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方法論記事

HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)

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DOI:

10.3791/66532

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2024年4月26日

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1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

この記事について

サマリー

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。

要約

アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)は、中枢神経系(CNS)を調査するための優れたツールです。AAVなどの革新的なカプシド。PHP.eBは、マウスの静脈内注射による中枢神経系の広範な形質導入を示しています。同等の形質導入を実現するには、中枢神経系実質への直接注入と比較して、100倍高い力価(最小1 x 1011 ゲノムコピー/マウス)が必要です。私たちのグループでは、AAVを含むAAV生産。PHP.eBは、接着HEK293T細胞とトリプルトランスフェクション法に依存しています。接着細胞でAAVの高収率を達成するには、労力と材料を大量に消費するプロセスが必要です。この制約により、コニカルチューブでの懸濁液ベースの細胞培養のプロトコルが開発されました。接着細胞で生成したAAVを懸濁液製造法と比較しました。トランスフェクション試薬ポリエチレンイミンまたはTransItを用いた懸濁液中での培養を比較しました。AAVベクターは、ヨウジキサノールグラジエント超遠心分離により精製し、その後、バッファー交換および遠心フィルターを用いた濃縮を行いました。アドヒレント法では平均2.6 x 1012 GCを達成したが、懸濁法とポリエチレンイミンでは合計7.7 x 1012 GC、TransItでは合計2.4 x 1013 GCであった。接着液で作製したベクター間の in vivo 形質導入効率は、浮遊細胞系と比較して差はありません。要約すると、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルが導入され、ベクター生産に必要な時間と労力が削減され、研究目的で商用ベンダーから入手可能なコンポーネントを使用して3〜9倍の収率を達成します。

概要

アデノ随伴ウイルス(AAV)は1965年に発見され、それ以来、無数の用途で使用されてきました1。AAVは、遺伝子や神経細胞の機能の研究、神経回路のマッピング、疾患の動物モデルの作成など、神経科学研究に応用されています2。伝統的に、これはほとんどの自然な血清型が血液脳関門を通らないか、またはそうするために高線量を必要とするので、興味のある部位に直接注入することによって行われます1,2,3。

AAVの発見により。PHP.B4 や AAV などの次世代の capsid です。PHP.eB5 と AAV.CAP-B106は、簡易な全身注射を用いて中枢神経系(CNS)を標的とすることができる。空間マッピングにより、AAV の標的となる細胞が明らかになります。PHP.eB(セルラーレベル6,7)。これらのカプシドは、特定のプロモーター/エンハンサーと組み合わせることで、神経科学者が非侵襲的なAAV送達によって遺伝子と脳機能を研究する幅広い機会を提供します4,8。

AAVにはより低い用量が必要ですが。AAV9(4 x 1012 GC/マウス)と比較して、PHP.eB(通常1〜5 x 1011 11ゲノムコピー(GC)/マウス)7は、直接注入戦略(通常1 x 109 GC/μL注入)と比較して、さらに多くのベクターを作製する必要があります。ほとんどの天然血清型は、ヨージキサノール精製9,10,11,12と組み合わせた古典的な接着細胞培養システムを使用して作製できます。AAVの場合。PHP.eB:これは、1回の実験に十分なベクターを得るために、細胞を培養およびトランスフェクションするための労働集約的なプロセスを伴います8。そこで、コニカルチューブでの浮遊細胞培養におけるAAVの生産が開発されました。最大容量300mLのコニカルチューブはコンパクトで、インキュベーターのスペースとプラスチックの両方を節約できます。浮遊細胞は、15 cmプレート上の接着細胞よりも大量に培養および処理がはるかに簡単です。プロトコルのトランスフェクションコンポーネントは変わりません。したがって、以前に接着系で使用されたプラスミドは、浮遊細胞での産生に基づいて、このプロトコルで容易に使用できます。このプロトコルは、研究室の他の研究者への転送に成功し、さまざまなカプシドやコンストラクトに使用されました。

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プロトコル

すべての実験手順は、オランダ王立科学アカデミー(KNAW)の動物実験委員会によって承認され、プロジェクト番号AVD8010020199126に基づくオランダの動物実験法に準拠していました。 図1に、完全なプロトコルの概略図を示します。細胞の播種からAAV精製まで、プロトコルは完了するまでに6日かかります。

1. 試薬調製

  1. プラスミド精製
    1. プラスミドの無菌性を確保するために、メーカーの説明に従ってプラスミド抽出を数回調整して実行します。
    2. 滅菌蒸留水と無水エタノールを使用して70%エタノールを調製します。
    3. イソプロパノール遠心分離ステップの後、フローキャビネットフードでプラスミドを乾燥させ、滅菌済みの70%エタノールをチューブに加えます。エタノール沈殿後、フローキャビネットフードでプラスミドを乾燥させ、プラスミドを滅菌蒸留水に再懸濁します。滅菌された微量遠心チューブを使用するように注意してください。
    4. 定量、制限酵素分析、および必要に応じてシーケンシングのためにアリコートを採取します。突然変異は収量に悪影響を与える可能性があるため、逆末端反復配列(ITR)の完全性を確認することをお勧めします。サンプル濃度を 1 μg/μL に調整します。
  2. 10x Tween溶解バッファーの調製
    1. 30.3gのトリス緩衝液と2.033gのMgCl2.6H 2Oを400mLの滅菌蒸留水に溶解し、pHを8.0に設定し、総容量を450mLに増やします。
    2. Tween 20を無菌状態に保ち、フード内の緩衝液に50 mLのTween 20を加え、0.2 μMの真空フィルターを使用してろ過滅菌します。
  3. ヨウジキサノール希釈液
    1. ヨウジキサノール溶液は60%濃度で提供されます。開始溶液を使用して、15%、25%、および40%の溶液を作成します。
    2. 15%溶液の場合、60%溶液60 mLを48 mLの5 M NaClと48 mLのPBS-MK(5 mM MgCl2 および12.5 mM KClの5x PBS)で希釈し、最大240 mLの蒸留水を加えます。
    3. 25%溶液の場合は、67 mLの60%溶液と32 mLのPBS-MKを希釈します。最大160mLの蒸留水を加えます。よく混合し、1.6 mLのフェノールレッド溶液を加えます。
    4. 40%溶液の場合は、160 mLの60%溶液を48 mLのPBS-MKで希釈し、最大240 mLの蒸留水を加えます。60%溶液の場合は、100 mLの60%溶液に1 mLのフェノールレッドを加えます。
  4. PBS 5%ショ糖溶液
    1. カルシウムまたはマグネシウムを含まないDPBSの500 mLボトルに25gのスクロースを加えます。よく振とうし、0.2μMのボトル真空フィルターでろ過する。
  5. ポリエチレングリコール(PEG)8000溶液
    1. 400 g の PEG 8000 と 24 g の NaCl を滅菌蒸留水に溶解し、最終容量が 1000 mL になるように調整します。完全に溶けるまで加熱してかき混ぜます。pHペーパーを使用してpHを7.4に調整します。
    2. 0.2 μMのボトル真空フィルターを使用してフィルター滅菌し、40%PEG 8000溶液を得ます。4°Cでの溶液貯蔵の粘度により、ろ過には時間がかかることに注意してください。

2. HEK293浮遊細胞の培養

  1. クリーニングには、70%エタノールに浸したワイプを使用してください。バイオセーフティフードを洗浄し、細胞の培養に必要なすべての材料を準備して洗浄します。
  2. 30 mLの浮遊細胞培地を50 mLのコニカル培養チューブで37°Cに予温します。液体窒素からウイルス産生細胞を回収します。細胞を37°Cのウォーターバスで速やかに融解します。バイアルが完全に解凍される直前に、70%エタノールに浸したワイプで洗浄し、バイアルをバイオセーフティフードに移します。
    注:ここで使用したウイルス産生細胞の詳細は、 材料表に記載されています。
  3. 予熱した50 mLのコニカル培養チューブに細胞を迅速に移します。37°C、湿度80%、CO28%、200回転/分(RPM)、振とう直径50mmの振とうインキュベーターで細胞を培養します。継代細胞は、生存率が90%を超え、細胞密度が1-3 x 106 細胞/mLを超えると、通過細胞になります。
    注:使用するインキュベーターの振とう直径は50mmです。培養条件は、振とうの直径が異なるように調整する必要があります。
  4. 融解後3〜4日で継代細胞。培養チューブをチェックして、汚染の兆候がないことを確認します。たとえば、真菌は変色した(黒または緑)リングとして表示されます。
  5. 1 mLのストリペットを使用して、サンプルあたり400 μLの0.4%トリパンブルー溶液を調製します。
  6. インキュベーターから浮遊細胞をすばやく取り出します。1 mLのストリペットを使用して、チューブから500 μLを直ちに抽出します。ピペットで静かに上下させます。
  7. 調製したトリパンブルーチューブに100μLの細胞懸濁液を加えます。チューブをそっとひっくり返して混ぜます。ピペットで混ぜると細胞死の原因となるため、混ぜないでください。細胞をインキュベーターに戻します。
  8. トリパンブルー処理した細胞懸濁液50 μLを採取し、血球計算盤スライドに塗布します。生細胞の総数をカウントし、翌日の継代またはトランスフェクションに必要な細胞懸濁液と培地の量を計算します。
  9. インキュベーターで培地を10〜15分間温めます。温めた培地に細胞懸濁液を加え、インキュベーターに戻します。細胞を 3 日間(つまり、月曜日から木曜日)継代する場合は、0.5 x 106 cells/mL に設定します。細胞を 4 日間(つまり、木曜日から月曜日)継代する場合は、0.3 x 106 cells/mL に設定します。
    注:メーカーによると、ウイルス産生細胞は26時間ごとに2倍になり、継代前に3.5 x 106 から5.5 x 106 の間である必要があります。細胞は継代20まで保持できます。

3. トランスフェクション

  1. 1日目
    1. トランスフェクションの24時間前に、300 mLの培地で1 x 106 細胞/mLを培養します。
  2. 2日目
    1. 培地、プラスミド、トランスフェクション試薬を室温に温めます。準備する量については、 表1を参照してください。
    2. 簡単に言えば、プラスミドと試薬をボルテックスします。調製した培地、ボルテックスにプラスミドを加えます。トランスフェクション試薬を添加し、ボルテックスを短時間行います。このステップの後、混合物を攪拌しないでください。室温で30分間インキュベートします。
    3. その間に、1日目に調製した細胞を数えます。細胞は 2 から 2.5 x 106 細胞/ mL で、生存率 95% >必要があります。
    4. インキュベーション後、チューブを静かに旋回させながら、トランスフェクション混合物を細胞に滴下します。72〜96時間インキュベートします。

4. 細胞の採取

  1. 5日目
    1. 33 mL の 10x 細胞溶解バッファー(500 mM Tris pH 8、10% Tween 20、20 mM MgCl2)を加え、穏やかに振とうして混合し、振とうしながら 37 °C で 1.5 時間インキュベートします。
    2. 3428 x g 、4°C、60分間遠心分離します。0.45 μM PES真空フィルターでろ過して細胞溶解物を清澄化し、清澄化したライセートをフィルターの容器に残します。
      注:ろ過後のオプション:定量PCR(Q-PCR)用のサンプルを50 μL採取します。
    3. ろ過した細胞ライセート360 mLに90 mLの40% PEG 8000溶液を加えます。
    4. 攪拌子を70%エタノールで洗浄し、サンプルに加えます。氷の上または冷蔵室で300RPMで1時間攪拌します。一晩撹拌せずに4°Cでインキュベートします。
      注:1時間から72時間のインキュベーション時間がテストされています。インキュベーション時間が長いと、全体的なタンパク質沈殿に悪影響を及ぼします。

5. ヨウオジキサノールの精製

  1. 6日目
    1. PEG沈殿培養量サンプル全体を清潔で大きなコニカルチューブに移し、2820 x g 、4°Cで15分間遠心分離します。
    2. 上清を廃棄し、PEGペレットをカルシウムおよびマグネシウムを含む15 mLのDPBSに再懸濁します。ペレットは再懸濁が困難です。時間をかけて慎重に行ってください。
    3. 再懸濁した部分を清潔な50 mLチューブに移します。PEGはバイオリアクターチューブの側面に残ります。さらに10 mLを追加し、すべてのPEG沈殿物を集めるように注意します。すべてを50 mLの容器に移し、総容量が25〜30 mLになります。
    4. 40 μLのDNaseI(10 U/μL)を添加します。インキュベーターに1時間37°C置きます。
      注:DNaseのインキュベーション後のオプション:Q-PCR用に50 μLのサンプルを採取します。
    5. PEG沈殿に使用した攪拌子は、塩化物溶液とそれに続く70%エタノールでよく洗浄します。次の実験のために、攪拌剤を70%エタノールに浸しておきます。
    6. 25 mm x 89 mm のポリアロマーチューブに、ガラス製のパスツールピペットを使用して、各チューブに 15.5 mL の濃縮細胞ライセートを充填します。細胞ライセートを添加した後、ガラス製のパスツールピペットを新しいピペットと交換します。
    7. 15%〜60%のヨウジキサノール溶液を添加:15%イオジキサノール溶液9 mLを細胞ライセートの下に穏やかに注入します。次に、5 mLの25%および40%イオジキサノール溶液を加え、最後に5 mLの60%ヨジキサノール溶液を加えます。
    8. DPBS +/+のシリンジを使用してチューブを補充し、ヨウジキサノール層を乱さないように注意しながら、ほとんどの気泡を取り除きます。電気チューブトッパーを使用してチューブを密封します。
    9. 超遠心分離機で、非スイングローターで1時間10分間、490,000 x g 、16°Cで遠心分離します。超遠心分離機から取り出し、チューブを金属クラスプに組み立て、コレクションチューブを準備します。回転中にこぼれた場合に備えて、フード内のローターを開きます。
    10. グラジエントごとに、50 mLチューブ1本(ローターチューブ廃棄用)、15 mLチューブ1本(ウイルス収集用)、5 mLシリンジ、30Gおよび19Gニードルを用意します。
    11. チューブの上部に30Gの針で穴を開けます。針はそのままにしておきます。シリンジに19Gの針を置きます。
    12. フェノールレッドインジケーターで確認できる40%/60%界面のすぐ下のチューブに慎重に穴を開けます。針の斜角が40%層を向いていることを確認してください。
    13. 利き手ではない方の手を使って、チューブの上部から30Gの針を取り外します。針を斜めにした状態で、ウイルス/ヨウジキサノールをゆっくりと抽出します。目的は、3mLから4.5mLの間で抽出することです。40%/透明層の約半分まで、ベベルのニードルを下向きに回転させ、タンパク質層からの収集を避けるために抽出を続けます。
    14. 利き手ではない方の手で50mLチューブを準備し、チューブを50mLチューブに入れながら針を慎重に引き抜き、廃棄します。AAV/イオジキサノール懸濁液を DPBS で 5 倍に希釈し、最大 15 mL まで充填します。
    15. 遠心フィルターチューブに移し、3428 x g、4°Cで10分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。フィルターのホルダーをそっと取り外し、下部の容器をゴミ箱に傾けます。PBS-5%スクロース15 mLを濾過し、再懸濁します。
    16. 3428 x g 、4°C、20分間遠心分離します。バッファ交換を3回以上繰り返します。ウイルス (~150-250 μL) を 4 °C (PHP.Bバリアントは最大3か月)または50 μLのアリコートに分注し、-80°Cで長期間保存します。
      注:PHP.Bカプシド変異体は凍結融解に敏感であるため、これは避けるべきです。
    17. 前のプロトコル10に記載されているように滴定を行います。

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結果

ほとんどの学術研究室では、AAV産生に接着性HEK293T細胞を使用しています8,9。これは、直接注入に少量のAAVが必要な場合には比較的うまく機能しますが、AAVなどの全身性キャプシドで同様の形質導入を達成するには、100倍高い力価(最低でも1 x 1011 GC/マウス)が必要です。PHP.eBです。

このプロトコルでは、円錐管で培養した懸濁液HEK293細胞を使用したAAVの産生が確立されました。小規模培養は50 mLチューブで、大規模培養は600 mLチューブで行うことができます。特定のシェーカー(材料表を参照)には、最大16本の大きなチューブを同時に培養できるラックを使用できます。このラックは、50 mL チューブ用の特殊なインサートと組み合わせて使用します(図 2A)。このシステムは、このプロトコルの培養およびトランスフェクションセグメント...

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ディスカッション

AAVの全身投与は、中枢神経系への遺伝子導入のための強力なツールです。しかし、AAVの製造は高価で手間のかかるプロセスです。浮遊細胞を使用することで、15cm2 プレート上のHEK293Tの接着培養と比較して、労力とプラスチックが削減されます。さらに、ここに実装されている円錐形のチューブは取り扱いが簡単で、実験室のスペースを最大限に活用できます。このプロトコルは、2人の研究者によって設定され、その後、研究室の他の研究者によって適用されました。3人の独立した研究者による一連の作製により、平均して、バッチあたり6〜7匹のマウスを注入するのに十分なベクターが得られました。

HEK293浮遊細胞の使用は、以前に説明されています13,14。しかしながら、記載された浮遊細胞株は、研究目的で自由に利用できるものではない。これは、学術研究者が説明されている方法を適用する際のボトルネックです。このプロトコルで記述されている懸濁液のセルラインは研究の為に自由に利用...

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開示事項

TransITの無料サンプルは、初期テストのためにMirusから提供され、その後、試薬を購入してさらに使用しました。著者らは、報告すべき他の競合する金銭的利害関係を有していない。

謝辞

この研究は、オランダ王立芸術科学アカデミー(KNAW)研究基金からの助成金とStart2Cure(0-TI-01)からの助成金によって支援されました。プロトコルの設定における Leisha Kopp 氏の意見とアドバイスに感謝します。図はBiorenderを使用して作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
39 mL、クイックシールラウンドトップポリプロピレンチューブ、25 x 89 mm - 50Pkベックマンコールター342414
アダプター600 mLコニカルチューブ、ローターS-4x1000用、 eppendorf5920701002
Infors HT/TPP587633のバイオリアクター16個に適合
、750 mL丸型バケット用eppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubeseppendorf5948000315
Distilled WaterGibco
DNase I 組換え体、RNase フリーRoche4716728001
DNase I 組換え体、RNase フリーRoche4716728001
DPBS、カルシウム、マグネシウムGibco14040091
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムGibco14190144
Fisherbrand 使い捨て PES フィルターユニット 0,2フィッシャー
フィッシャーブランド 使い捨てPESフィルターユニット 0.45フィッシャーFB12566505
50ml培養チューブ用ホルダーも適合インフォサーズHT/TPP31362
600ml細胞培養チューブ用ホルダーインフォサーズHT/TPP66129
インキュベーター ミニトロン 50mmインフォサーズHT500043
LV-MAX 生産媒体ギブコ
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - トランスフェクショングレード 直鎖状ポリエチレンイミン塩酸塩 (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
フェノールレッド溶液 Sigma-Aldrich72420100
ポリ(エチレングリコール) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirus Mir6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
ウイルス産生細胞GibcoA35347
ビバスピン 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
アダプタープレートは、600 ml エアロゾルタイトキャップ15230147なし FB12566504A3583401

参考文献

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