方法論記事

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

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DOI:

10.3791/66566

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2024年4月19日

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

この記事について

サマリー

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。

要約

肺移植後の合併症は、移植片に反応する宿主の免疫系に大きく関連しています。このような免疫応答は、ドナー細胞とレシピエント細胞の間のクロストークによって制御されます。これらのプロセスをより深く理解するには、前臨床動物モデルの使用に依存しており、移植片内の免疫細胞の輸送をリアルタイムで研究する能力によって支援されます。生体内2光子顕微鏡は、光損傷を最小限に抑えて数百ミクロンまでの深さの組織や臓器を画像化するために使用できるため、単一光子共焦点顕微鏡法よりも大きな利点があります。プロモーター特異的な蛍光タンパク質発現を有するトランスジェニックマウスの選択的使用および/または生体内二光子顕微鏡における蛍光色素標識細胞の養子移入により、生理学的環境内での単一細胞の動的研究が可能になります。 私たちのグループでは、マウスの肺を安定化させる技術を開発し、ナイーブ肺や同所移植された肺移植片の細胞動態を画像化することを可能にしました。この技術により、血管系内および間質内の細胞挙動を詳細に評価できるだけでなく、さまざまな細胞集団間の相互作用を調べることができます。この手順は、肺移植後の炎症反応と寛容性反応を調節する免疫メカニズムを研究するために容易に習得し、適応させることができます。また、他の病原性肺疾患の研究に拡大することもできます。

概要

肺移植は、末期肺疾患に苦しむ多くの患者にとって最終的な選択肢です。しかし、肺移植後の長期生存率は、他の固形臓器移植に比べて劣っています。5年での生存率はわずか60%~70%1ですが、心臓2では80%-90%、腎臓では85%-90%です3。原発性移植片機能障害、抗体媒介性拒絶反応、慢性肺同種移植片機能障害など、肺移植後の多くの合併症は、同種移植片に対する宿主の免疫応答によるものです。例えば、私たちのグループでは、移植による虚血再灌流障害の後、好中球が急速に肺同種移植片に動員され、血液単球を取り囲むダイナミックなクラスターを形成することを示しました4。ドナー細胞とレシピエント細胞との間のクロストークは、有害な同種免疫応答5,6,7の原因であり、生きた動物モデルでこれらの動的な細胞相互作用を研究する能力は非常に貴重です。

二光子顕微鏡は、組織の光退色を最小限に抑えながら、数百ミクロンまでの深さの高解像度の生体内イメージングを可能にする8,9。新皮質10,11、皮膚12,13、腎臓14,15など、さまざまな組織や解剖学的部位に使用されています。最近では、肺や心臓などの非静的臓器に適応しています4,16,17。このプロトコルでは、マウスの同所性左肺移植後の安定化、換気、および灌流された肺移植片を画像化する技術について説明します。移植モデルの主な利点は、ドナーとレシピエントを別々に遺伝子操作できることです。個々の細胞集団は、ノックイン蛍光タンパク質発現、蛍光標識細胞の養子導入5、または細胞特異的マーカー4,16,17,18に結合するための蛍光標識抗体の静脈内注射をしたトランスジェニックマウス株を用いて可視化することができる。

イメージング中に肺を安定させるために、このプロトコルは、肺をカバーガラスに接着することを含むが、他のグループは、カスタムメイドのリバーシブル真空装置19を用いた吸引安定化を記載している。当社のプロトコールには、イメージングの領域が広いことや、顕微鏡ラボで一般的に入手可能な材料(カバーガラスや接着剤など)を使用したセットアップが比較的容易であることなど、いくつかの利点があります。この接着技術は上面で肺を拘束するため、換気運動を減らし、より深いイメージングを可能にすることが期待されます。この生体内イメージング技術により、免疫細胞の挙動や相互作用をリアルタイムで詳細に観察することが可能となり、肺移植後の炎症反応と寛容性反応を調節する免疫機構の研究に貢献しています。

プロトコル

すべての動物取り扱い手順は、国立医療研究所および実験動物の使用ガイドラインに準拠して実施され、ワシントン大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.麻酔と挿管

注:同所性マウス左肺移植は、前述のように行われます20,21。20-25 gのC57BL/6(B6)マウスの肺を、性別および年齢が一致したB6レシピエントに移植します。B6です。LysM-GFPレポーターマウスは、肺移植片への好中球浸潤を視覚化するための特定の実験のレシピエントとして使用されます。レシピエントマウスは、肺移植の直後に画像化することができます。

  1. ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)の腹腔内投与でマウスを再麻酔します。.徐放性ブプレノルフィン(0.5-1.0 mg / kg)を皮下投与して、追加の鎮痛剤を投与します。.足をつまんで適切な麻酔の深さを確認します。
    注: 肺移植と計画された生体内イメージングの間の時間が 2 時間未満の場合は、ケタミンの初期用量の 50% で麻酔薬を再投与できます。
  2. 電動バリカンで左胸全体の毛を取り除き、胸部を拭いて余分な刈り取られた毛を取り除きます。
  3. 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの目に非薬用眼科軟膏を塗布します。.
  4. 前に説明したように、20G血管カテーテルを使用してマウスを口腔気管に再挿管します21。
  5. 室内の空気で120回/分、潮汐量0.5ccで換気します。
  6. 全手順で1%イソフルオランを気管内に送達します。.
  7. イメージング中に血管を可視化するには、イメージングの少なくとも5分前に、50 μLのリン酸緩衝生理食塩水に20 μLの655 nmノンターゲット量子ドット(qドット)を静脈内注入します。

2. 画像診断のための左肺の外科的準備

  1. マウスを右の横方向の褥瘡の位置に置きます( 図1Aを参照)。
  2. 0.75%のヨウ素と70%のエタノールの混合物で胸部の皮膚を3回消毒します。
  3. 左開胸術(マウス肺移植による)を3番目の肋間腔から再開します( 図1Aを参照)。
  4. 左開胸術部位の皮膚と軟部組織の一部(1.5 cm x 1.5 cm)を切除します( 図1Bを参照)。
  5. 肋骨切除の前に、まず肋骨を ~10 秒間クランプして、任意の微小血管系を血栓にして止血を達成します ( 図 1C、D を参照)。
  6. 3番目 から 5番目の 肋骨の一部を切除して、肺を脱出するのに十分な大きさのイメージング ウィンドウを作成します (頭蓋尾側 ~0.8 cm、前後 ~1.0 cm、 図 1D、E)。
  7. 電気焼灼でリブの端からの追加の出血を止めます。
    注:イメージング期間中の過度の失血を避けるために、肋骨の切断端で止血を達成することが重要です。
  8. 右胸の下に小さな隆起(縦に3回折りたたまれた4 cm x 4 cmのガーゼ)を置きます( 図1Eを参照)。
  9. 綿棒を使用して、肺移植片を胸から持ち上げ、肺の下部を生理食塩水を浸したガーゼの1 cm x 3 cmのストリップに置きます( 図1Fを参照)。
    注:この生理食塩水に浸したガーゼのストリップは、肺の滑りを防ぎ、肺の湿った環境を維持し、切除された肋骨の鋭いエッジから肺を保護し、肺を心臓の動きから分離します。円周イメージングチャンバーを肺に適用すると(図1G、H、セクション3で説明)、イメージング期間中の開いた胸腔からの熱と体液の損失は最小限に抑えられるはずです。

3. イメージングチャンバーの準備

注:イメージングチャンバーはカスタムビルドです( 図2Aを参照)。このイメージングチャンバーは、ベースプレートとトッププレートで構成されており、その間にマウスが配置され、両側にバネ仕掛けのボルトで固定されています(図2B)。天板には直径~2cmの円形の切り欠きがあります。対応するサイズの黒いOリングがトッププレートの前面にあるこの開口部に配置され、対物レンズを保護します(図2C)。天板の裏面には24mm×50mmのカバーガラスを高真空グリースで接着し、防水シールを実現。このカバーガラスは、下の肺に付着し、上にイメージング媒体(すなわち、水)を保持することにより、イメージングウィンドウとして機能します。真空グリースが円形のイメージングウィンドウ内に入らないようにしてください。カバーガラスは、新しいイメージング実験ごとに交換されます。ベースプレートは、熱電対温度プローブを使用して35〜37°Cに加熱されます(図2A)。

  1. 挿管したマウスを、開いた左胸部を上に向けてイメージングチャンバーのベースプレートに置きます( 図1G、Hを参照)。マウスをシルクテープで顔、前足、尻尾に固定します( 図1H および 図2Aを参照)。
  2. トッププレートに取り付けられたカバーガラスの下面( 図2C、下部の灰色の円)に接着剤を塗布し、中央に0.8〜1.0cmの接着剤のない円を残します。
    注:接着剤のない円のサイズとモーションアーティファクトの量との間にはトレードオフがあります。したがって、円の直径は1.0cmを超えないようにすることをお勧めします。
  3. カバーガラスが肺に接触するまでトッププレートを下げ、接着剤が肺の表面に触れます( 図1Gを参照)。
    注:左肺はカバーガラスに接着され、中央にきれいな接着剤のない円が描かれます。
  4. カバーガラスを肺に当て、肺を1〜2秒間膨らませて、接着剤の領域が周囲の組織に付着するようにします。マウスの気管内チューブから人工呼吸器への流出チューブを閉塞することにより、肺の膨張を達成します。
    注:過度の圧外傷を引き起こす可能性があるため、肺を1〜2秒以上膨らませないでください。
  5. 肺組織への圧力を減らすために、トッププレートを少し離します。イメージングウィンドウ内の肺の領域が換気によって動かないようにしてください。
  6. つまみナットを各ボルトに固定して、トッププレートの両端を固定します( 図2Bを参照)。

4. 2光子イメージング

注:生体内顕微鏡検査には、20倍または25倍>1.0NAの水浸対物レンズを備えた固定ステージの正立顕微鏡を使用する必要があります。以下は、この調査で B6 から B6 のセットアップに使用したものです。655 nm q-dot血管標識によるLysM-GFP左肺移植。このプロトコルを適用すると、顕微鏡、レーザー、ダイクロイックフィルターのセットアップを、特定の実験や使用する蛍光レポーターのニーズに基づいて適合させることができます。

  1. 挿管されたレシピエントマウス(B6左肺をB6に移植した状態でイメージングチャンバー全体を配置します。LysM-GFP with 655-nm q-dots)を顕微鏡ステージに装着します( 図2Aを参照)。
  2. 480 nm、560 nm、635 nmの波長のダイクロイックフィルターを使用すると、GFPレポーター、qドット、およびコラーゲンによって生成された第2高調波発生(SHG)信号(445 nm)からの信号を適切に分離できます。これらのフィルターは、特定の実験に基づいて適合させることができます。
    注:コラーゲンによって生成されたSHG信号は、肺胞の空域を表す暗いクレーターのような構造を画定します( 図3の白い矢印を参照)。
  3. チタンサファイアフェムト秒パルスレーザーを890nm(近赤外域内)に設定して励起します。十分な信号を得るためには、できるだけ低いレーザー出力を使用してください。
    注:レーザー設定は、信号分離を最大化するために、特定の実験に合わせて調整する必要があります。
  4. トッププレートのカバーガラスを完全に覆うために~1mLの水を適用し、Oリングとカバーガラスの真空グリースシールによってトッププレートに固定されます( 図1G および 図2Cを参照)。
  5. 顕微鏡で20x >1.0 NA水浸対物レンズを使用します。対物レンズが特定の実験に基づいて適合していることを確認します。
    注意: NAが大きいほど、より多くの光を集め、コントラストを高くし、より詳細な画像を得ることができます。水浸対物レンズは、水またはバッファーが生体組織とより適合性が高いため、好まれます。
  6. 顕微鏡の対物レンズを水中に下げ、肺の表面に焦点を合わせます。
  7. ベースプレートヒーターを作動させ、温度を35〜37°Cに保ちます。
    注:組織温度を維持できない、または肺への適切な灌流ができないという懸念がある場合は、ベースプレートに加えてトッププレートを温めるために2つの追加の抵抗器を取り付けることができます( 補足図1を参照)。
  8. お好みの取得ソフトウェアで画像スタックを取得します。
    注意: 取得中は部屋が完全に暗くなっていることを確認してください。これには、遮光カーテン/ブラインドの使用と、すべての光源の戦略的カバーが含まれる場合があります。

5. ビデオ撮影

注:次のパラメータは、特定の実験に基づいて適合させることができます。手順5.1〜5.3では、B6からB6に使用される特定のパラメータについて説明します。Lysm-GFPマウス左肺移植は、リファレンスガイドとして使用できます。

  1. ビデオレートの双方向スキャナーを使用して、x-y スキャン寸法を 512 x 512 ピクセルに設定します。
  2. xyzステッパーユニットを使用して、21ステップの zスタックのタイムラプス録画を取得し、ステップごとに10フレームの平均化を行います。各スタックの集録には約20秒かかり、これにはフレーム平均化に必要な時間、ステッピングモータが移動してその位置を確認するのに必要な時間、および100msの遅延が含まれます。
    注:この研究で使用した顕微鏡の双方向スキャナーは、30フレーム/秒のビデオレートで動作します。これは、特定の顕微鏡のセットアップによって異なる場合があります。
  3. 80 個の連続した Z スタックを取得して、組織実質内の白血球移動のタイムラプス イメージングを取得します。これには、20 秒/スタックで約 ~27 分かかります。
    注:組織への過度のレーザー曝露を防ぐために、スタックサイズ、フレーム平均化、レーザー出力、およびタイムラプス記録の全長を最小限に抑える必要があります。使用する蛍光レポーターが明るく(GFPなど)、レーザー出力が低い場合、マウスでは、平均10フレーム、512 x 512ピクセルスキャンで21ステップの zスタックを20秒間隔で~27分間繰り返すことができます。より長いイメージング期間が必要な場合は、レーザーの総露光量を一定に保つために、スタックあたりの取得時間を長くする必要があります(つまり、~1.5時間にわたってスタックあたり1分)。これらの設定は、使用する蛍光レポーターに基づいて最適化する必要があります。
  4. 画像取得の最後にマウスを安楽死させます。安楽死させるには、マウスにケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)で麻酔をかけ、続いて子宮頸部脱臼を行います。一般的なイメージング調製物は、マウスの生存率を最大2時間容易に維持します。
    注:この期間を延長するには、追加の水分補給、イソフルランによる麻酔、および温度調節への注意が必要になる場合があります。.
  5. Imarisによる完全なビデオレンダリング。他のイメージングソフトウェア(ImageJなど)も使用できます。
    注:画像は、コントラスト強調、スムージング、およびチャネル演算を使用して取得後に処理され、チャネルクロストークを除去できます。

結果

4°Cで1時間の低温虚血保存後、B6マウスからB6マウスに左肺を同所的に移植しました。LysM-GFPマウス4を、次いで上記のように生体内二光子イメージングを行った。移植後の2つの時点でイメージングを行いました-2時間(図3A)と24時間(図3B)です。血管は、イメージングの直前に注入されたqドットによって赤で標識されます。さらに、24時間4でqドットを占有した単球を視覚化できます。緑色で標識されたレシピエント由来の好中球は、移植後24時間後の対応するビデオで肺移植片に浸潤しているのを見ることができます(補足ビデオ1)。肺胞は、コラーゲンからのSHGによる暗いクレーターとして視覚化できます( 図3の白い矢印)。移植後24時間では、移植後2時間と比較して、肺に好中球が多く存在することが観察されます(図3)。

figure-results-1
図1:2光子イメージングのためのマウスの準備(A)左開胸術で皮膚が再び開いた。(B)左胸部を切除した皮膚と軟部組織。(C,D)分割する前にリブを10秒間クランプします。(E) 左の 3本目から 5番目の肋骨を切除して、頭蓋尾側 ~0.8 cm x 前後 1.0 cm の窓を作成します。(F)左肺を左胸から持ち上げ、ガーゼのストリップに置きます。(G)イメージングウィンドウを備えたイメージングチャンバーが左肺を覆っています。(H)顕微鏡ステージ上に配置されたイメージングチャンバー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:イメージングチャンバーのセットアップ (A)顕微鏡ステージ上に配置されたイメージングチャンバー。(B)左肺の上にトッププレートを固定するためのバネ仕掛けのボルト機構の拡大図。(C)Oリングとカバーガラスを適用した天板の表裏。白い線は、カバーガラスをトッププレートに接着するために真空グリースを塗布する領域を表しています。灰色の円は、カバーガラスに塗布する接着剤のリングを表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:B6からB6へのマウス左肺移植の2光子生体内イメージング。1時間の低温虚血保存を施したLysM-GFPマウス。 イメージングは、移植後(A)2時間後および(B)24時間後に行われます。赤は q ドットを表します。緑はB6の好中球。LysM-GFPレシピエント。ブルーはコラーゲンが豊富な肺胞からのSHGを表しています。白い矢印は肺胞の空域を示しています。スケールバーは20μmを表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:追加の加熱を提供するために2つの抵抗器が取り付けられたトッププレート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:B6からB6への移植マウス左肺の2光子タイムラプスイメージング。移植後24時間で1時間の低温虚血保存を行ったLysM-GFPマウス。 赤は q ドットを表します。緑はLysM-GFPレシピエントの好中球。青は、コラーゲンが豊富な肺胞からの第2高調波発生を表しています。スケールバーは20μmを表しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

2光子励起は、1931年にマリア・ゲッペルト・マイヤー(Maria Göppert-Mayer)が博士論文で初めて発表したもので、彼女は核殻の構造を記述して後にノーベル物理学賞を受賞した22,23。従来の蛍光顕微鏡は、発光波長よりも短くエネルギーの高い励起波長を持つ単一光子励起に依存しています。単一光子顕微鏡法とは対照的に、二光子顕微鏡法は、放出された蛍光シグナル24,25,26よりも長い波長を持つ2つの光子による同時励起を含む。2つの個々の光子は、組織内の単一の焦点を励起するために共局在化する必要があるため、2光子励起は空間的に小さなサンプル体積に対して行われ、光学セクショニング24、25、26を可能にし、焦点27を含む平面の上下の光退色が少なくなる。2つの光子による同時励起の確率は非常に低いので、蛍光発光信号25,26,27に必要な励起強度を達成するためには、フェムト秒パルスレーザーが必要である。励起レーザーは近赤外範囲(700〜1100nm)にあり、その利点は散乱が少ないことであり、これにより光が組織28により深く浸透することを可能にする。イメージングの深さは、レーザー24の振動速度および出力に依存する。肺内では、500~600μmのイメージング深度を達成できます17。したがって、イメージング深度と低光退色の組み合わせにより、2光子顕微鏡は臓器の生体内イメージングに非常に適しています。

二光子顕微鏡法は、皮膚12,13、リンパ節29、静脈内皮30、脳皮質10,11、腎臓14,15、肝臓31,32など、複数の異なる組織や解剖学的部位で使用されています。例えば、マウスの真皮では、無菌の身体的損傷12後の好中球の群れを説明するために、生体内2光子イメージングが用いられてきた。静脈血栓症のモデルでは、血液単球と好中球が下大静脈30の内皮に沿って這っているのが視覚化されました。ヒトミクログリアは、ヒト脳オルガノイドモデル33に異種移植された後、in vivoでイメージングに成功しました。2光子顕微鏡の継続的な進歩により、より深いところで、さらには非静的な臓器でも生体内イメージングが可能になりました。例えば、Ti:Al2O3再生増幅器34を用いてマウスの新皮質において、最大1000μmの深さが画像化されている。

胸部臓器の生体内イメージングの課題の1つは、画像安定化です。心臓の鼓動や肺呼吸による動きにより、モーションアーチファクトは画質を大幅に低下させる可能性があります。心臓および肺のイメージングのための安定化のいくつかの方法が開発されており、これには臓器4,7の接着、吸引安定化19,35,36,37、および後方運動矯正38が含まれる。肺をイメージングする私たちの技術は、肺の表面を安定化されたカバーガラスに接着することに依存しています。私たちは、肺を灌流し、換気し、生体内で見られる条件をシミュレートする常温性を維持します。Looneyら19によって記述された吸引安定化方法と比較して、このプロトコルにはいくつかの利点があります。まず、専用の吸引装置を作成する必要はありません。その代わり、当社のイメージングチャンバーとトッププレートは、顕微鏡ラボですぐに入手できる材料で構築することができます。さらに、吸引装置(内径4mm)と比較して、この研究で使用された接着技術により、より大きな画像表面積(最大10mm)が可能になります。円周方向の接着により、接着剤の円内の肺の領域が適切に拘束され、換気運動が最小限に抑えられます。吸引技術と比較して、カバーガラスアプローチは、胸膜下毛細血管血流に影響を与える可能性のある肺表面の凸変形を防ぎます。当社のシステムの欠点には、胸膜実質接合部を損なうことなくカバーガラスを取り外すことができないことが含まれます。したがって、ここで使用されている接着剤技術では肺を2回目に画像化することはできませんが、吸引技術では連続イメージングが可能です。さらに、開胸術の使用は、正常な陰性胸腔内圧の損失を必要としますが、これは陽圧換気と組み合わされて、生理学的ではありません。2光子イメージングのその他の制限、制限については、以下で説明します。

生体内イメージング中は胸部が開いていますが、できるだけ生理学的環境に近づけることが重要です。マウスが横たわるベースプレートは、35〜37°Cの温度に維持されます。ベースプレートのみを加熱すると、マウスのコア温度(直腸プローブを介して測定)が数時間にわたって十分に調節されていることがわかりました。私たちの経験では、細胞の運動性と挙動が目に見える影響を受けるのは、温度が32°Cを下回ったときだけで、この設定では起こりそうにありません。このイメージングチャンバーの初期設定中に組織の正常体温または肺灌流の維持が困難になった場合は、ベースプレートに加えてトッププレートを温めるために2つの追加の抵抗器を取り付けることができます(補足図1)。イメージングチャンバーが最適化されると、各イメージング実験中にマウスの内部温度を定期的に監視する必要がなくなります。また、開胸腔に生理食塩水を含ませたガーゼと、撮像する肺の周囲の糊の閉塞リングとの組み合わせが、撮像時の体液損失を最小限にすることに有効であることを発見しました。

重要な技術的考慮事項は、胸部イメージングウィンドウを作成する際に、肋骨切除中に良好な止血を達成することです。左の3番目 から5番目の 肋骨の一部を切除し、これらの切断された肋骨からの継続的な出血は、イメージング中のマウスの生存を損ないます。これに対処するには、まず肋骨を切除する場所に近位にクランプして、微小血管系を血栓にすることをお勧めします( 図1C、Dを参照)。次に、肋骨の切除に続いて、肋骨の切断端を電気焼灼で自由に凝固させる必要があります。最後に、イメージング中に生理食塩水に浸したガーゼのストリップの上に左肺を置くことが重要です( 図1Fを参照)鋭い肋骨のエッジが肺に穴を開けるのを防ぎます。このような技術的な考慮事項を組み合わせることで、肺の損傷や正常な灌流パターンの損失なしに、数時間にわたって最小限の運動アーチファクトで肺実質内の免疫細胞の輸送の鮮明なビデオをキャプチャできます。

二光子顕微鏡は、感染症や無菌性炎症のモデルを研究するために肺で使用されてきました。1つのグループは、2光子イメージングを使用して、インフルエンザウイルス39によるマウス肺の反復チャレンジ後の常在記憶B細胞の運動性と遊走を研究しました。さらに、二光子顕微鏡法は、皮膚、腎臓、および膵島移植40,41,42,43において使用されてきた。移植モデルでは、ドナーとレシピエントを遺伝的に改変して、それぞれの細胞集団を研究することができます。私たちの知る限り、私たちのグループは、マウスの肺移植において生体内2光子イメージングを最初に行ったグループです4。移植による虚血再灌流障害後の好中球の急速な動員とクラスタリングが観察されましたが、これは血中単球の薬理学的枯渇によって減少しました4。その後の研究で、レシピエント脾臓由来単球がIL-1B44の産生を通じて好中球の血管外漏出を促進することを示しました。これらの研究における生体内イメージングにより、移植後の炎症反応を減少させる可能性のある治療標的として、好中球血管外漏出の上流の調節因子を明らかにすることができた45。さらに、ヘテロトピア移植後のマウス心臓の鼓動における生体内イメージングも行っています16。心筋への好中球動員を可視化し、心臓移植後の心臓移植細胞のフェロトーシス細胞死が炎症を開始することを見出した46。移植された大動脈弓に同様の安定化技術を適用して、アテローム性動脈硬化症プラークへの単球輸送を視覚化しました47。これらの研究は、非静的移植胸部臓器の生体内イメージングの実現可能性と有用性を実証しました。

最後に、さまざまな細胞タイプと肺実質を視覚化する方法について説明する価値があります。細胞の標識には、1)蛍光タンパク質のノックイン変異を持つトランスジェニックマウス株と、2)染色細胞に対する蛍光標識抗体の2つの主要な方法が使用されます。二光子顕微鏡法により免疫細胞を同定するために一般的に使用されるトランスジェニックマウス系統には、好中球48に対するLysM-GFP、種々の間質性マクロファージ集団49,50に対するCX3Cr1-GFP、古典的単球51に対するCCR2-GFP、B細胞52に対するCD19-tdTomato、および制御性T細胞5に対するFoxp3-GFPが含まれる.特に、CX3Cr1だけでは細胞を明確に同定するには不十分ですが、これは間質性マクロファージのそれと一致する細胞の形態と位置によって助けることができます。肺胞マクロファージは、その自家蛍光53,54、独特の形態、および挙動(すなわち、タイムラプス記録の時間分解能における運動性の欠如)により、標識なしで画像化することができる。同じく自家蛍光性である好酸球と比較して、肺胞マクロファージは890 nmの励起54で大きく、かなり明るいです。あるいは、肺胞マクロファージは、色素凝集体の肺内投与を通じて、それらの食作用機能に基づいて標識することもできる54。

移植レシピエントにおける免疫細胞の可視化は、蛍光標識細胞の血管内養子移植または細胞特異的表面マーカー18,55に対する蛍光標識抗体の注入によっても達成することができる。二光子顕微鏡法のもう一つの固有の利点は、コラーゲン56のような組織内の特定の複屈折構造によるSHGです。この現象は、肺胞嚢のコラーゲン含有量が高いため、肺胞構造の固有の指標として機能し、追加の蛍光色素がないため、肺のイメージングに特に有用です。さらに、肺胞は、655 nmのqドットで標識された肺胞毛細血管によっても外接しています。最後に、血管は、q-dots(このプロトコルに記載されているように)またはローダミンBデキストランの静脈内注射で標識することができます。インバイタル2光子顕微鏡実験を設計する際には、ブリードスルーやチャンネル間の微分不良のリスクを最小限に抑えるために、4種類以下の異なる発光チャンネルを使用することをお勧めします。

ここで説明した接着剤安定化技術の主な制限の1つは、組織損傷の可能性や肺表面に接着剤が残ることなく、肺からカバーガラスを取り外すことができないことです。したがって、肺は、数日間にわたる複数の時点ではなく、一度だけ画像化できます。この制限に対処するために、1つのグループは、肺57の連続イメージングを可能にする半永久的な胸部イメージングウィンドウを記載している。しかし、私たちの経験では、このアプローチでは、長時間のイメージングに対して十分な肺の安定化ができません。この技術により、肺を数時間にわたって画像化することが可能となり、移植後の自然免疫応答と適応免疫応答に関する重要な洞察が得られます。

2光子イメージングのその他の制限には、セットアップの高額な初期費用と、システムの保守に必要な専門知識が含まれます。スキャンフィールドは、免疫蛍光イメージングに比べて比較的小さいです。熱損傷と光損傷は、取得パラメータを慎重に最適化しないと重大なものになる可能性があります。2光子励起点像分布関数は広く、特にz次元では分解能がやや制限されます。さらに、2光子イメージングでは、目的の細胞を蛍光標識する必要があり、一部の細胞は単一の細胞マーカーで明確に標識できません。同時にイメージングできる信号の数は、多くの場合、4つ以下に制限されています。最後に、麻酔、手術、および画像検査は、肺移植に加えて追加の炎症と生理学的変化を誘発する可能性があり、生理学的環境を維持するための最善の努力にもかかわらず、実験結果と解釈を混乱させる可能性があります。将来の方向性には、低侵襲の生体内イメージング法の開発が含まれます (より小さな開胸術や気管支鏡アプローチなど)。

結論として、生体内2光子顕微鏡は、複数の疾患プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。ここでは、マウス肺移植後の細胞輸送と異なる細胞集団間の動的相互作用の生体内観察を可能にする、肺固定化と2光子イメージングの信頼性の高い技術について説明します。この技術は、移植後の免疫状況についての理解を広げ、肺移植やその他の肺疾患プロセスの研究に不可欠なツールであり続けるでしょう。

開示事項

著者らは、関連する開示を報告していない。

謝辞

この研究は、NIH 1P01AI11650およびFoundation for Barnes-Jewish Hospitalからの助成金によってサポートされています。ワシントン大学医学部のIn vivo Imaging Coreに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
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0.75% ポビドンヨードアプリケアNDC 52380-0126-2消毒剤用
1インチ 20G IV カテーテルテルモSROX2025CA気管内チューブ (ETT)
用 1インチ シルクテープデュラポア3M ID 7100057168マウスを所定の位置に固定するには
20x 水浸長対物レンズオリンパスN20X-PFH
3M ベトボンド接着剤Medi-Vet.com10872カバーガラスを肺に接着するには
655 nm 非標的量子ドットサーモフィッシャーQ21021MP血管の標識用
70% エタノールシグマ アルドリッチEX0281消毒剤用
アージェント 高温 ファインチップ 焼灼 ペンマッケッソン231
ブラック O リング (2 cm)金物店N/Aカスタムメイドのイメージング用チャンバー
ボルト (2)金物店N/A特注のイメージングチャンバー用
真鍮のつまみナット (2)金物店N/A特注のイメージングチャンバー用
ブプレノルフィン 1.3 mg/mLフィデリス アニマルヘルスNDC 86084-100-30疼痛管理用
カメレオンチタンサファイアフェムト秒パルスレーザーコヒーレントN/A
カバーガラス (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63カスタムメイドイメージングチャンバー用
湾曲蚊クランプ (1)Fine Science Tools13009-12
デュアルチャンネルヒーターコントローラーWarner InstrumentsTC-344B
ファインハサミ (1)Fine Science Tools15040-11
固定ステージ直立顕微鏡OlympusBX51WI
ガーゼ(1cm×3cmにカット)マッケソン476709左肺の下に配置
高真空グリースダウ・コーニングN/Aカバーガラスをトッププレートに接着するには
イソフルラン 1%シグマ アルドリッチ26675-46-7麻酔用
ケタミン塩酸塩 100mg/mLヴェドコNDC 50989-996-06麻酔用
金属板(3cm×7cm)金物店N/A特注のイメージングチャンバー用
先のとがった綿の先端のアプリケーターソロン56225肺を操作し、鈍い解剖を行うには
パワープロウルトラクリッパーオスター078400-020-001
Puralube 獣医眼軟膏Medi-Vet.com11897眼の乾燥を防ぐために
小動物用人工呼吸器ハーバード装置55-0000
ストレート鉗子 (1)ファインサイエンスツール91113-10
3チャンネルシャッタードライバーUniblitzVMM-D3レゾナントスキャナー
x.y.z 光学ステッピングモーターPrior ScientificOptiScan II
キシラジン 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20疼痛管理用

参考文献

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