SPE-UPLC による 1 つのピーナッツ中のアフラトキシンおよびスチルベノイド植物アレキシンの非破壊定量(英語 )種子

サマリー

超高速液体クロマトグラフィーを使用して、単一のピーナッツ種子中のアフラトキシンおよびスチルベノイドフィトアレキシンを定量するためのミディアムスループット法を実証しています。この方法は、アフラトキシゲンのアスペルギルス種が挑戦した野生のアラキス種の分析のために特別に開発されました。

要約

アフラトキシンは、一部の真菌種、特に アスペルギルスフラバスの発がん性の高い二次代謝産物です。.アフラトキシンは、ピーナッツを含む経済的に重要な農産物を汚染することが多く、人間や動物の健康に高いリスクをもたらします。遺伝的基盤が狭いため、ピーナッツ栽培品種は真菌病原体に対する耐性が限られています。したがって、 アスペルギルス 属に耐性を持つ多数の野生のピーナッツ種は、耐病性の源として科学者によってかなりの検討を受けています。

アフラトキシンの蓄積が正規分布に従わないため、アフラトキシンに対する耐性について植物の生殖形質を調査することは困難であり、何千もの単一のピーナッツ種子の分析が必要です。十分に水和したピーナッツ(Arachis spp.)の種子は、 アスペルギルス 種に感染すると、防御的な植物性植物と考えられている生物学的に活性なスティルベン(スチルベノイド)を生成することができます。ピーナッツスティルベンは、真菌の発達とアフラトキシンの産生を阻害します。したがって、 アスペルギルスの 侵入に対する種子耐性/感受性の性質を説明するために、ピーナッツスチルベノイドの同じ種子を分析することが重要です。発表された方法のいずれも、アフラトキシンおよび/またはスチルベンフィトアレキシンの単一シード分析を提供していません。

私たちは、環境に優しく、安価な消耗品を使用し、感度と選択性に優れた方法の要求を満たすことを試みました。さらに、この方法は、種子の半分のみを使用し、胚軸を含む残りの半分をそのまま残すため、非破壊的です。このような技術により、アフラトキシンおよびスチルベノイド分析に使用されたのと同じ種子からピーナッツ植物の発芽および成長を完全に成熟させることができます。この方法の統合部分、アスペルギルス菌による種子の手動挑戦は、方法の他のステップと比較してより多くの時間と労力を必要とする制限ステップです。この方法は、アスペルギルス属に耐性のある種を特定し、この真菌性病原体に対する遺伝的耐性の新規源を特定し特徴付けるために、野生のアラキス生殖形質の探索に使用されてきました。

概要

ピーナッツ(Arachis hypogaea L.)は、世界の主要な食用作物の1つです。100カ国以上で栽培されており、総生産量は4,500万トン^{を超えています1}。ピーナッツ、トウモロコシ、綿実などの農産物は、アフラトキシンを産生する土壌由来の真菌である アスペルギルス属の種によってしばしば侵略されます²。これらの商品は、高温や干ばつなどの環境条件が特徴となる場合、収穫前のアフラトキシン汚染の影響を特に受けやすくなります。アフラトキシンは、知られている中で最も強力な発がん性物質の一つです³。それらは^世界の農 産物の4分の1を汚染し、4 世界人口の約半分をアフラトキシンに慢性的にさらしています⁵。その高い発がん性と毒性のために、食品中のアフラトキシンの存在は、世界のほとんどの国で実質的に許容される最低限度で規制されています⁶。

欧州連合(EU)は、ヒトが消費する製品中のアフラトキシンB₁の最大レベルを2 ng / g、総アフラトキシン(B₁、B₂、G₁、およびG₂)の最大レベルを4 ng / gを法制化しています⁷。このような低い制限は、アフラトキシンで汚染された商品を処理する農業や食品業界に大きな圧力をかけています。汚染されたピーナッツのアフラトキシンのモニタリングと再処理は、アフラトキシンが食物連鎖に侵入するのを防ぐための受動的でコストのかかる戦略と見なされるかもしれません。そのため、ピーナッツ業界のすべての主要なセグメントは、真菌性疾患に対する耐性が限られていることが多い現在のピーナッツ品種のアフラトキシン汚染により、莫大な利益損失を経験しています。アフラトキシン問題を解決するための前向きなアプローチは、遺伝子導入、つまり耐性野生ピーナッツ種からエリート品種への遺伝情報の転送を通じて、真菌抵抗性ピーナッツ品種を取得することです。近年^8,9、野生のピーナッツ種は、栽培されたピーナッツの狭い遺伝的基盤がもはやピーナッツ植物^10,11に必要なレベルの耐性形質を提供できないため、遺伝病抵抗性の源としてかなりの考慮を受けています。野生のピーナッツ種からの侵入を成功させるには、何千もの小さくて希少な単一の種子の分析が必要です(図1A)¹²。

図1:シングルシード分析フローチャート (A)異なる市場タイプのピーナッツ品種と野生の アラキス 属の比較サイズ (1)バージニア州;(2)ランナー;(3)スペイン語;(4)野生の アラキス 属 (B)野生の アラキス 属(プレートA、種子4)を3つのセクションにカット、(5)胚軸を持つ半分の種子。種子のこの部分は、植物を育てるために使用されます(E)。(C)パーツ(6)と(7)はドリルビットで穴を開け、(D)は真菌胞子を接種します。30°Cで72時間インキュベートした後、シード部分の1つ、(6)または(7)をアフラトキシンおよびフィトアレキシンの分析に使用し、もう1つをRNA/トランスクリプトームシーケンシングに使用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

真菌病原体に対するピーナッツ耐性は、フィトアレキシン13,14,15,16,17と強く関連しています。ピーナッツフィトアレキシンは、外因性刺激、特に真菌の侵入16,17,18への曝露後に生合成され、植物組織に蓄積される抗菌性スチルベノイドによって表される。真菌の侵入部位における十分な濃度の植物アレキシンの急速な蓄積は、真菌の増殖を阻害し、植物の防御にとって重要である19,20,21。病原体は、フィトアレキシンが阻害濃度^16,22まで蓄積すると増殖を停止します。ピーナッツ中の無酸素性真菌に対する防御化合物としてのスチルベノイドの役割は、30年以上前の野外実験¹³で評価されました。これらの実験は、ピーナッツスチルベノイドが収穫前のアフラトキシン汚染における重要な耐性因子であるという仮説を明確に支持していました。このような証拠は、スチルベンが野外で損傷したピーナッツで自然に生成されるという事実に基づいています。スティルベンは、アフラトキシゲン菌に対してかなりの生物学的活性を示します。また、種子中のアフラトキシン汚染は、干ばつによる種子の脱水によりピーナッツがフィトアレキシン合成能力を失った場合にのみ検出されました。別の一連の野外実験では、フィトアレキシンの生産とピーナッツ遺伝子型の農業上重要なピーナッツ病に対する耐性との関連が確認されました¹⁷。

真菌の侵入に対するピーナッツ耐性の天然のフィトアレキシンベースのメカニズムをよりよく理解することは、アフラトキシン汚染を制御するための有望な戦略です^15,17.したがって、アフラトキシン分析に加えて、フィトアレキシンについても同じシーンを定量的に分析することが重要です。この耐性のメカニズムは十分に研究され理解されていませんが、それでも、新しい真菌耐性品種²³のピーナッツ植物の育種と遺伝子組み換えにとって重要です。さまざまな商品におけるアフラトキシン測定のためのさまざまな分析手順が存在するにもかかわらず、特に従来の方法が分析および費用対効果の高い要件を満たさない場合、特定の研究のための単純な方法が依然として必要です。ピーナッツ産業、農業、および民間の研究所で使用されている最新のクリーンアップ方法のほとんどは、抗体ベースの²⁴およびイムノアッセイ25,26,27デバイスです。これらは選択的で感度が高いですが、一般的な吸着剤を充填したミニカラムよりも大幅に高価です。さらに、これらの方法はいずれも、ミリグラム重量の少ないサンプルの分析用には設計されていませんでした。マグネシウムシリカゲル(フロリシル)充填ミニカラム^の分析的使用に関する以前の研究に基づいて、この手順を進行中および将来の育種前および育種プログラムのニーズに合わせて変更しました。

この研究の目的は、単一のピーナッツ種子中のアフラトキシンとフィトアレキシンを定量的に測定するための、非破壊、中スループット、環境に優しい方法を開発することでした。このような方法が開発されている。公表されている方法に対する利点は、感度が高いこと、単一種子抽出物中のアフラトキシンとフィトアレキシンを分析できること、サンプルの秤量が不要であること、消耗品の量が少ないことによる低コスト化です。統合法のフローチャートを 図1に示します。このテキストでは、遺伝子解析やその他の手順が説明されており、提案された方法の重要性と、それが手順全体にどのように統合されているかを示すために図で示されています。

プロトコル

1.真菌チャレンジのための種子の準備

1. アフラトキシゲン Aspergillus flavus NRRL 3357を、試験管内のジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)の傾斜に30°Cで6日間インキュベートします。 試験管から10 mLの水とTween 20(蒸留滅菌水1 Lに100 μLのTween)を入れて真菌胞子を採取し、漏斗に入れたグラスウールでろ過し、ユーザーマニュアルを参照して血球計算盤で胞子をカウントします。
2. 胞子懸濁液を滅菌水で1,000胞子/μLの濃度に希釈します。血球計算盤で濃度を確認します。
   注:困難な実験の2時間前までに胞子懸濁液を準備します。
3. ピーナッツのさやをそっと割って、外皮を取り除きます。種子の量がビーカーの体積の1/5を超えないように種子を滅菌ビーカーに入れ、ビーカーの容量の約0.05%に過酸化水素溶液を70%加え、種子が水を3時間吸収するのを待ちます。
4. 種子から過酸化水素溶液をデカントし、ビーカーに約3倍の量の80%エタノール-水混合物(v / v)を加えて種子を覆います。1分間放置してから、等量の滅菌蒸留水で種子を2回すすぎます。
5. エタノール滅菌した種子と一緒にビーカーに5倍の容量の3%過酸化水素を加え、5分間放置してから、液体をデカントし、等量の滅菌水で種子を2回すすぎます(図2A)。

図2:アフラトキシンおよびフィトアレキシン画分の接種、インキュベーション、および抽出のためのピーナッツ種子の調製(A)3%過酸化水素による吸収種子の滅菌;(B)種子から精巣(皮膚)を除去するステップと、(c)胚軸部分を切り取り、(D、E)ドリルビットを備えた半分の子葉の穴あけキャビティ。(f)種子の穿孔部分を寒天上に置くこと。(g)穿孔された空洞に真菌胞子を塗布する。(H)インキュベーション後の種子を含むペトリ皿。(I)インキュベートした単一種子(対照試料の写真)を強化しビーズチューブに入れるステップと、(j)測定された量の抽出溶媒を添加し、(k)ビーズラプターでサンプルを粉砕し、(L)粉砕されたスラリーの遠心分離。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 滅菌ペーパータオルの上に種子を置き、鉗子で種子精巣を取り除き、メスで胚軸を含む種子の約1/3を切り取ります(図2B、C)。
7. 種子のこの部分を廃棄するか、成長培地を使用して試験管で植物を育てます(図1B、E)。
8. 種子の残りの部分を2つの子葉に分け、それらをペトリ皿に入れ、種子の部分を湿った滅菌濾紙で覆い、脱水を避けるために蓋を元に戻し、すぐに接種ステップに進みます。
9. 困難な実験を行う前に、100 x 15 mmのディッシュに1.5%滅菌寒天を26 mLの水に注ぎ、一晩固化させて、シードインキュベーション培地で十分な数のペトリ皿を準備します。
10. 残りの各子葉の外側の中央に、直径1.6〜2.34mmの滅菌鋭利なドリルビットで種子を手動で穴を開けて、1.5〜2mmの深さの空洞を作ります。空洞を作るのに ~2 秒から 5 秒かかります (図 2D、E)。
11. 4〜6個の「穴あけ」した種子片を寒天の入ったシャーレに入れ、10μLのピペッターで各半子葉片の穴あけキャビティに1,000胞子/μLの懸濁液2μLを塗布します。胞子懸濁液の代わりに、対照種子に滅菌水を適用します(図2F、G)。
12. すべてのシャーレに蓋をして、光なしで30°Cで72時間インキュベートします。

2. アフラトキシンおよびフィトアレキシン分析のためのインキュベート種子片のサンプリングと調製

1. 鉗子で寒天から種子片を取り出し、13個のジルコニウムセラミックビーズ(直径2.8 mmの12個と直径6.5 mmの1個)を入れたラベル付き7 mLビーズバイアルにそれぞれを入れて、72時間で種子片を収集します(図2H、I)。
   注:この時点で、すぐに処理しない場合は、バイアルを-80°Cの冷凍庫に入れ、最大2か月間保管してからさらに処理することができます。
2. フィトアレキシンとアフラトキシンは、同じ種子抽出物で測定されます。抽出には、視覚的なシードサイズ(小、中、大)に応じて、正確に測定した2 mLまたは4 mLのメタノール-水混合物(90:10、v / v)をビーズバイアルに加え、5.5 m / secで45秒間粉砕します。粉砕した種子を入れたバイアルを遠心分離機に入れ、1,860 × gで3分間遠心分離します(図2J-L)。
   注:次の重要な^17,22スチルベノイド誘導体が決定されます（すべてトランス配置で）レスベラトロール、アラチジン-1、アラチジン-2、アラキジン-3、3'-イソペンタジエニル-3,5,4'-トリヒドロキシスチルベン(IPD)、およびSB-1。
3. アフラトキシン分析では、困難な実験を実行する前に、次のように十分な数のクリーンアップカラムを準備します。90^°角にカットしたガラスロッドを使用して、対応するポリエチレン多孔質(20 μL)フリットを1.5 mLポリプロピレンカラムに入れます。カスタムメイドのスコップで50 mgのマグネシウムシリカゲル(100〜200メッシュ)をカラムに入れ、ガラス棒で押し下げて同じフリットでカラムをキャップします(図3A-E)。
   注:この量のマグネシウムシリカゲルは75μLの容量を占め、吸着剤層の高さは3mmです。

図3:クリーンアップカラムとフィルターの準備(A、B)多孔質フリットをバレルに入れる。(C、D)マグネシウムシリカゲルをバレルに充填します。(E)吸着剤を梱包し、上部多孔質フリットをバレルに挿入します。(F)パスツールピペットの上に直径11.5mmのガラス繊維円を置きます。(G,H)プラスチックまたは木製の棒で円の中心をパスツールピペットバレルの底まで押し下げ、ガラス繊維をしっかりと圧縮します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. この時点で、図3F-Hに示すように、同じ数のカスタムメイドフィルターを準備します。
5. アフラトキシン分析では、上清(ステップ2.2で説明して得られたもの)を最大0.5 mLアリコートまで正確に測定し、カスタムパックされたミニカラムに移し、抽出物を重力によって4 mLガラスバイアルに排出します。1.0 mL のメタノール-水(90:10、v/v)混合物をカラムに移し、重力によって不純物を同じ 4 mL バイアルに洗い流します(図 4A)。

図4:種子抽出物の精製とUPLC分析の準備。 (A)パックされたカラムを備えたラック。 (B)クリーンアップカラムから溶出した精製抽出物を含む6つの4mLバイアルから_N2 ガスで溶媒を蒸発させます。(C)4 mLバイアルに注入溶媒(MeOH-H₂O 9:1、v / v)を添加する前後に、氷を入れた発泡容器(1および2)内でバイアルとフィルターを氷点下の温度にします。(D)4 mLバイアルから冷却した抽出物を400 μLオートサンプラーバイアルにろ過します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 組み合わせた溶出液を廃棄します。カラムから重力によりアフラトキシン画分を、1.2 mL アセトン-アセトニトリル-水-88% ギ酸(65:31:3.5:0.5、v/v)混合物(図 4A)を含む清浄な 4 mL ガラスバイアルに溶出します。
7. あるいは、2.0 mL のアセトニトリル-水-88% ギ酸(96:3.5:0.5、v/v)混合物でカラムからアフラトキシンを溶出し、溶出液のアリコートを最大 2 μL まで超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)システムに直接注入します(溶媒を N₂ で蒸発させません)。
   注:この場合、アフラトキシンの定量限界は最大10倍下限となることが予想されます。ほとんどの場合、チャレンジされた種子のアフラトキシン濃度が高いことが多いため、このような感度の低下は許容されます。
8. バイアルから溶媒を、45°Cの加熱ブロック内でN₂ の流れで取り出します。 バイアルにキャップをし、砕いた氷を入れた容器に30〜45秒間入れて、次のステップで追加する溶媒の蒸発を最小限に抑えます。カスタムメイドのフィルターを使い捨ての試験管に入れ、ろ過時の溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、チューブを別の容器の氷に挿入します(図4B、C)。
9. 溶媒の蒸発後、乾燥残渣を正確に測定した0.25〜1.0 mLのメタノール-水混合物(90:10、v / v)に溶解し、渦巻き1〜2秒間加熱します。精製した抽出物を入れたバイアルをUPLCオートサンプラーに入れ、0.1〜3.0 μLをUPLCシステムに注入します(図5A、B)。
   注意: ボルテックス後の溶液に浮遊粒子が含まれている疑いがある場合は、冷却されたフィルターで溶液をろ過します(図4D)。

図5:精製抽出物のUPLC分析のプロセスと結果 (A)精製サンプル抽出物の入ったラックをUPLCオートサンプラーにセット。(B)機器分析の実施、データの取得、および結果の解釈。(C)4つの主要なアフラトキシンのUPLC。関心のある主要なピークであるアフラトキシン B₁ と B₂ は、それぞれ 0.04 ng と 0.004 ng を表します。(D)アフラトキシンB₁ およびB₂のUPLC。ピーク 2 は、2 pg レベルのアフラトキシン B₁ を表します(8 μL フローセルを使用)。(E)野生の アラキス 種を含む地元のピーナッツ畑から収穫された種子の精製抽出物のUPLC。(F)塩基性酸化アルミニウムミニカラムで精製したチャレンジドピーナッツ種子の抽出物のUPLC。(G)Florisilカラムで精製したチャレンジドピーナッツ種子の抽出物のUPLC。青色のクロマトグラムは、1 mL のメタノール-水(90:10 v/v)混合物でカラムから洗浄された不純物を示しています。黒色のクロマトグラムは、アフラトキシン M₁ と B₁ のピークを示しています。アフラトキシンB₁ のレベルは48 ng/gである。略語:IPD = 3'-イソペンタジエニル-3,5,4'-トリヒドロキシスチルベン。注:種子抽出物中のすべてのスチルベノイドは トランス配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 

10. フィトアレキシン分析では、各ビーズバイアルから200 μLの上清を上記のパスツールピペットフィルターに移します。圧縮窒素タンクからのN₂ ガスを使用して、400 μL UPLCオートサンプラーバイアルへのろ過を促進し、PTFEセプタム(図4D)のキャップでバイアルをキャップします。

3. アフラトキシン分析

1. 種子抽出物中のアフラトキシンの分離には、オートサンプラー、クオータナリーポンプ、蛍光検出器、UPLC BEH C18 3.0 mm x 100 mm、1.7 μm カラムとマッチングプレカラム、および標準ニット PTFE コイル内径 0.25 を元の長さの 25% にカットしたポストカラム光化学反応器(PHRED)を備えた UPLC システムを使用します。
   注:著者らが使用した UPLC 装置および関連装置は、 資料表に記載されています。
2. 初期条件、62.7% A、24% B、13.3% C、3.75 分で 30% A、45% B、25% C に直線的に変化し、3.751 分で 0% A、64.4% B、35.6% C に変化し、3.751 分で 0% A、64.4% B、35.6% C に変化し、アイソクラティックを 3.249 分間保持し、その後 0.01 分で初期条件に変更し、次の注入前にアイソクラティックを 2.499 分間保持しました。流速を 0.45 mL/min、実行時間を 9.5 分に設定します。システムカラムヒーター内でカラムを40°Cに保ちます。アフラトキシン B₁、B₂、G₁、G₂、M₁ の定量には、それぞれ 362 nm と 440 nm を励起波長と発光波長として使用します。主要なアフラトキシンの構造を 図6Aに示します。
   注:実験条件下では、アフラトキシンB₁ およびB₂ のみが A. flavus NRRL 3357によって産生されると予想されます。 A. parasiticus 株を種子挑戦に用いる場合、アフラトキシンB₁、B₂、G₁、G₂ の産生が予想されます。
3. アフラトキシンの濃度は、ソフトウェアのユーザーマニュアルに記載されているように、対応する真正標準試料のピーク面積(検量線)を参照して測定します。
   注:UPLCの手順では、蛍光検出器の高感度設定でベースラインノイズが現れるため、アフラトキシンの検出限界(LOD)および定量限界(LOQ)は、広く受け入れられているシグナル対ノイズ比であるLODが3:1、LOQが10:1という広く受け入れられているS/N比を使用して評価されます。セクション 2 と 3 で説明するピーナッツ種子分析のルーチン実験セットアップでは、アフラトキシン G₁ と B₁ の定量限界は、アフラトキシン G₂ と B₂ でそれぞれ 0.8 ng/g と 0.08 ng/g 以下になると予想されます。

4. スチルベノイドフィトアレキシン分析

1. スチルベノイドの分離には、水(A)、メタノール(B)、88% ギ酸(C)を次のグラジエントで使用します:初期条件、53% A、42% B、5% C、2.0 分で 35% A、60% B、5% C に直線的に変化、4 分間アイソクラティックに保持、0% A、95% B、5% C に 0.5 分間、アイソクラティックに 2.5 分間保持、 その後、0.1分で初期条件に変更し、次の注射の前に2.9分間アイソクラティックを保持しました。流速を 0.5 mL/分、実行時間を 12.0 分に設定します。
2. スチルベノイドの濃度は、対応する真正標準試料のピーク面積(検量線)および/またはソフトウェアのユーザーマニュアルに記載されている公表されているモル吸光係数を参照して決定します。主要なスチルベン由来フィトアレキシンの構造を 図6Bに示します。
   注:フィトアレキシンの分離は、同じシステムを使用して行われますが、蛍光検出器とPHREDリアクターはありません。代わりに、ダイオードアレイ検出器を使用して、ピーナッツスチルベノイドの検出と定量を行います。主要なスチルベノイド植物性アレキシンの定量限界(LOQ)は、スチルベノイド濃度が同じ抽出物中のアフラトキシンの濃度を数桁上回るため、実用的な意味を持ちません。3日間のインキュベーション後、スチルベノイドは確実に定量されます。

結果

開発された種子中のアフラトキシン定量法は、野生ピーナッツ種のアフラトキシン蓄積に対する耐性を評価する全手順の中核をなすものです。カスタムパックのミニカラムとフィルターは、大量の溶媒、高価で不要な0.22または0.45 μmの市販フィルター、およびポンピング装置がないため、大幅な節約が可能になり、全体的な手順が簡素化されます。アフラトキシン分析の方法は、 表1に示すように、粉砕種子からのアフラトキシンの試験範囲内で高い回収率、精度、および精度を提供します。高度に汚染されたサンプルは、線形試験値に希釈されました。 図 5C は、4 つの主要なアフラトキシン(B₁、B₂、G₁、G₂ )を 5 分間の溶出時間内でベースライン分離した結果を示していますが、ピーナッツ種子の真菌への挑戦が手順の限界段階であり、UPLC 分析ではないため、これは許容範囲内です。

提案分析法は、アフラトキシンB₁の定量限界が2 pgと十分な感度を示します(図5D)。抽出物の純度が高いため、野生のアラキス種が生息する畑から採取された種子の精製抽出物のUPLC(図5E)から見られるように、アフラトキシンの明確な定量が可能になります。以前に発表されたミニコラムメソッド²⁹は、提案された方法(図5G)と比較して、真菌に挑戦されたピーナッツ種子(図5F)に対して満足のいく純度を達成することができません。図5Fから、アフラトキシンB₂、G₁、およびG₂は、高濃度の干渉不純物の存在により確実に検出および定量できないことは明らかであり、その多くはアフラトキシンの後に溶出されるスチルベノイドフィトアレキシンおよび真菌代謝物です。対照的に、Figure 5G は、マグネシウムシリカゲルカラムがアフラトキシン画分から不純物を除去する高い効率を示しています。青色のクロマトグラムは、1 mL のメタノール-水(90:10)混合物でカラムから洗浄された干渉不純物を示します。黒色のクロマトグラムは、アフラトキシン M₁ と B₁ の目立たないピークを示しています。このクロマトグラムは、問題のある野生種の種子の抽出物を表しています。アフラトキシン_B1のレベルは48 ng / gです。

ピーナッツフィトアレキシンの定量は、同じ種子中のアフラトキシンの分析に貴重な追加機能であり、アフラトキシンは畑からの天然種子または真菌に感染した種子である可能性があります。 図 5H は、チャレンジシード由来のピーナッツ防御スチルベノイドの典型的なクロマトグラムを示しています。化合物の分離は、アフラトキシン分析に使用されるのと同じ分析カラムを使用して行われます。カラムと選択されたクロマトグラフィー条件により、ピークの十分な分離が得られ、スチルベノイドの信頼性の高い定量が可能になります。チャレンジされた種子におけるアフラトキシン-フィトアレキシンの関係の評価は、このプレゼンテーションの範囲外であり、この方法は、著者の研究室で数年前から使用されており、有用であることが証明されている潜在的な研究ツールとしてここで提案されています。

図6: 主要アフラトキシンおよびスチルベン由来ピーナッツフィトアレキシンの構造 (A) 主要アフラトキシンの構造: 1, B₁; 2、B₂; 3、G₁; 4、G_の2。(B) 主要なスチルベン由来のピーナッツフィトアレキシンの構造: 6、レスベラトロール; 7、アラキジン-1; 8、アラキジン-2; 9、アラキジン-3; 10、IPD(3'-イソペンタジエニル-3,5,4'-トリヒドロキシスチルベン); 11、SB-1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

スパイクレベルA (ng/g)	アフラトキシン
	イ1	B2 さん	Gの1	G2
50	85.87 (0.97)	82.33 (0.67)	86.63 (2.89)	84.01 (0.86)
5	91.43 (2.76)	87.32 (0.47)	88.08 (2.08)	87.73 (0.77)
1	81.21 (3.16)	85.33 (1.98)	81.76 (4.66)	88.46 (3.24)

表1:Florisilカラムと1.2 mLのアフラトキシンフラクション溶出混合物を使用したピーナッツ種子からのアフラトキシンの回収率。[平均 (SD), %; n = 5]。ジョージア06Gピーナッツ品種のアフラトキシンフリー地上サンプル(50g)を、アフラトキシンストック溶液を含むマイクロシリンジの助けを借りて50、5、または1 ng / gレベルで均一にスパイクし、室温で16時間放置^{しました。} アフラトキシンB₂およびG₂の場合、0.33の乗算係数を使用する必要があります。

ディスカッション

私たちの以前の経験²⁸に基づいて、私たちは、アスペルギルス菌に耐性のある種を特定し、この日和見菌に対する遺伝的耐性の新たな供給源を決定し特徴付けるために、野生のアラキス生殖形質コレクションの探索に適した、シンプルで安価で環境に優しい化学的手順を開発しました。この分析法は、固相抽出(SPE)技術による種子抽出物の精製と超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)によるアフラトキシン定量に基づいており、十分に高い回収率、精度、および精度を特徴としています。提案された「フロリジル」法は、アフラトキシンを強力かつ選択的に保持するフロリジル(マグネシウムシリカゲル)のユニークな特性に基づくシングルミニカラムクリーンアップ手順の修正版です²⁸。元の方法と同様に、シードサンプルはMeOH-H₂O混合物で抽出されましたが、公表された80:20(v / v)と比較して90:10(v / v)の比率で抽出されました。この変更により、クリーンアップカラムを通る溶媒の流速は、同じアフラトキシン回収率で最大 2.5 倍に増加しました。この90:10(v / v)メタノール-水混合物は、1 gの基質中の5〜50 ngのアフラトキシン濃度に相当するスパイクレベルで抽出溶媒に添加したアフラトキシンB₁、B₂、G₁、およびG₂標準をほぼ100%回収率で提供し、スパイクしたピーナッツ種子サンプルから十分に高い回収率を提供しました(表1)。

アフラトキシンは、大量のアセトン³⁰、アセトン-メタノール^31,32、およびアセトン-水混合物33,34,35,36によってのみフロリジル吸着剤から溶出できることが示されています。本研究の過程で、酸性化アセトニトリルは、フロリジルからアフラトキシンを溶出する能力において、アセトンと同様に振る舞うことを発見しました。私たちの知る限り、アセトニトリルのこの特性は文献で報告されていません。.この特性の発見により、精製された抽出物を溶媒蒸発ステップを省略してUPLCシステムに直接注入できるようになり、調製時間が大幅に短縮されます。アセトニトリルをアセトン(アセトン-アセトニトリル-水-88% ギ酸 (65:31:3.5:0.5, v/v)) と混合した場合でも、精製された溶出液から水をスムーズかつ完全かつ迅速に除去し、溶媒の蒸発時間を大幅に短縮しました。アセトニトリルの存在により、Florisil カラムから不純物を効果的に除去するために、単一の溶媒であるメタノール-水(90:10、v/v)混合物を使用できる可能性があり、公表されている方法では、メタノールとクロロホルム-メタノール混合物の 2 つの追加の洗浄溶媒が必要でした。²⁸名

アフラトキシンの溶出に 1.2 mL を使用した場合、アフラトキシン B₁ の標準回収率は平均して ~98% でした。フロリシル 50 mg の量は、1.2 mL の溶出溶媒がミニカラムをバレルの上部まで満たし、同時に十分な回収が得られるように選択しました(表 1)。このアプローチにより、カラムバレルを一度充填するだけで済むため、クリーンアップ手順が迅速化されます。このプロジェクトの初期段階では、吸着剤の層が3 mmしかない小さなカラムに、粒子サイズが比較的大きい100〜200メッシュの市販のFlorisil画分が適切かどうかは明らかではありませんでした。したがって、米国標準試験ふるい120-140、140-170、170-200、200-270、270-400、および>400メッシュを使用して、市販の100-200メッシュ製品から得られたさまざまなFlorisil画分を調査しました。これらすべての画分は、再現性があり、ほぼ一致する結果が得られ、満足のいく回収率が得られました。粒子径が小さい画分では、UV光下でのカラム内のアフラトキシンバンドが狭くなったことが示されましたが、これらの画分は市販の100〜200メッシュ製品よりも優れているわけではありませんでした。さらに、100-200メッシュの画分は、全手順で最短の溶出時間(8-12分)を示しました。

グラジエント UPLC 溶媒送液により、アフラトキシンの十分な分離と、カラムからの非極性不純物の完全な除去が可能になりました(図 5G)。このアプローチにより、完璧なカラム操作と、数百のサンプルの分析結果の再現性が向上しました。Florisilカラムから溶出したアフラトキシンの同一性は、前述のように確認されました。²⁸ ここで使用した直径 3 mm の分析 UPLC カラムは、同じケミストリーの直径 2.1 mm のカラムと比較して、アフラトキシン B₁、B₂、G₁、G₂ の高濃度で高い選択性と信頼性を示しました。さらに、3 mm カラムの寿命 (1,200 回以上) は、2.1 mm カラム (最大 800 回) よりも大幅に長かった。3 mm カラムでは移動相の割合が 40% 高かったにもかかわらず、この欠点は上記のカラムの利点を上回っていました。

フロリジルミニカラムは、 アスペルギルス 代謝物で重度に汚染されたピーナッツ種子の抽出物の精製に効果的でした(図5G)。このような種子には、真菌の侵入に応答して種子によって生成されるスチルベノイド植物アレキシンも高レベルで含まれていました。これらの不純物はすべて、種子中のアフラトキシン濃度を最大10⁶倍²²まで超える可能性があるため、これらの種子はアフラトキシン分析の難題となっています。 図 5G は、アフラトキシン保持時間内にクロマトグラムに干渉ピークがないことを示しており、これにより、テストしたすべてのレベルでアフラトキシンの検出と定量が損なわれることはありませんでした(表 1)。 表1に見られるように、この分析法の正確度と精度は、アフラトキシン検出の最も重要な範囲でもある1.0〜50.0 ng/gの試験範囲内で十分に高かった。さまざまな野生ピーナッツ遺伝子型の異なるレベルでの回収率は均一であり、5つの異なる抽出の標準偏差は基本的に低かった。

この分析法は、0 から極めて高いレベル (総アフラトキシン 10,000 ng/g 以上) まで自然に汚染されたピーナッツ、綿花、トウモロコシ、および米の種子でも試験されました。トウモロコシ、綿実、イネからのアフラトキシンB₁、B₂、G₁、G₂ の5 ng/gレベルでの回収率は、それぞれ76.1%から93.7%、77.1%から86.6%、90.5%から96.2%と幅が広がった。米からのアフラトキシンの最も高い回収率は、溶離液の「純度」、つまり実質的に不純物の欠如を伴いました。さらに、イネは、平均して19 mg /種子を試験した最小の単一物体を表しました。

Florisil カラムを使用した 1 つのピーナッツ種子(殻剥き、秤量、抽出、遠心分離、精製を含む)の合計調製時間は 20 分を超えませんでした。Florisilミニコラムのコストは、市販のクリーンアップカラムのコストよりも>10倍低くなっています。追加の節約は、公開された手順と比較して、吸着剤、溶媒、および窒素ガスの量が少ないことから得られます²⁸。ミニカラムは、ポンピング装置や真空装置を必要とせず、保存期間は無期限です。

アフラトキシンに対する抵抗性について植物の生殖形質を調査することは、マイコトキシンの蓄積が正規分布に従わないため、非常に困難です^37,38。この現象を克服するためには、単一種子中の多数のアフラトキシン分析が必要です。アフラトキシン含有量に加えて、定量的なフィトアレキシン組成に関する情報は、単一の種子(図1A)から取得でき、特定の植物(図1E)まで追跡できる大量の情報に照らして非常に価値があります。この方法は、在来種、高度な育種系統、エリートピーナッツ品種など、何百ものアクセッションのスクリーニングに使用されています。この方法は、ピーナッツの育種前育種および育種研究プログラムでの使用が推奨されており、真菌耐性のピーナッツ遺伝子の特性評価に役立つ可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトン、Optima Fisher	Scientific	A929-4
アセトニトリル、Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5 mm Van-Guard プレカラム	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100 mm カラム	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100 mm カラム	Waters Corporation
アフラトキシン B1、B2、G1、および G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	市販のバイアルの内容物を 5 mL のメタノールに溶解して、5 & micro を得ます。アフラトキシンB1およびG1および1.5 µのg / mL;B2およびG2用g / mL
アフラトキシンB1(1mg)	シグマ-アルドリッチ	A6636-1MG
アフラトキシンB2(1mg)	シグマアルドリッチ	A9887-1MG
アフラトキシンG1(1mg)	シグマアルドリッチ	A0138-1MG
アフラトキシンG2(1mg)	グマアルドリッチ	A0263-1MG
アフラトキシンM1(10 µg)	Sigma-Aldrich	CRM46319
寒天、粒状 (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
酸化アルミナ 塩基性 (60-325 メッシュ)	Fisher Scientific	A941-500
基礎培地	村重およびスクーグ	M5519
ビーズラプター 24	オムニインターナショナル	19-042E
ビーカー (1000mL)	コーニング (パイレックス)	10001L
ビーカー (250mL)	コーニング (パイレックス)	1000250
ビーカー (400mL)	コーニング (パイレックス)	1000400
ビーカー (600mL)	コーニング (パイレックス)	1000600
ブレード・メス	フェザー	#10
遠心分離機(LSEコンパクト)	コーニング	モデル:6755
分離機、マイクロ	コーニング	モデル:6770
セラミックビーズ(2.8 mm)	Omni International	19-646
ビーズ(6.5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7シリーズソフトウェア	Thermo Scientific
ドリルビット	京セラ	07896	1.6 mm
ドリル	Kyocera	07357	2.0 mm
ドリル	Kyocera	07985	2.34 mm
エタノール (200 プルーフ)	Decon Labs	2805M
エバポレーター、窒素	organimation	11106	6 ポジション
Excel、Microsoft		Microsoft Office 365
濾紙 (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
濾紙カッター ステンレス (内径 11.5mm)	不明
濾紙・ガラス繊維	Cytiva Whatman	934-AH
フラスコ (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
鉗子	Integra Lifescience (Miltex)	PM-0300
ギ酸 (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
冷凍庫 (-80oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Funnel (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medium)	Caisson Labs	G024
グラスロッド(カスタム)	オーダーメイド
グラスウール	コーニング(パイレックス)	3950
メス・ハンドル	フェザー	#7
血球計算盤	ハウサー・サイエンティフィ	3100
過酸化水素	フィッシャー・サイエンティフィック	H325-4	30%、認定 ACS
アイスバケツ、丸型 蓋付き	コーニング	432122
インキュベーター	パーシバル	136VL
キムテック サイエンス ブランド キムワイプ	キムテック	34120	8.2インチ x4.39インチ
Kimtech SCIENCEブランド Kimwipes	Kimtech	34256	16.4インチ x 14.43インチ
白衣	B113660SBXL		メタ
ノール、オプティマ	フィッシャーサイエンティフィック	A454-4
ミニコラムラック(カスタム)	カスタムメイド
ミキサー、タッチ(マキシミックスII)	サーモリン	37600(モデル231)
ニトリル手袋	Microflex	XC310M
窒素ガス、圧縮(超高純度)	Jones 溶接
ペーパータオル	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pHメーター	フィッシャーサイエンティフィック (アキュメット)	13-636-AB15
pH/ATC電極	フィッシャーサイエンティフィック (アキュメット)	13-620-111
PhCR 光化学反応器	Waters (Vicam)	600001222
Pipette, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9インチ
ピペッター (1 mL) (参考文献 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μL) (参考)	Eppendorf	022470051D
ピペットチップ: 10 μL、200 μL、1 mL	Eppendorf	F144054M
ピペッター(200 & micro;L)(エルゴフィット)	フィッシャーサイエンティフィ	12-146-679
プレート、ペトリ (100x15mm)	フィッシャーサイエンティフィ	FB0875713
ポテトデキストロース寒天 (500g)	ベクトンディキンソン
強化ビーズチューブ (2mL)	オムニインターナショナル	19-660
強化ビーズチューブ (7mL)	オムニインターナショナル	19-651
リピペット、ディスペンス III (10mL)	ブランドテック	4701141
レスベラトロール	シグマ アルドリッチ	R5010-100MG
スコップ (カスタム)	カスタムメイド
スクリューキャップジャー(250mL)	コーニング(パイレックス)	1395250
シリカゲル球状(200-400メッシュ)	Supelco	97727-U	100 g
水酸化ナトリウム	Fisher Scientific	S318-500
SPE 抽出物 クリーン 1.5 mL ポリプロピレン カラム	アメリカのクロモグラフィー供給	SP-5122382
SPE抽出物クリーンPPフリット(1.5 mLミニカラム用)	アメリカのクロモグラフィー供給	SP-3119414
分光光度計、UV可視	フィッシャーサイエンティフィック	14-385-351(Genesys 50)
試験管	コーニング(パイレックス)	982516X	16x125mm
試験管(使い捨て)(16x125mm)	フィッシャーScientific	14-961-31
試験管(使い捨て)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD 検出器 (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense 検出器 (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish クオータナリポンプ F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish スプリットサンプラー FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (ポリソルベート 20) (酵素グレード)	Fisher Scientific	BP337-500
バイアルキャップ (4 mL)	Fisher Scientific	C4015-75A
バイアルキャップ (オートサンプラー)	Fisher Scientific	C4010-60A
バイアル & キャップ (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
バイアル、ガラス (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
バイアル、ポリプロピレン (オートサンプラー) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
水、オプティマ	フィッシャーサイエンティフィック	W6-4