方法論記事

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

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DOI:

10.3791/66562

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2024年2月23日

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1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。

要約

複雑なコミュニティ内の個々の細胞の代謝活性を理解することは、ヒトの疾患におけるそれらの役割を解明するために重要です。ここでは、rRNAタグ付きFISHプローブと同位体標識基質を組み合わせることにより、OPTIR-FISHプラットフォームを使用した細胞同定と代謝解析を同時に行うための包括的なプロトコールを紹介します。蛍光イメージングは、rRNAタグ付きFISHプローブの特異的結合による細胞同定を提供し、OPTIRイメージングは、OPTIRスペクトル上の同位体誘導赤方偏移による単一細胞内の代謝活性を提供します。 13C-グルコースで培養した細菌をテストベッドとして使用して、プロトコールでは、同位体標識、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)、サンプル調製、OPTIR-FISHイメージングセットアップの最適化、およびデータ取得による微生物培養の概要を説明します。また、画像解析を実行し、シングルセルレベルでスペクトルデータを高スループットで解釈する方法も示します。このプロトコルの標準化された詳細な性質は、広範な単一細胞代謝研究コミュニティ内の多様な背景や分野の研究者による採用を大幅に促進します。

概要

細胞代謝は、細胞生物学の基本的な柱であり、細胞の健康、機能、および環境との相互作用を決定する多くのプロセスを導いています。個々の細胞レベル、特に天然環境における代謝の解析は、生体システムにおける不均一で複雑な活動を明らかにするための貴重な洞察を提供します1。これは、多くの微生物が従来の栽培方法に挑戦する独自の成長要件または環境依存性を示すため、微生物の研究において特に重要です2。例えば、ある種は、実験室の設定では容易に再現できない特定の栄養組成や共生関係を必要とする場合があり、したがって、標準的な技術では培養不可能になる3。さらに、特定の種の培養に必要な長期化は、微生物学研究にとって大きな課題となり、多くの場合、研究と分析の実際の時間枠を超えて延長されます。これらの制限を回避するために、ポリメラーゼ連鎖反応や蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)などの代替法により、培養を必要とせずに微生物種を同定することができ4、これにより、微生物生態系のより正確で全体的なビューを達成することができます。しかし、これらの解析技術では細胞代謝を解明する能力が不足しています。このギャップは、微生物学分野で進行中の課題、つまり細胞の同一性を分化し、単一細胞レベルでの代謝を解明するという並行課題を浮き彫りにしています。安定同位体と組み合わせたイメージング質量分析(IMS)などの技術の進歩は、シングルセル代謝分析の強力なツールとして浮上しています5。これらの実験では、 細胞を13Cまたは 15Nなどの同位体を含む基質とインキュベートしました。新たにアナボライズされた生体分子はこれらの同位体を運び、m/zスペクトル上で区別することができます。しかし、IMSは、高価な装置、複雑なサンプル調製、比較的低いスループット、およびm/zスペクトルの分析に必要な専門知識に悩まされています。分子マーカー特異的蛍光イメージングと組み合わせることで、特異性を高めた細胞代謝の解明が進歩しています6。それにもかかわらず、これら2つのモダリティを橋渡しする課題は依然として残っています。IMSと蛍光イメージングの分解能の違いは、異なる操作設定と相まって、所見の整合と相関を困難にしています7。

振動分光イメージングと安定同位体標識の統合は、シングルセル代謝の研究に新たなソリューションを提供します。より重い同位体を取り込むと、化学結合の振動が遅くなり、振動スペクトル8に赤方偏移のピークが生じます。特に、振動イメージングは蛍光イメージングに匹敵する空間分解能を提供し、代謝定量と細胞同定の両方を1回のセットアップで実行できるため、画像のレジストレーションと相関が簡素化されます。私たちの最近の研究では、高度な振動イメージングプラットフォームである光学光熱赤外(OPTIR)と蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)の組み合わせを実証し、細菌群集のグルコース代謝をプローブしています9 (図1)。OPTIRは、可視光の変化を検出することにより中赤外吸収の光熱効果を利用した振動分光顕微鏡システムであり、光学顕微鏡と同様にサブマイクロメートルの分解能を提供しますが、中赤外吸収に由来する追加の振動分光情報を提供します。FISHは、単一細胞レベルで微生物の同一性を決定するために一般的に使用される手法です。オリゴヌクレオチドの配列は、異なる分類群の特定の16S配列を標的とするように設計でき、異なる蛍光色素を結合させることができます。設計されたオリゴヌクレオチドプローブと標的rRNAとの特異的なハイブリダイゼーションは、個々の細胞内の標的分子種の強力な蛍光シグナルをもたらし、マルチチャネル蛍光イメージングを実行して集団内の複数の分子種を同定することができます。OPTIRと蛍光イメージングはどちらも光学検出に基づいているため、OPTIRとFISH蛍光の組み合わせは簡単に実装できます。この 2 つのモダリティは、シングルセル解析用の光学分解能を共有しており、追加のアライメントや共レジストレーションを必要とせずに便利に切り替えることができます。

このプロトコールは、OPTIR-FISHプラットフォームを活用して高度なシングルセル構造機能解析を行うための詳細なガイドを提供します。13C-グルコース含有培地で増殖した細菌サンプルを試験床として使用し、13C-グルコースからのde novoタンパク質合成を定量しました。このプラットフォームの細胞同定能力を実証するために、rRNAを標的としたFISHプローブを用いて各種を標識した細菌混合物を使用しました。このアプローチにより、大腸菌(E. coli)やバクテロイデス・シータイオタミクロン(B. theta)などの特定の細菌株の正確なシングルセル同定と、それらの代謝が容易になりました。このプロトコルは、研究者に単一細胞レベルでの代謝プロファイリングと種の同定を同時に行うための強力なツールを提供し、細胞の相互作用、生理学、および複雑な環境におけるそれらの役割についての理解を深めることを約束します。

プロトコル

この研究での細菌標本の使用は、ボストン大学の治験審査委員会(IRB)および国立衛生研究所のガイドラインに従っています。

注:このプロトコルで従う一般的なワークフローを 図2にまとめます。

1. 細菌培養と同位体標識(図2A)

注:ここに示す例は、純粋な細菌培養物を標識するためのものです。このプロトコルを多微生物群集に適用する場合、培地と標識時間は、関心のある生物の群集と生理機能に応じて調整する必要があります。

  1. 単一のコロニーから目的の細菌株を接種し、トリプシン大豆ブロス(TSB)やルリアベルタニブロス(LB)などの栄養豊富な培地で3時間前培養して、指数関数的増殖(log)段階に到達します。 大腸菌 BW25113は、このプロトコルの例として菌株として使用されます。
    注意: ログフェーズに到達するまでの時間は、使用するひずみによって異なります。この時間は、各系統に適合させる必要があります。
  2. 600nmの光学密度を測定して、細菌濃度を推定します。
  3. 同位体標識基質を添加した最小限の増殖培地を調製します。 大腸菌 BW25113の場合は、M9最小培地に 13個のC-グルコースを最終濃度0.2%(w / v)で補充します。
    注:使用された 13C-グルコース(D-グルコースU-13C6、99%)は、すべての炭素原子が 13C原子に置き換えられた普遍的にラベル付けされました。最小増殖培地の選択は、細菌株によって異なります。同位体基質の選択は、関心のある特定の代謝プロセスに依存します。全体的な目標は、同位体基質が、非標識のものと比較して主要な栄養源として機能することです。
  4. 同位体標識基質を含む最小増殖培地で細菌を最終濃度5 × 105 CFU/mLに希釈します。
    注:通常、1:100のような高い希釈率が使用され、豊富な培地からのラベルのない栄養は無視できます。あるいは、栄養豊富な培地を完全に除去するために、1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)による洗浄を14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、PBSで再懸濁した後、2回目の遠心分離を行い、最小増殖培地で最終再懸濁します。
  5. 最適な成長条件下で、軌道振とうインキュベーターで細菌サンプルを増殖させます。一般に、オービタル振盪インキュベーターを220rpmの速度と37°Cの温度に設定し、好気性インキュベーションのために培養チューブを緩いキャップで傾けて置きます。 大腸菌の場合、通常、37°Cで24時間の好気性インキュベーションを行うと、最大 標識の13°Cに達するのに十分です。
    注:インキュベーション時間は、関心のある代謝プロセスによって異なります。インキュベーション時間が長いほど、一般的に同位体標識が高くなります。同じ条件下で非標識基質を使用して成長曲線を測定することで、適切な収集時間ポイントを決定するための洞察が得られる可能性があります。
  6. 14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離することにより、目的の時点で細菌細胞を回収します。
  7. 上清を取り除き、PBSに等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を再懸濁します。細胞をPFA溶液に室温(RT)で10分間、または4°Cで2時間固定します。 長期保存する場合は、細胞をPBSで2回洗浄し、細胞を50%(v / v)のPBSと96%エタノールの1 mLに再懸濁し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。

2. 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)(図2B)

  1. シアニン5(Cy5)フルオロフォア(Gam42a-Cy5)で標識されたGam42a10オリゴヌクレオチドプローブで大腸菌細胞をハイブリダイズし、シアニン3(Cy3)フルオロフォア(Bac303-Cy3)で標識されたBac30311オリゴヌクレオチドプローブでB.シータ細胞をハイブリダイズします。
    注:同定のためのrRNA-FISHの基礎:rRNA分子は、微生物細胞内に遍在し、自然に増幅されるため、FISHの理想的なターゲットです。また、rRNAには保存された配列領域と可変配列領域の両方が含まれているため、ターゲットグループの系統発生の深さは、オリゴヌクレオチドプローブの保存度によって決定できます。設計されたプローブを標的配列に特異的に結合させることにより、タグ付き蛍光色素は個々の細胞の蛍光シグナルを示します。
  2. 蛍光in situハイブリダイゼーションの詳細なプロトコルについては、以前に発表された文献12,13,14を参照してください。以下のステップでは、微生物細胞の標準プロトコールについて簡単に説明します。
    1. 脱水：
      1. 固定細胞(100 μL)を14,000 x g で10分間遠心分離し、ペレット化し、96%分析グレードのエタノール100 μLに再懸濁し、室温で1分間インキュベートします。
      2. その後、細胞を再び14,000 x g で5分間遠心分離し、エタノールを除去し、細胞ペレットを空気中で乾燥させます。
    2. ハイブリダイゼーション:溶液(100 μL)中の細胞を46°Cで3時間ハイブリダイズします。
      注:ハイブリダイゼーションバッファーは、900 mM NaCl、20 mMトリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタンHCl、1 mMエチレンジアミン四酢酸、0.01%ドデシル硫酸ナトリウム、100 ngのそれぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチド、およびストリンジェントな条件を得るために必要なホルムアミド濃度で構成されています。
    3. 遠心分離機:ハイブリダイゼーションの直後に、46°Cに予熱したローターを備えた遠心分離機にサンプルを移し、14,000 x g で最大許容温度(通常は40°C)で15分間遠心分離します。
    4. 洗って保管する:
      1. 適切なストリンジェンシーのバッファーでサンプルを48°Cで15分間洗浄します。 次に、46°Cに予熱したローターを備えた遠心分離機で、細胞を14,000 x g で最大許容温度で15分間遠心分離します。
      2. 最後に、細胞を氷冷PBS500μLで洗浄し、1x PBSの20μLに再懸濁し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
        注:プローブの特異的結合は、正しいハイブリダイゼーションストリンケンシーによって保証されます。ハイブリダイゼーション温度を上げるか、塩濃度を下げるか、変性剤ホルムアミドを添加することで、高いストリンジェンシーを達成できます。ホルムアミドは、核酸二本鎖を安定化する水素結合と干渉します。ここでは、ホルムアミド濃度を調整しながらハイブリダイゼーションで温度と塩濃度を変更しません。新たに設計されたプローブの最適なホルムアミド濃度は、ホルムアミド解離曲線10を用いて実験的に決定される。公開されたプローブに必要なホルムアミド濃度は、probeBase15または文献検索で見つけることができます。あるいは、mathFISH16を用いたインシリコ分析から予測されるホルムアミド濃度を得ることができます。洗浄工程では、温度がわずかに高いほど条件がわずかに厳しくなり、結合特異性が高くなります。

3. サンプル調製(図2C)

  1. スライドのクリーニングとコーティング:
    1. 標準化されたCaF2 スライド(装置サンプルホルダーとの互換性のために、直径10 mm、厚さ350 μm)を使用してください。CaF2 を70%エタノールに15分間浸漬し、脱イオン水で2回すすぎます。
    2. 洗浄したスライドを0.1%ポリ-L-リジン溶液に移し、4°Cで一晩インキュベートします。 スライドをDI水で一度すすぎ、空気中で乾燥させます。
  2. 調製した細胞サンプルを光から保護した状態でRTで解凍します。
  3. サンプル乾燥中にPBSからの過剰な塩結晶を避けるために、手順3.3.1〜3.3.2に従ってください。
    1. 細胞を脱イオン水(DI)で2回洗浄します。14,000 x g で10分間遠心分離し、上清を取り除きます。
    2. 元のDI水の量を戻し、穏やかに渦を巻きます。遠心分離を繰り返し、DI水洗浄を再度加えます。
  4. (オプション)混合サンプルの場合は、各サンプルから同じ量を移し、1本の遠心チューブに混合します。
  5. 細菌細胞サンプルを14,000 x g で10分間遠心分離して濃縮し、上清を除去します。
  6. 残りの溶液を~30秒間穏やかにボルテックスし、調製したCaF2 スライドに1〜2μLの溶液を加えます。光を避けながら、サンプルを30分間風乾します。
    注意: 風乾後、スライドに小さな丸い点が表示されます。「コーヒーリング」効果により、ドットのエッジは細菌細胞の密度が高くなります。この遠心分離ステップは、効率的な単一細胞細菌イメージングのための適切な密度に到達するためのものです。理想的な濃度は、顕微鏡下で個々の細菌細胞の均一で密な層につながるはずです。遠心分離後に肉眼で見える透明なペレットがある場合は、上清を取り除き、渦巻きの後、溶液がほぼ透明に見えるようにします。コントロールサンプルに対してクイックテストを実行して、上清の除去量を推定できます。上清の量が異なる液滴の配列を顕微鏡スライドガラス上に堆積させて、明視野顕微鏡下での最適な希釈量を調べることができます。遠心分離後に目に見えるペレットがない場合は、サンプルを最大限濃縮するために、上清の大部分を取り除きます。秘訣は、ペレットがチューブヒンジの同じ側に表示されるように、ヒンジが外側にあるように遠心分離チューブを固定角度ローターに配置することです。さらに、ピペットサイズ(P1000、P200、P10)をグレードダウンして、上清除去の精度を高め、ペレットを無傷に保ちます。
  7. スライドを付属のサンプルホルダーに取り付け、ポリエステルテープの小さなドットを使用して測定中にスライドを固定します。

4. OPTIR-FISHイメージング

注:蛍光イメージングとOPTIRイメージングは、OPTIRシステムで実行されます。

  1. システムジオメトリ:
    1. 中赤外ポンプと可視プローブの逆伝播を使用し、このプロトコルで可視光の後方(エピ)検出を行います。
    2. 可視光線を集光し、後方反射および散乱した可視光を収集するには、空気対物レンズ(50 x 0.8NA)を使用します。中赤外光の焦点を合わせるには、カセグレン対物レンズ(40x 0.78NA)を使用します。
    3. また、システムに複数の蛍光フィルターセットを備えた広視野落射蛍光モジュールが装備されていることを確認してください。このプロトコールで使用する蛍光色素については、Cy3検出用の緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターセットとCy5検出用のAlexa Fluor 647フィルターセットを選択します。
  2. 測定の準備をします。
    1. システムの電源を入れ、機器制御ソフトウェアを開きます。初期化後、 Counterprop と Fluorescence スライダーをオンの位置に切り替えます。
    2. 対物レンズを50倍に設定し、 自動バックグラウンド を実行してIRパワースペクトルを取得します。パワースペクトルを使用して、取得したサンプルスペクトルを正規化したり、異なる波数でOPTIR画像を正規化したりします。これにより、中赤外レーザーの出力差がデータ解析と定量に及ぼす影響が除外されます。
      注:測定された強度はIRパワーに直線的に関連しているため、正規化のためのIRパワースペクトルの取得は、ダウンストリームの定量分析に不可欠です。 自動バックグラウンドを実行した後、ソフトウェアはOPTIRスペクトルとOPTIR画像をユーザーのために自動的にIRパワースペクトルに正規化します。システムをN2 でパージすると、水蒸気の影響を最小限に抑え、実験間の再現性を高めることができます。
  3. サンプルをロードするには、「 Unload 」ボタンを使用してサンプルステージを移動します。10倍などの低倍率の対物レンズを使用してサンプル領域を特定し、最適なサンプル密度の領域に移動します。制御ソフトウェアで対物レンズの高さを調整して、サンプルの焦点を合わせます。目標選択を50倍に変更します。
  4. 画像取得
    注:使用されるサンプルは、i) 大腸菌 (13C-グルコースをインキュベート);ii) 大腸菌 (12C-グルコースをインキュベート);iii) B. シータ (12C-グルコースをインキュベート);iv) 大腸菌 (13C-グルコースインキュベート)と B.シータ (12C-グルコースインキュベート)の混合物。
    1. 明視野画像(図2D):明視野画像を見て、サンプルにピントを合わせます。
    2. 蛍光画像(図2E):フィルター名ボタン(Cy3の場合はGFP 、Cy5の場合は Alexa Fluor 647 )をクリックしてフィルターセットを変更し、設計されたFISHプローブに関連する蛍光色素を検出し、ソフトウェアの蛍光モジュールを使用して蛍光イメージングを順次取得します。蛍光色素を漂白する前に、光の強度と露光時間を調整して、適切な信号コントラストを得てください。
      注:OPTIR測定に使用するプローブは蛍光色素を光退色する可能性があるため、常にOPTIR画像の前に蛍光画像を取得してください。蛍光マーカーがOPTIR検出に及ぼす影響については、Cy5が標的細菌タンパク質9と比較してサイズが小さく、存在量が少ないため、Cy5蛍光色素を含むFISHがOPTIR画像に基づく以下の定量に影響を与えないことを実証した以前に発表された研究を参照してください。
    3. OPTIR画像(図2F):
      1. 通常のピークと同位体によって誘起された赤方偏移したピーク位置を決定します。 13C-グルコースからのタンパク質合成の場合、正常なアミドIのピークは約1656 cm-1で検出され、赤方偏移のピークは約1612 cm-1 で検出されます(図3A)。
        注:正常なピーク位置は、対象の生化学的成分および/または代謝産物によって異なります。シフトするピーク位置は、標識にどの同位体を使用するかによっても異なります。これら2つの波数は、非標識細胞と最大標識細胞の完全なスペクトルを測定することによって実験的に決定することもできます(ステップ4.5を参照)
      2. ソフトウェアを使用して、IRポンプの波長を1656 cm-1 に調整します。DC信号(8 V)の飽和を避けるために、プローブの電力と検出器のゲインを適宜変更します。下部のカセグレン対物レンズの高さを微調整して、AC信号を最大化します。
        注:サンプルの一般的なIR電力は約5 mWで、サンプルのプローブ電力は約3〜15 mWですampファイルによって異なります。IRとプローブの両方のパワーは、制御ソフトウェアを使用してパワーレベルを最適化し、セルの損傷を避けながら高い画像コントラストを確保できます。
      3. OPTIR画像に200 x 200ピクセルが含まれるように設定し、スキャンレートを100μm / sに設定します。X方向とY方向のステップサイズを150nmに設定すると、画像サイズは約30×30μm2になります。
      4. 画像を取得します。
      5. IRポンプの波長を1612 cm-1 に調整し、この波数で同じ視野から画像を取得します。
      6. 各サンプルについて、統計分析のために少なくとも 3 つの視野を画像化します。
  5. (オプション)スペクトル測定:画像取得後、対象の空間的特徴が見つかった場合は、スペクトル測定を実行します。
    1. 位置を選択:ソフトウェアのSpectralモジュールで解析する単一のポイントを選択するか、ポイントの配列を指定します。
    2. スペクトルスキャンパラメータを設定します。要件に基づいて、波数の範囲、スキャン速度、およびデータ出力間隔を選択します。
      注:スキャン速度とデータ出力間隔がバックグラウンド取得ステップ(ステップ4.2)で使用したものと異なる場合、正しい正規化のためには、現在のスペクトルスキャンパラメータに基づく新しいバックグラウンドが必要です。
    3. 共平均化数を設定し、スペクトル測定を開始します。共平均化を増加させると、スペクトルのS/N比も増加しますが、取得時間が長くなります。
      注:共平均化中に大きな変動が観察された場合は、レーザー加熱によるサンプルの不安定性を示している可能性があります。これは、多くの場合、IR電力を下げるか、可視プローブ電力を下げることで対処できます。

5. シングルセルレベルでのデータ処理と分析

  1. 同位体基質からの代謝合成の定量化(図2G)
    注:同位体基質からの代謝取り込みの以下の定量化は、標的高分子の正常ピークとシフトピークに対応する2波数OPTIR画像に基づいています。完全なハイパースペクトルスタックと比較して、2波数イメージングは、各FOVに必要な時間を大幅に短縮し、スループットを向上させながら、代謝定量化に不可欠な同位体効果を完全に再捕捉することができます。
    1. 通常のピークOPTIR画像からシフトしたピークOPTIR画像を差し引くと、同位体基質からの合成活性の視覚的なマップが生成されます。デモンストレーション(図3C)として、13C-グルコースで培養した大腸菌の場合、(1656 cm-1-1612 cm-1)画像の正のピクセルは、13Cがタンパク質に積極的に取り込まれているため、タンパク質合成レベルが高いことを示しています。
      注: 減算は、ImageJ Image Calculator 関数を使用して実行できます。あるいは、減算は、バッチ処理のために任意の好ましいプログラミング言語で簡単に実行できます。
    2. シングルセル代謝活性の定量化
      1. 係数(図2Gのhで表される)を、非標識参照サンプルと完全標識参照サンプルから取得します。同位体によって誘発された赤方偏移したピークは正常なピークと部分的に重なるため、非標識サンプルと標識されたサンプル(同位体標識された基質から新たに合成されたサンプル)の両方が、正常ピークとシフトピークでのOPTIRシグナルに寄与します。非標識参照サンプルと完全標識参照サンプルの正常ピークとシフトピークでの正規化された OPTIR シグナル強度を使用して、これらのさまざまな寄与を定量化します。
        注:参照サンプルの場合、非標識参照サンプルは、同位体標識基質なしで成長(またはインキュベート)されます。完全に標識された参照サンプルは、通常、最も長い培養時間で、同位体標識基質の最高濃度で成長します。
      2. シングルセル解析では、明視野画像に基づいてシングルセルマスクを取得します。
        注:ここでは、ブロブ分析などのさまざまな粒子検出や流域などの細胞セグメンテーション方法など、画像処理のさまざまな手法を適用してこのマスクを生成できます。
      3. 個々の細胞からのOPTIRシグナル強度を測定します。取得したシングルセルマスクを2つのOPTIR画像(ノーマルピークとシフトピーク)に適用し、各シングルセルについて、シングルセルマスク領域のピクセル値を平均化します。個々の細胞からの平均値は、定量化に使用されます。
      4. 各細胞について、ステップ5.1.2.1の係数とステップ5.1.2.3のシグナルに基づいて、非標識バイオ成分と標識バイオ成分の相対的な寄与を計算します。
        注:同位体置換比は、標識された生体成分と非標識生体成分の両方の合計に対する標識された生体成分の相対的な寄与として定義されます(図2G)。この比率は 0 から 1 の範囲に収まる必要があります。同位体置換比は、13C-グルコース対12C-グルコース比(固定総グルコース量)9に直線的に比例する。大腸菌細胞では、5% 13C-グルコースの高い検出感度が実証されています。
  2. マルチチャンネル蛍光画像からの細菌種の同定(図2H)
    1. マルチカラー蛍光チャンネルをマージし、ImageJ(Image > Color > Merge Channels)を使用して、さまざまな細菌種の視覚的なガイダンスを作成します。
    2. シングルセル解析では、蛍光チャネルごとに、個々の細胞の関心領域(ROI)のセットを生成します。
      注:ここでは、さまざまな自動しきい値処理方法や細胞セグメンテーション方法など、画像処理のさまざまな手法を適用してマスクを生成できます。
  3. FISHの同定とOPTIR代謝活性の相関関係(図2I)
    1. ROIの位置を相関させることにより、FISH蛍光画像からのシングルセルレベルの細菌の同定をOPTIR画像からの代謝活性に直接リンクします。
    2. 統計分析を実行して、さまざまな種の代謝活動を比較します。
      注:マスクは、OPTIR画像からすべての細胞について代謝活性を分析できる一方で、未知の細胞はどの蛍光チャネルにも表示されないため、蛍光画像およびOPTIR画像とは別に生成されます。これにより、すべての細胞を代謝解析に含めることができます。同定されていない細胞が多数ある場合は、目的の異なる分類群のrRNAを標的とする異なるFISHプローブを検討する必要があるかもしれません。

結果

OPTIR-FISHによる遺伝子同定によるシングルセル微生物代謝解析の一般的なワークフローは、以下にまとめられています。 図 2.OPTIRのシングルセル代謝イメージング能力を示す代表的な結果は、以下の通りです。 図 3.この例では、大腸菌細胞をインキュベートしました。 12C- または 13C-グルコースを24時間。の組み込み 13Cからタンパク質へのCは、タンパク質アミドIおよびIIの有意な赤方偏移を引き起こすことが示されています(図3A)17,18.したがって、これらの2つの主要な波数は、 12Cタンパク質(1656 cm-1、ノーマルアミドIバンド)と 13Cタンパク質(1612 cm-1、シフトアミドIバンド)を選択し、これら2つの波数でのOPTIR画像を取得しました。対応する明視野画像も示されており、細胞の形態を示しています(図3B,E).棒状細菌は、明視野画像とOPTIR画像の両方で単一細胞レベルで明確に分離でき、OPTIR技術の高い空間分解能(図3B-G).でインキュベートした細胞の場合 12C-グルコース(図3B-D)、1656 cm で強度が高くなります-1 が観察されましたが、より高い1612 cm-1 インキュベートした細胞の強度が観察されました。 13C-グルコース(図3E-G).このピークシフトは、タンパク質の質量に重い炭素同位体が取り込まれていることを示しています17.評価は、OPTIR-FISHが細菌分類群とその代謝活性を識別する能力を複数種サンプルで評価するために拡張されました。私たちは、ヒトの腸内細菌叢に蔓延する2つの細菌種を人工的に混合しました。 E. coli そして B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli でインキュベートされた細胞 13C-グルコースは、ガンマプロテオバクテリアの23S rRNAを標的とするGam42a-Cy5プローブとハイブリダイズされました10. B. theta でインキュベートされた細胞 12C-グルコースは、ほとんどのBacteroidaceae種の16S rRNAを標的として、Bac303-Cy3プローブとハイブリダイズされました11.明視野画像に基づいて2つの種を区別することは非常に困難です。なぜなら、それらは両方とも棒状(図4A).したがって、ハイブリダイズプローブのマルチカラー蛍光イメージングは、分析された各細菌細胞に分類学的同一性を割り当てるために不可欠でした(図4B).1612cmで取得したOPTIR画像を差し引くと-1 1656cmのものから-1、このバイスピーシーズサンプルの細胞セグメントが正の減算値(図4C)の組み込みを示します。 13C同位体。培養条件に基づいて、正の減算値を持つ細胞を次のように割り当てました E. coli、および負の減算値を B. theta.細菌種の割り当ては、蛍光イメージング結果によって確認されます:正の減算値を生成する細胞は、Cy5造影剤を生成します。 E. coli、および負の減算値を生成するセルは、 B. theta-特異的なCy3コントラスト。次に、同位体置換率を算出し、この場合は新たに合成しました 13C-タンパク質 13C-グルコース(図4D).予想通り、2つの細菌種間の同位体置換比には有意差がありました(ペアワイズt検定、p = 9.74 x 10-33)が観察された。このデータセットは、OPTIR-FISHプラットフォームを適用して、複数のサンプル種が存在する複雑な環境で代謝を研究することの実現可能性を強調しています。

微生物分析;蛍光ハイブリダイゼーション、同位体標識、OPTIRイメージング、遺伝子型表現型。
図1:種同定と代謝解析を同時に行うためのOPTIR-FISHプラットフォームの概略図。 微生物群集のさまざまなメンバーは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーションによる微生物リボソームRNAプローブの特異的結合によって同定され、付着した蛍光色素の蛍光イメージングによって検出されます。代謝活性は、同位体基質を用いて培養し、OPTIRイメージングによって検出することで解析できます。OPTIRイメージングは、IR吸収によって誘発される散乱変化を検出し、OPTIRは広く使用されている蛍光ツールと本質的に互換性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

同位体標識プロセス図:微生物FISH、OPTIR分析、同一性決定、比率。
図2:OPTIR-FISHによる遺伝子同定による代謝活性のシングルセル解析の一般的なワークフロー (A)細菌細胞を同位体標識基質で培養した。(B)次に、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行った。(C)IR透過スライド上のサンプル調製。(D)明視野画像は、最適な細胞密度を持つ領域を特定します。(E,H)異なるFISH蛍光色素のマルチカラー蛍光イメージングにより、FISHプローブによって特定された、または不明のままである個々の細胞の遺伝的同一性が明らかになります。(F,G)その後の正常ピークとシフトピークでのマルチスペクトルOPTIRイメージングにより、微生物バイオマスへの同位体取り込みが明らかになります。非標識サンプルと完全標識サンプル(係数h)のOPTIRスペクトルを参照すると、通常の(cr)および同位体(ci)の生体成分の相対的な寄与を定量化できます。代謝された同位体標識基質からのタンパク質合成は、「同位体置換比」を用いて定量されました。(I)OPTIR-FISHにより、複雑な集団における微生物種の代謝活性のハイスループット分析を得ることができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

12C/13C-グルコースを用いた大腸菌の分光法。OPTRIRスペクトル;明視野画像とOPTIR画像。
図3:代表的なOPTIRスペクトルとイメージング結果 (A)アミドIおよびアミドII領域を覆う12個のC-グルコース(シアン)および13個のC-グルコース(オレンジ色)で培養した大腸菌細胞のOPTIRスペクトル。13個のC-グルコース培養細胞について、明確な赤方偏移アミドIピーク(1656 cm-1〜1612 cm-1)が観察されます。(B-D)12C-グルコースおよび(E-G)13C-グルコース培養条件下での正常アミドIおよびシフトアミドIバンドにおける大腸菌細胞の代表的な明視野およびOPTIR画像。スケールバー:10μm。この図は、Bai et al.9の許可を得て修正されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

OPTIR減算、大腸菌およびシータ菌の定量化チャートを使用した明視野およびFISH顕微鏡画像。
図4:細菌混合物の代表的な画像と定量結果。 大腸菌細胞を13個のC-グルコースとインキュベートした後、オリゴヌクレオチドプローブGam42a-Cy5とハイブリダイゼーションしました。B. θ細胞を12個のC-グルコースとインキュベートした後、オリゴヌクレオチドプローブBac303-Cy3とハイブリダイゼーションしました。(A)明視野画像は、細胞混合物の形態を示す。(B)2色蛍光画像は、大腸菌(赤)とシータ菌(緑)の分布を示しています。(C)OPTIR減算結果(1612cm-1-1656cm-1)は、細菌細胞のタンパク質代謝を示しています。(D)13C-グルコースから新たに合成された13C-タンパク質を表す同位体置換比の定量化。(ペアワイズt検定:p = 9.74 x 10-33)。スケールバー:10μm。この図は、Bai et al.9の許可を得て修正されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、OPTIR-FISHプラットフォームを適用して、微生物種の同定と代謝活性の定量をシングルセル分解能で同時に行うための詳細なプロトコールについて説明しました。重要なステップには、特定の代謝活性を研究するための安定同位体標識による培養と、標的微生物種を特定するための蛍光 in situ ハイブリダイゼーションが含まれます。選択した波数でのマルチチャンネル蛍光イメージングとOPTIRイメージングを同じ顕微鏡で連続して実行できます。これらの画像を定量的に分析して、複雑なコミュニティ内のさまざまな種の代謝活性レベルを明らかにする方法を紹介しました。このプロトコルは、複雑なコミュニティ内の多様な種の代謝研究にとって特に魅力的です。

ここでは細菌を例に挙げましたが、このプロトコルは真菌や哺乳類細胞などの他の生物にも適用できます。重要なポイントの1つは、通常の対応物を含まない培養培地に標的代謝プロセスの振動プローブを追加することです。例えば、脂肪酸からの脂質代謝を研究する場合、脂肪酸はもともとFBSに由来するため、アジド標識脂肪酸は、脱脂質ウシ胎児血清(FBS)で構成される標準的な培地に添加する必要があります。さらに、インキュベーション時間は、さまざまな真菌や哺乳類の細胞の成長率と一致する必要もあります。これにより、細胞の正常な増殖を確保しながら、標的高分子の振動プローブの標識効率を最大化します。

ここで説明するプロトコルは、グルコースからのタンパク質合成以外の代謝プロセスの研究にも適合させることができます。タンパク質、脂質、核酸、炭水化物など、すべての主要な生体分子は、OPTIR19,20でイメージングできます。さらに、13C、15N、18O、および2Hなどの同位体標識、およびC≡CおよびC≡Nなどの振動タグの低分子への付加を含む、標識戦略の広範な選択がある21。標識サイズが小さく、生体適合性が高いため、蛍光類似体と比較して代謝研究に適した方法です。異なる振動プローブを使用して他の代謝プロセスを研究するために、このプロトコルは、細胞培養および代謝標識ステップ、ならびに対応する参考文献21,22,23に記載されている異なるプローブおよび代謝産物に基づく波数選択を含む変更することができる。例えば、ヒト由来の二次元(2D)および三次元(3D)培養系におけるアジドパルミチン酸からの新たに合成された脂質のマッピング24、マクロファージ細胞におけるアジドホモアラニンからの新たに合成されたタンパク質のイメージング23、PC3細胞における重水素グルコースによるグルコース代謝のイメージング25、ヒト腸内細菌叢26における活動マーカーとしての重水からの重水素取り込みの解析などが挙げられる。

このプロトコルの潜在的な制限は、複雑なコミュニティでの検出限界が13°Cであることです。ここで使用した純粋培養では、検出限界が全炭素9中の13Cの5%であることを示しました。また、13個のC標識大腸菌細胞を非標識ヒト複合体腸内細菌叢サンプルと完全に混合することにより、さまざまな非標識腸内細菌叢種に由来するさまざまな細胞化学組成に関連する潜在的なスペクトル変動にもかかわらず、代謝プロファイルに基づいて大腸菌を自信を持って区別できることを実証しています9.しかし、存在する微生物種のユニークな生理機能の影響を受ける複雑な微生物群集は、一貫性のない13°Cの同化率を示すことがあります。このような場合、複雑なコミュニティの文脈で、OPTIR-FISHの13個のC標識細胞および12個のC標識細胞の代謝分化能力をさらに試験する価値があります。プラットフォームのパフォーマンスをさらに向上させることができます。例えば、広視野OPTIRセットアップを組み合わせることにより、イメージング速度を大幅に向上させることができる27。機械学習に基づく高度なノイズ除去方法をプラットフォームに組み込むことで、イメージング速度をさらに向上させることができる28,29。微生物細胞内の詳細な代謝物分布をよりよく視覚化するために、最近開発された超解像技術を採用することができる30,31。

このプロトコールの重要なステップには、オリゴヌクレオチドプローブの合理的な設計、ホルムアミド濃度の最適化、およびハイブリダイゼーション環境の慎重な制御によって達成できる、標的微生物のFISH標識の効率の最適化が含まれます。ハイスループット分析のために適切なシングルセル密度でサンプルを調製することは、実際にハイスループットを行うために重要です。また、定量化に十分なシグナルを得るために、システムを最適化することも重要です。これは、自動バックグラウンドステップ中に機器制御ソフトウェアで自動的に行われます。標準的なCaF2 スライドの代わりに異なるタイプのスライドを使用するなど、サンプル調製に偏差がある場合は、ソフトウェアで手動最適化を実行できます。手動最適化ステップでは、中赤外位置の配列をスキャンすることにより、中赤外光と可視光のオーバーラップが最適化されます。主な課題には、最適な振動基質と対応するOPTIR波数を選択して、関心のある代謝活動を定量化することが含まれます。

結論として、この研究は、OPTIR-FISHプラットフォームによって、代謝活性と微生物の同定がシングルセルレベルで同時に達成される方法を示しています。この詳細なプロトコルは、広く使用されている蛍光ツールとの高い互換性を持つこの新しい振動イメージングプラットフォームの広範な採用を促進するための有用なガイダンスを提供し、ライフサイエンスと医学の多様な分野でのアプリケーションを可能にし、新しい発見の機会を解き放つと信じています。

開示事項

Y.B.は、Photothermal Spectroscopy Corp.の非常勤コンサルタントです。

謝辞

この研究は、J.X.C.R01AI141439国立衛生研究所R35GM136223の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96% エタノールThermoScientificT032021000
フッ化カルシウムCrystranCAFP10-0.35
D-(+) -グルコースSigma-AldrichG7021-1KG
D-グルオコース (U-13C6、99%)ケンブリッジ同位体研究所CLM-1396-1
エチレンジアミン四酢酸Sigma-AldrichE9884-100G
ホルムアミドThermoScientific17899
Luria-Bertani ブロス Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Minimal Salts 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR機器Photothermal Spectroscopy Corp.mIRage LS
パラフォアルデヒド溶液、PBSThermoScientificJ19943-K2
ポリ-L-リジン溶液 0.1% (w/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9888-25G
ドデシル硫酸ナトリウムSigma-AldrichL3771-25G
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩、99+%ThermoScientificA11379.18
Trypic SoyブロスSigma-Aldrich22092-500G

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