nm、または640 nmのレーザーです。

結果

記載された手順により、SLBの形成により、合成膜上にmOrange-Nanoをリクルートすることができます。b-disiLIDで官能化されたSLB上にパターン化された既定のmOrange-Nanoの形成を 図1Aに示します。SLB 上の 24 μm × 24 μm の関心領域 (ROI) を 488 nm の青色光で照らすと、ROI の mOrange チャネル (赤で表示) で 200 秒以内に蛍光シグナルの急速な増加が観察されます。このパターンは、非常に明確で鋭いエッジを示し(図1B)、光活性化領域に対する高い空間制御を示しています。相互作用は速く、青色光による照明が中断されるため、完全に可逆的です。この方法では、数回の照明サイクルにわたってパターンを形成することもできます(図2)。~200秒の青色光と200秒の暗光の交互サイクルにより、選択した領域でのmOrange-Nanoの可逆的な動員が複数回行われ、パターン内の蛍光強度のΔ強度が同等の値になります。

図3 は、GUVの準備の概略図を示しています。mOrange-Nanoの動員は、GUVでも観察されます。暗所に置かれたGUVはmOrange蛍光を示さないことが示されています(図4A)。GUVは全球的に青色光で照らされているため、mOrange蛍光が観察され、GUV膜色素(DiD)と共局在します。照明が終了すると、相互作用は非常に可逆的です。GUVメンブレンでのmOrange強度の経時的な定量化は、タンパク質の迅速かつ効果的な動員と完全な可逆性を示しています(図4B)。

図1:b-disiLIDで官能基化されたSLBの蛍光顕微鏡画像。 ROIにおける局所青色光(488nm)照射前(A)および(B)照射中におけるmOrange-Nanoの存在下での蛍光画像。(C) b-disiLIDで官能基化されたSLBのROIで測定されたmOrangeの蛍光強度(= 200 s)。この図は、Di Iorio et ^al.8 から引用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:3回のリクルートサイクルでb-disiLIDで装飾されたSLBのROIでリクルートされたmOrangeの蛍光強度。 各光活性化ステップの後、mOrange-Nano蛍光はROI内で増加しました。パターンは120秒以内に飽和に達し、蛍光は120秒以内に減少し、ほぼバックグラウンドレベルに達します。異なるブルーライト/ダークサイクルでパターン品質の低下は観察されません。この図は、Di Iorio et ^al.8 から引用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:穏やかな水和法を使用したGUV調製の概略図。 このスキームは、いくつかのステップと、2つのスライドガラスとスペーサーを使用して構築されたチャンバーを視覚的に表現しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:GUV膜上のmOrange-Nanoの光依存性動員の蛍光顕微鏡測定。 (A)mOrange-Nanoの存在下でのdisiLID機能化GUVの蛍光画像。緑はGUVの膜色素、赤は青色光照射前、照射中、照射後のmOrange蛍光です。スケールバー = 10 μm. (B) 経時的にGUVに局在するmOrangeの蛍光強度。照明を受けると、脂質膜上のmOrange蛍光(赤で表示)は60秒以内に最大強度に達し、蛍光強度は5.9倍に増加します。照明を停止すると、mOrange蛍光は60秒以内にほぼ照明前の値まで減少します(90%の回復)。この図は、Di Iorio et ^al.8 から引用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

我々は、光スイッチング可能なタンパク質disiLID8を用いて、支持脂質二重膜や巨大単層小胞などのモデル膜上のmOrange-Nanoタンパク質を局所的に動員する方法について説明しました。パターンの品質に寄与する側面には、タンパク質の品質だけでなく、SLBとGUVの良好な品質も含まれます。

発現および精製後に良好なタンパク質品質を確保するためには、まずdisiLIDの光スイッチング特性を評価することが重要です。この目的のために、FMN補因子の吸収は、暗闇および青色光照射後に測定する必要があります。disiLIDのUV-Visスペクトルは、暗所では補因子FMNの特徴的なトリプルピークを示すことが期待され、これは青色光の照射時に有意に減少し、暗所で回復する¹³。この光切り替え可能な挙動は、次のステップで再現性と可逆性のリクルートを得るために重要です。保護赤色光を使用し、サンプル調製中にdisiLIDを最小限の外部照明にさらすことで、実験の性能が向上します。

膜の欠陥および/または不均一なSLBの形成(すなわち、多層またはパッチSLBの存在)は、タンパク質パターニングの品質に影響を与える。したがって、経験の浅いユーザーは、蛍光標識SLBを形成するために、SUVをDiDやDiOなどの一部の膜染料で標識することにより、プロトコルを再現することをお勧めします。このように、SLBの特性と品質は、蛍光顕微鏡法で十分に特徴付けることができます。FRAP測定は、メンブレンの流動性を評価することにより、SLBの品質を評価するための一般的なアプローチです。あるいは、このプロトコルに記載されているようなビオチン化SLBの場合、蛍光標識されたSAv(例: Atto 488-SAv)を使用して、SLBの品質を視覚化および評価することができます。

プロトコルの最初の部分では、SLBのパターンの形成について説明します。最適な結果を得るためには、SLBにmOrange-Nanoを添加し、サンプルを暗所で15分間インキュベートすることが重要です。光活性化中、ROIの選択は特定のサイズに制限されません。しかし、蛍光タンパク質の望ましくない光退色を低減するためには、レーザー強度と露光時間を調整する必要があります。

この方法はビオチン化タンパク質に限定されず、他のアプローチを使用してdisiLIDをSLBに固定することができます。例えば、Hisタグ付きdisiLIDを発現させ、Ni-NTA含有SLBにアンカーすることができます。しかし、SLB上のタンパク質の置換を避けるためには、NanoとdisiLIDを異なるタグで発現させることが重要です。この方法では、タンパク質の順序を逆転させることも可能になり、NanoでSLBを官能基化し、青色光照射時にdisiLID(またはdisiLID融合タンパク質)をリクルートします。

タンパク質の局在を動的に制御するためには、選択した領域へのタンパク質の可逆的な局在を繰り返し可能にする必要があります。これを達成するために、溶液中のナノ(200 nM)の濃度は、高い可逆性を得るための重要なパラメータです。

もう一つの懸念事項は、disiLIDで機能化されたGUV表面へのNanoの動員です。SLB上のタンパク質パターニングの場合と同様に、この方法はさまざまな膜機能化戦略に拡張できます。このプロトコルでは、GUV全体を青色光で照らし、GUV表面全体にmOrange-Nanoをリクルートしました。しかし、GUVメンブレンに局在する小さなROIを選択することで、より制限された領域にタンパク質を正確に局在化させることができるはずです。

この方法は、SUVまたはGUVのメンブレンでのNanoリクルートメントのイメージングに使用される蛍光色素の選択に関連する制限のみを示します。特に、青色光領域の励起スペクトルを持つ蛍光色素は、その使用がiLIDの光活性化を妨げるため、避ける必要があります。したがって、このタイプの実験には、緑色または赤色光の範囲の蛍光色素(mOrangeやCy5など)を選択することをお勧めします。

disiLID設計は、膜への局所的なタンパク質動員を改善するためのシンプルで適応性の高い方法を提供し、オプトジェネティクス⁴からiLIDおよびNanoのダイナミックレンジを広げます。これらの方法は、脂質二重膜やGUVなどの模倣膜へのナノの動員に焦点を当てています。それにもかかわらず、このアプローチは、(dis)iLIDまたはNanoが膜に結合している細胞内の多数の光遺伝学的ツールに拡張可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µ-スライド 18 ウェル	Ibidi	81817	SLB 調製用
25 µLマイクロリットルシリンジ	ハミルトン	モデル702 N	混合物の調製とPVA層への脂質溶液の散布用
ビオチニルキャップ PE (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)) (ナトリウム塩)	Avanti Polar Lipids	870273C	SUVの準備用
CaCl2 (塩化カルシウム)	Sigma-Aldrich	C5670	SLB形成用
カバースリップ 24 mm x 60 mm	エンゲルブレヒト	K12460	GUV形成
用 DiD (1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3',3'- テトラメチルインドジカルボシアニン)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D7757	膜染料
disiLID			Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGGGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA< GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVITbr/> DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF
DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375P	SUV用 脂質組成
Eppendorf Protein LoBind 微量遠心チューブ	Merk	EP0030108116-100EA	作りたてのGUVの収集用
mOrange-Nano			シーケンス: MRGSHHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKEL kakgksalm FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKV tkgg PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG
NaCl (塩化ナトリウム)	Sigma-Aldrich	S9888	バッファーNaOH
(水酸化ナトリウム)	Sigma-Aldrich	1064980500	SLB形成における表面活性化用
POPC (1-パルミトイル-2- オレオイルホスファチジルコリン)	Avanti Polar Lipids	850457C	GUV用 脂質組成
PVA(ポリビニルアルコール) 完全加水分解	Sigma-Aldrich	8148940101	GUV形成
用 SP8共焦点レーザー走査顕微鏡	ライカ
ストレプトアビジン	TermoFisher	434301
ショ糖	シグマ・アルドリッチ	84097	GUVs形成用
トリス塩酸塩	Sigma-Aldrich	10812846001	バッファー用