方法論記事

横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価

1.1K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/66568

⸱

2024年4月19日

 ,  ,  ,  , 
1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究では、ラットのダイヤフラム運動ユニットの接続性を定量化するために、運動ユニットの数とサイズを推定するための in vivo 法を紹介します。これらの手法に対する段階的なアプローチについて説明します。

要約

人工呼吸器筋機能の喪失は、運動ニューロンの損傷と神経変性の結果です(例:.、頸髄損傷と筋萎縮性側索硬化症)。横隔膜運動ニューロンは、中枢神経系と筋肉との間の最終的なリンクであり、それぞれの運動単位(単一の運動ニューロンによって神経支配される筋線維のグループ)は、神経筋換気システムの最小の機能単位を表しています。複合筋活動電位 (CMAP)、単一運動単位電位 (SMUP)、および運動単位数推定 (MUNE) は、動物モデルの運動単位の完全性を経時的に評価できるようにする確立された電気生理学的アプローチですが、主に四肢の筋肉に適用されています。したがって、この研究の目的は、横隔膜 MUNE、運動単位サイズ (SMUP として表される)、および CMAP を定量化するために縦断的に使用できる前臨床げっ歯類研究のアプローチを説明し、運動ニューロン損失モデルでこれらのアプローチの有用性を実証することです。運動ニューロンの損傷や疾患におけるニューロンの損傷、変性、再生に関する高感度で客観的、かつ翻訳的に関連性のあるバイオマーカーは、実験的研究の発見から臨床試験までを大幅に支援し、加速させることができます。

概要

C3からC6筋節レベルまで伸びる横隔膜運動ニューロン(MN)は、中枢神経系(CNS)から横隔膜筋1への最終的なリンクを形成します。横隔膜運動単位 (MU) は、単一の脊髄 MN とその神経支配された横隔膜筋線維で構成され、呼吸器系の最小の機能単位を形成します。換気機能には、横隔膜MUプールの協調的な活性化によって達成される横隔膜筋の適切な収縮が必要です2,3。筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多くの神経疾患は、重度の換気障害を引き起こし、最終的には死因の一因となります4。

いくつかの電気生理学的アプローチを使用して、in vivoでの運動ユニット(MU)プールの完全性を評価および監視できます。複合筋活動電位(CMAP)は、末梢神経刺激後の特定の筋肉または筋肉群のすべての筋線維の合計脱分極を反映しており、ALS 5,6および脊髄性筋萎縮症(SMA)7,8,9を含むさまざまな神経筋状態に敏感です。CMAP評価の限界は、付随的なスプラウティングが、MU損失10の存在下でもCMAPの振幅と面積の維持につながる可能性があることである。この制限を克服するために、運動ユニット番号とサイズ11 の両方を評価するために CMAP 手法に変更が加えられました。さらに、電気生理学的システムによるダイヤフラムCMAPの機能評価を調査したin vivo研究は、記載されたダイアフラムCMAP記録技術を運動単位数推定12に利用することも可能である可能性があることを示唆した。

漸進運動単位数推定(MUNE)技術は、1970年代初頭にMcComasらによって、ヒトの指伸筋に対して最初に導入されました13。インクリメンタルMUNEアプローチは、従来のCMAP記録技術の修正であり、その間に徐々に増加する刺激が送達され、単一の運動単位応答の指標として定量的な、オールオアゼロのサブマックスインクリメントが記録されました。合計された増分と平均化された増分は、単一モーター単位電位 (SMUP) のサイズの推定値を計算するために使用されました。次に、この計算されたサイズをCMAP振幅に分割して、検査対象の筋肉を神経支配するMUの数を推定しました11。MUNEは、運動単位損失の検出と監視において高い感度を示し、CMAP振幅や面積14,15などの測定値で観察可能な変化の前に運動単位機能障害を特定することができます。ALS患者では、MUNEは非常に感度が高いことが証明されており、疾患の発症、進行、および予後の著名なバイオマーカーとして機能しています16,17。

MUNEの多数の適応が開発され、神経変性、神経損傷、および自然な老化プロセス18,19,20,21などの条件でMU機能を評価するために広く使用されています。最初の説明以来、電気生理学的応答とインクリメンタルフォース(機械的)測定の両方を利用したさまざまな適応が、人間の研究と動物モデルの両方で採用されてきました22。MUNEは、運動ニューロンと筋肉との接続性を非侵襲的に機能評価します。MUNEを縦断的に適用することで、疾患や誘発された表現型の進行を理解し、臨床および前臨床の場での治療介入の保護効果または再生効果を評価することができます。MUNE測定の再現性の有効性と、人体の大部分にわたるMUプールの技術の臨床的関連性に関係なく、努力は主にげっ歯類の筋肉の四肢筋に焦点を当ててきました10,23,24,25。

したがって、この研究の目的は、化合物筋活動電位 (CMAP)、SMUP、および横隔膜運動単位数 (MUNE) を in vivo 評価として取得するためのアプローチを説明することでした。これは、前臨床げっ歯類研究で縦断的に使用して、MUNE、運動単位サイズ (SMUP として表される)、および CMAP を定量化できます。さらに、横隔膜 MN 変性剤であるサポリンに結合したコレラ毒素 B フラグメント (CTB-SAP) の胸腔内投与後の横隔膜 MU 数の喪失を強調する代表的なデータを示します。

プロトコル

すべての手順は、ミズーリ大学の動物管理および使用委員会によって確立されたガイドラインに従って承認および実施されました。実験は、11〜15週齢の成体の雄Sprague-Dawleyラットで行われました。これらのラットはペアで飼育され、12:12の明暗サイクル下に置かれ、標準的な市販のペレット食品とHCl処理水が常に利用可能でした。

1.動物の準備と麻酔の分娩

  1. ネズミを取り扱うときは、適切な個人用保護具を着用してください。
  2. 吸入麻酔薬に3〜5%イソフルランを投与し、適切な導入を確保します。ラットが適切に麻酔されたら、仰臥位に置き、1〜3%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。.鉗子を使用して後肢の足パッドに優しく圧力をかけ、離脱反応がないことを確認して、麻酔の深さの十分性を確認します。
    注:ラットのサイズと体重に基づいて、麻酔の深さを監視し、それに応じてイソフルラン濃度を調整します。
  3. サーモスタット加温プレートを使用して温度を37°Cに維持し、CMAPの振幅と遅延に影響を与える可能性のある温度の変動を防ぎます。
  4. 乾燥を防ぐために、獣医用石油ベースの軟膏を目に塗ります。呼吸数を観察し、鉗子でフットパッドに圧力をかけたときの離脱反応を確認することにより、麻酔の深さを監視します。
  5. バリカンを使用して研究する胸と首の下3分の1から毛を取り除きます。実験全体を通してラットの呼吸を監視します。
    注:CMAPとMUNEの記録と麻酔の中止に続いて、ラットが十分な意識を取り戻すまで放置しないでください。.完全に回復するまで、動物をホームケージに戻さないでください。

2. 電極の配置とセットアップ

  1. 図1に示すように、28Gモノポーラ針電極のペアを配置して、CMAP、SMUP、およびMUNEを記録します。
    1. アクティブ (E1) 針電極を鎖骨中央線上 (最後の肋骨境界より下) に皮下に配置し、参照 (E2) 針電極をキシフス プロセスと最後の胸骨軟骨との間の角度に皮下に配置します。
      注:針電極は横隔膜の筋肉に挿入しないでください。代わりに、それらは皮下領域に配置する必要があります。
  2. 頸動脈シートでの横隔神経の刺激には、神経刺激の陰極および陽極として一対の 28 G 単極針電極を使用し、前斜筋と中斜筋の間の外側頸部に皮下に配置され、約 1 cm 離れて配置されます。刺激針の配置が4番目の頸椎(C4)の下のレベルにあることを確認してください。
    注意: 横隔神経やその他の構造の損傷を避けるために、刺激電極を深く挿入しすぎないでください。 図1 は電極の配置を示しています。
  3. 接地電極は、テールに使い捨ての表面電極を配置します。

3. データ取得

  1. フレニックCMAP
    1. 横隔神経を刺激するために、持続時間が0.1ミリ秒、強度が60〜100mAの範囲の単相陰極方形波パルスを適用することにより、横隔膜CMAP応答を記録します。
    2. 刺激強度を徐々に増加させながら、応答の振幅がそれ以上の増加を示さなくなるまで、CMAP応答を取得します。超最大刺激を確保するには、刺激強度を最大限引き出すために使用したレベルの約120%まで上げ、追加の応答を記録します。CMAP サイズが増えなくなった場合は、この応答を最大 CMAP と見なします。
      注:呼気中に刺激を与えることは、CMAP記録中の同時筋活動ノイズを最小限に抑えるために望ましいです。
    3. CMAPのピークツーピーク振幅をミリボルト(mV)単位で測定し、文書化します(図2)。
      注:CMAP振幅は、塩基間およびピーク間およびピークtoピークで評価できます。臨床電気診断システムは、多くの場合、等電基基から最初の負のピークまで計算される塩基間評価がデフォルトになります。
  2. 平均シングルモーターユニット電位(SMUP)サイズとMUNE計算
    1. インクリメンタル刺激技術を使用して平均SMUPサイズを計算します。
      1. 漸進的な応答を引き出すには、1 Hzの周波数で0.1 msの持続時間で最大以下の刺激を投与し、最小限のオールオアナッシング応答が達成されるまで0.03 mA刻みで強度を徐々に増加させます。2mA〜10mAの範囲の刺激強度で初期応答を取得します。
      2. 刺激強度が2mAから10mAの間で初期応答が起こらない場合は、刺激カソードの位置を変更し、首の横隔神経から近づけるか遠ざけるかして、必要な刺激強度をそれぞれ減らしたり増やしたりします。
      3. 最初の増分応答が 2 mA から 10 mA の範囲の刺激強度で達成された場合は、最初の応答を保存し、0.03 mA の増分で調整して、段階的に高い刺激強度で追加の増分を取得し、ステップ 3.2.2 の次の基準を満たす合計 9 つの追加増分を達成します。
        注: 各 SMUP は、前の増分から各増分を差し引くことによって定量化されます。
    2. 増分応答を測定する際には、各増分が次の基準を満たしていることを確認してください。
      1. 増分応答の最初の負のピークが、最大CMAP応答の負のピークと時間的に整列していることを確認します。
        注:呼吸周期からのバックグラウンドノイズによって観察されるわずかな動きは、実験の性質に固有のものです。しかし、ライブ観測中にSMUPが一貫して存在することで、その特定のCMAPに対するSMUPのアイデンティティが確認されます。
      2. 横隔膜は呼吸に関与する動的な筋肉であるため、各呼吸サイクルがベースライン運動を誘発する可能性があります。したがって、3つの重複する応答間で一貫性を確認することにより、各増分応答の安定性と分画の欠如を確認します。
        注:低振幅の誘発電位、特に最初のSMUPを呼吸活動によるバックグラウンドノイズと区別するには、警戒を怠らず、3〜4回の呼吸サイクルを観察することが重要です。また、精度のために、ピークがCMAPのピークと整列していることを確認してください。
      3. 各増分が明確で、前の増分よりも大きいことを確認します。したがって、増分応答をリアルタイムで視覚的に区別し、以前に記録された増分に重なる応答を観察します。
        注:各振幅での刺激の複数回の反復は、増分の一貫性と事前定義された基準への準拠を確保するために実施される場合があります。
      4. 前述の基準で各インクリメントを目視で確認した後、インクリメント振幅が少なくとも25μVであることを確認してください。増分が25 μV未満の場合は、測定値を破棄し、応答を再評価します。
      5. 10 個のインクリメンタル応答を記録した後、各インクリメント応答の振幅が 10 個すべてのインクリメントの合計振幅の 3 分の 1 を超えないことを確認します。これは、最終応答の合計振幅を表します。この基準が満たされない場合は、10の増分応答の測定を繰り返します。
        注:3分の1のしきい値は、各増分応答が単一のモーターユニットの活性化を表すという仮定に基づいています。任意の増分応答の振幅が、10個の増分すべての合計振幅の3分の1を超える場合、その応答が単一の運動ユニットの活性化のみに起因するものではない可能性があることを示唆しています。それどころか、それは、追加の運動ユニットの動員や、電気ノイズや人工物22,26のような非特異的な活動の存在によって影響を受ける可能性がある。
      6. SMUP の平均振幅を推定するには、10 個の増分の値を平均化します。平均SMUP振幅を測定する別の方法は、最終インクリメンタル応答の全振幅をインクリメント11の総数で割ることである。
    3. 最大 CMAP 振幅 (ピークツーピーク) を平均 SMUP 振幅 (ピークツーピーク) で割って MUNE を求めます。特定の電気生理学的システムでは、SMUPはマイクロボルト(μV)で記録されますが、CMAPは通常ミリボルト(mV)で表されます。必要に応じて、MONE を計算する前に、CMAP と SMUP の測定値を同じ単位に変換します。
      注:ピークツーピークCMAP、平均SMUP、およびMUNEは、通常、クリニックの筋電図システムによって自動的に計算されます。
      figure-protocol-1
      CMAP = 複合筋活動電位
      SMUP = 単一モーターユニット電位
      MUNE = Motor Unit Number Estimation

結果

このレポートで概説されているCMAP、SMUP、およびMUNE技術は、低侵襲電極配置を使用して横隔膜筋の神経筋機能の記録を可能にします(図1)。振幅と面積のパラメータを使用して、最大CMAPサイズを特徴付け、筋肉群の出力の全体的な尺度を提供できます(図2)。しかし、現在の方法では、CMAPとSMUPの両方のサイズを定量化するために振幅に依存しています。CMAP、SMUP、およびMUNEは、神経筋疾患のさまざまなラットモデルで神経筋機能を測定するために利用できます。MN変性の文脈でMU損失を実証するために、ラットは横隔膜性MNおよび追加のCTB(25μg)を標的とするためにCTB-SAP(25μg)を両側胸腔内注射を受け、対照ラットは非抱合型CTB(25μg)およびSAP(25μg)を投与された1,27。

図3では、CTB-SAP胸腔内注射の7日後の成体対照ラットと成体ラット(12週間)の所見を比較しています。CTB-SAP の胸腔内注射後、MUNE は、対照ラットの 74 の機能的な運動単位の正常な所見と比較して、60 の推定機能運動単位で減少します。しかし、CTB-SAPラットのCMAP振幅(14.25 mV peak-to-p)は、対照(14.5 mVピークtoピーク)と比較して最小限の変化を示しました。これは、おそらく付随的な発芽によるものでした。図 4 では、ダイアフラム CMAP、SMUP、および MUNE を両側から取得し、ベースライン/注入前 (n = 14)、注射後 7 日(n = 14)、14 日(n = 14)、21 日(n = 6)、および 28 日(n = 14)で平均化しました。図 4 では、グループ間のベースラインの差は見つかりませんでした。MUNEは、CTB-SAPラットにおいて、時間(p < 0.05)、CTB-SAP(p < 0.001)、および相互作用時間 x CTB-SAP(p < 0.01)に有意な変化を示し、MNEは~40%減少しました。CTB-SAPラットの平均SMUPは、時間(p < 0.05)およびCTB-SAP(p < 0.01)とともに有意な変化を示しましたが、SMUP振幅の50~60%の増加による有意な相互作用はありませんでした。CMAPには大きな変化は見られませんでした。

figure-results-1
図1:電極の配置。 (A)刺激陰極と(B)陽極は、約1cm離れた前斜角筋と中斜筋の間の外側頸部に皮下挿入されます。(C)「アクティブ」電極(E1)および(D)「参照」記録電極(E2)は、剣状突起と最後の肋骨軟骨との間の角度に従って、最後の肋骨境界より下の鎖骨中線上に配置されます。さらに、(E)は、アーティファクトを最小限に抑えるために、地面として尾部に使い捨てのディスク電極が配置されています。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:複合筋活動電位。 左半横隔膜の筋肉から記録された代表的なCMAP応答の図。CMAPのピークtoピーク振幅は、負のピーク電圧から正のピーク電圧まで決定されます。略語:CMAP = Compound muscle Action Potential。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:CTB-SAP胸腔内注射の7日後の対照ラットと成体ラットからの2つの代表的なCMAPおよびMUNE記録(A)ピークツーピーク振幅14.5mVの対照成体ラット(12週齢)の左横隔化合物筋活動電位(CMAP)。画面感度 = 1 mV/分割、画面再生時間は 1 ミリ秒/分割。(B)合計振幅が1.940mVの後続の10個のインクリメンタル応答を10で割って、平均SMUPサイズ(0.194mV)を決定します。画面感度 = 0.2 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。MUNE = 74 (MUNE=CMAP/平均 SMUP (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) CTB-SAP 注入の 7 日後の横隔 CMAP は、CMAP のピーク ツー ピーク振幅 14.25 mV にほとんど変化が見られませんでした。画面感度 = 1 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。(D)合計ピークtoピーク振幅が2.360mVの10回以降のインクリメンタルレスポンスを10で割ると、平均SMUPサイズは0.236mVになります。画面感度 = 0.2 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。したがって、計算されたMUNEは60でした。略語:CMAP =複合筋活動電位;MUNE = 運動単位番号の推定;CTB-SAP = サポリンに結合したコレラ毒素Bフラグメント;SMUP = 単一モーター単位電位。*電気刺激によって引き起こされるアーティファクトを示しています。電気刺激とCMAPの振幅のコントラスト、および増分応答のために、刺激の一部のみをグラフ化したことに注意することが重要です。ブラインドカラーのフレンドリーな色を使用して、アクセシビリティを向上させるための増分応答の視覚化を強化しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:CTB-SAP後のCMAP、SMUP、およびMUNEの電気生理学的評価。 群間のベースライン差は認められなかった(CTB-SAP群と対照群の両方で11週齢の雄ラット7匹)。(A)CMAPには大きな変化は見られませんでした。(B)CTB-SAPラットの平均SMUPは、経時的(p < 0.05)およびCTB-SAPあり(p < 0.01)で有意な変化を示し、有意な相互作用はなく、SMUP振幅が50-60%増加したことを示している。(C) CTB-SAP 注射の 7 日後、平均 MUNE は 102.58 ± 20.54 から 72.43 ± 15.59 に 27.07% 大幅に減少しました (平均 ± SD)。この減少は持続し、28日後にさらに11.75%の減少となりました(MUNE:60.64 ± 11.33、p < 0.01)。ベースライン、注射の7日後、14日後、および28日後のすべての測定値は、14匹のラットから得られ、n = 7匹のラットに抱合型CTB-SAPを注射し、n = 7匹のラットに非抱合型CTBとSAPを対照群として投与しました。21日目に6匹のラットを使用しました。CMAP、SMUP、および MUNE のデータは平均として示され、比較は二元配置分散分析を使用して実行されました。アスタリスクは、*p < 0.05、**p < 0.01) での違いを示します。略語:CMAP =複合筋活動電位;MUNE = 運動単位番号の推定;CTB-SAP = サポリンに結合したコレラ毒素Bフラグメント;SMUP = 単一モーター単位電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ALSなどのMN変性疾患では、換気に関与するMUを評価することが重要である28。ALS患者における呼吸器性MN変性の発生にもかかわらず、MN死の特異的な発症と進行は未だに完全には理解されていない29,30,31。この側面の重要性を認識して、遺伝的ベース(SOD1 2,32など)および非遺伝的ベース(CTB-SAP胸膜内注射3,27,33など)の両方のさまざまなモデルが、神経変性疾患の動物モデルにおける呼吸障害をエミュレートするために採用されてきました。したがって、潜在的な治療効果を診断、モニタリング、評価するためのバイオマーカーを特定することは、これらのモデルにとって有利です。さらに、バイオマーカーは、前臨床研究結果の臨床翻訳を容易にすることができます。

げっ歯類の変性モデルにおける神経支配MNの数を定量化するために、逆行性トレーサーやアデノウイルスなどのさまざまな標識技術が採用されています25,34,35,36。以前は、免疫組織化学は、頸髄の前角の横隔運動ニューロンを標識するために利用されてきました2,3,33。標識技術は、MN評価には価値があるが、MUの機能評価には限界があり、縦断的評価には適していない37。客観的な電気生理学的評価は、特にヒトとげっ歯類の間の運動系の機能的および解剖学的特徴における顕著な構造的違いを考慮すると、種間翻訳を成功させるために重要である38,39。神経生物学的な違いを組み込むことは、げっ歯類モデルから得られた知見を患者に翻訳する上での課題となります。MUNEは、MN機能の客観的な電気生理学的測定として機能することにより、これらの障害を克服し、MN変性モデル実験3,40のバイオマーカーとしての機能的MU接続性の評価を可能にします。

CMAP、SMUP、およびMUNEは、調査研究や神経筋障害の患者の評価に一般的に使用されています9,10,11。これらの潜在的なバイオマーカーは低侵襲であり、同じ個人内の機能を経時的に縦断的に評価することができます。重要なことに、皮質MNによるMUの活性化または動員を直接測定するわけではありませんが、MNの完全性とその機能的対応物であるMUの臨床的に関連性のある推定を提供します。MN変性疾患のげっ歯類モデルは、ヒト疾患の根底にある生理病理学的メカニズムを理解し、効果的な治療法の前臨床の進歩に不可欠です。種を超えて翻訳可能なアウトカム指標とバイオマーカーを開発することで、有望な前臨床所見を臨床試験に合理的かつ迅速に変換することができます11。測定の相対的な複雑さを考慮して、これらの手法をラットの手足から横隔膜の筋肉に適応させ、洗練させました。この翻訳は、ラット研究におけるより広範な利用と実施を促進するために、視覚的な形式で提示されています。

私たちの経験から、臨床電気診断システムは、この文脈で概説された研究に適しています。この適合性は、検査官と電気診断システムとの間のインターフェースの人間工学の向上に由来し、便利な制御を容易にします。私たちの研究室グループでは、2つの非スイッチ増幅器チャンネルを備えた2チャンネルシステムを利用しています。これらのチャンネルには24ビットのA/Dコンバータが装備されており、チャンネルあたり48kHzのサンプリングレートで動作します。ハードウェア・ゲインは、10nVから100mV/divの範囲で調整可能です。0.2Hzから5kHzまでの低周波フィルタを採用し、30Hzから10kHzまでの高周波数フィルタ設定をカバーしました。さらに、0〜100mAの範囲で調整可能な強度と0.02〜1msの持続時間を持つ定電流刺激装置を利用しました。臨床システムの大部分は、CMAP、SMUP、およびMUNE応答の記録に適した同等の機能を提供します。これらのシステムは、目的のデータを正確に記録するために、それに応じて調整できます。たとえば、CMAPの振幅は、ベースツーピークおよびピークツーピークで評価できます。臨床電気診断システムは、多くの場合、等電基基から最初の負のピークまで計算される塩基間評価がデフォルトになります。

ダイアフラムからCMAP、SMUP、およびMUNE応答を取得するプロセスには、いくつかの重要なステップが含まれます。一貫した正確な電極配置と適切な電極深さは、振幅を確実に測定し、記録中のバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために不可欠です。刺激電極の不適切な配置は、意図しない結果につながる可能性があります。刺激電極を後方に配置しすぎると、腕神経叢の興奮に対する前肢の筋肉の収縮が誇張される可能性がありますが、C4レベルよりも高い配置は横隔神経の刺激をより困難にする可能性があります。より深い位置に配置すると、頸動脈を損傷したり、迷走神経を呼び起こしたりして、心臓の伝導性の問題を引き起こす可能性があります。記録電極を最後の肋骨よりも高くまたは低く配置すると、肋間刺激または腹直筋刺激からそれぞれ測定が行われる場合があります。他の筋肉からの記録を避けるために、CMAPレイテンシの横隔膜の負のピークは通常1.5〜3.5ミリ秒であり、その特徴的な形状を 図2に示すことに注意してください。私たちの観察では、針電極は、横隔膜筋の円盤状電極と比較して、より一貫したCMAP、SMUP、およびMUNE記録をもたらすことが示されました。この強化された一貫性は、横隔膜筋のドーム形状と、肋間筋や腹直筋などの他の筋肉が近接して存在することに起因します。さらに、針電極の柔軟な配置も有利な要素です。電気刺激強度については、横隔神経を刺激するために60〜100mAの範囲を利用しましたが、これは他の運動系で報告されている範囲を超えています。この違いは、首の横隔神経のより深い位置と比較して、後肢と前肢の坐骨神経叢と腕神経叢のより表面的な位置と比較して生じます。

平均的なSMUPを取得することは、CMAPと比較してより大きな技術的課題を提起します。応答サイズがミリボルトではなくマイクロボルトの範囲に小さいため、バックグラウンドノイズの影響がより顕著になります。バックグラウンドノイズを軽減するには、接地電極、カソード、アノードを調整して電極の配置を最適化することを検討してください。さらに、実験セットアップで近くの電気機器からの干渉が最小限に抑えられていることを確認してください。ファラデーケージは、細胞内電気生理学アプリケーションで一般的に利用されていますが、このセットアップには必要ありません。個々のSMUPの応答を視覚的に識別することは、一貫性のある再現性のある結果を得るためには練習が必要な難しいスキルです。横隔膜は動的な筋肉であるため、ベースラインは換気サイクルごとにシフトする可能性があります。SMUPの増分に注意を払い、以前のSMUPとの整合性を確保することは、この課題を克服するための重要な要素です。さらに、SMUP が最大CMAP の遅延時間内に開始されるようにすることは、正確な録音のために重要です。

横隔膜記録の別の課題は、この筋肉の非対称性であり、左から右への厚さの変化を特徴とし、右側41の肝臓によって加えられる圧力によって影響を受ける。これに対処するために、左右の半隔膜で電気生理学的測定を別々に行いました。その後、CMAP、SMUP、およびMUNEの応答の平均を別々に計算しました。

CMAP応答は、特定の筋肉における筋線維の集団的脱分極を反映しているため、横隔膜MNが横隔膜筋線維に影響を与える病状は、CMAPサイズの縮小につながる可能性があります。したがって、両側半隔膜から平均CMAPを計算すると、呼吸器神経筋系の全体的な機能状態を優れた評価できます。側副発芽などの代償性変化は、MNまたは運動軸索損失11の存在下でもCMAPサイズの保存につながる可能性がある。個々の増分を記録することで、単一のMUの平均出力(SMUPサイズ)を推定することができ、呼吸器系のMUの機能状態についてより詳細な洞察を得ることができます。したがって、横隔膜MNまたは軸索の横隔膜への入力を評価するために、MUNE技術が不可欠になります。これらのバイオマーカーをMN疾患の治療の前臨床試験に適用することで、臨床試験への応用が向上する可能性を秘めています。

開示事項

WDAは、NMD Pharma、Avidity Biosciencesから研究資金を受けており、NMD Pharma、Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Novartis、Design Therapeutics、Catalyst Pharmaceuticals、Novartisからコンサルティング料を受けています。

謝辞

この研究は、ミズーリ州脊髄損傷/疾患研究プログラム(NLNおよびWDA)からの脊髄損傷/疾患研究プログラム助成金によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 mLガラスシリンジケントサイエンティフィックコーポレーションSOMNO-2ML
50 mL、モデル 705 RN シリンジハミルトン社7637-01胸膜内注射の実施に利用
5008 - フォーミュラブダイエットラボダイエット0001325
オートクレーブ可能な 26 G 針 (26S RN 9.52 mm 40°)ハミルトンカンパニー7804-04腔内注射を行うために利用
レラ毒素Bサブユニット(CTB)MilliporeSigmaC9903をラベル付けるための胸膜内注射に利用
ポリン(CTB-SAP)に結合した高度なターゲティングシステムIT-14ニューロン死を引き起こす胸腔内注射に利用
ケーブルTechnomed202845-0000レコーダー電極を電気診断機に接続する
リード線付き使い捨て 2" x 2" ディスク電極Cadwell302290-000接地電極
使い捨てモノポーラ針 28 GTechnomed202270-000カソードおよびアノード刺激電極-記録電極
EMG 針ケーブル (アンプ/スティム スイッチ ボックス)Cadwell190266-200モノポーラ電極を電気診断刺激装置に接続するには
鉄ベース付きヘルピングハンズワニ口クリップラジオシャック64-079記録電極の配置を維持する 
イソフルラン(250mLボトル)Piramal Healthcare
monoject湾曲先端灌漑シリンジCovidien81412012電極ゲルのアプリケーションに利用
PhysioSuite RightTemp Homeothermic WarmingKent Scientific CorporationPS-RT加温パッド、直腸プローブ、パッド温度プローブ
Proトリマーペットが含まれていますグルーミングキットオスター078577-010-003脱毛用バリカン
サポリン (SAP)アドバンスト ターゲティング システムPR-01胸膜内注射に利用 (単独で注射した場合の制御剤)
Sierra Summit EMG システムCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAポータブル電気診断システム
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia SystemKent ScientificCorporationSOMNOには、こぼれ防止、防湿ボトルトップアダプターが含まれています。Yアダプターチューブ;炭掃気
フィルターSprague-DawleyラットEnvigoコロニー208a、インディアナポリス、インディア
獣医石油ベースの眼科軟膏 Puralube26870、角膜の損傷を避けるために麻酔中に適用されます
胸コサポリン(CTB-SAP)に結合した生存運動ニューロンコレラ毒素Bサブユニットサ運動 取り外し可能な付き生理学的モニタリングシステム 赤外線ナ州は

参考文献

  1. Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  2. Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
  3. Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
  4. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  5. Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
  6. Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
  7. Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
  8. Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
  9. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
  10. Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699(2019).
  11. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899(2015).
  12. Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605(2015).
  13. Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
  14. Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
  15. Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
  16. Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
  17. Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
  18. Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
  19. Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
  20. Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
  21. Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
  22. Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
  23. Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437(2010).
  24. Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
  25. Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
  26. Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
  27. Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
  28. Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
  29. Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
  30. Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
  31. Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer's and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
  32. Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
  33. Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
  34. Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
  35. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058(2016).
  36. Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
  37. Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
  38. Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
  39. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134(2015).
  40. Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
  41. Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).

再版と許可

タグ

横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。